Method Article

Transmissie-elektronenmicroscopie als visualisatietechniek voor analyse van circadiane synaptische plasticiteit in de cortex van de muizenloop

DOI:

10.3791/68385

⸱

August 19th, 2025

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Imaging, Institute of Zoology and Biomedical Research, Faculty of Biology, Jagiellonian University, 2Department of Histology, Jagiellonian University Medical College

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het gepresenteerde protocol beschrijft het gebruik van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om circadiane veranderingen in de cortex van de muizentrommel te kwantificeren, voornamelijk gericht op het aantal synapsen en de morfologie van de dendritische wervelkolom.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderzoeken van circadiane synaptische plasticiteit vereist het huisvesten van muizen onder verschillende lichtomstandigheden (licht/donkercyclus, LD 12:12 en constante duisternis, DD), toegang bieden tot loopwielen en deze opofferen op vier gedefinieerde tijdstippen binnen 24 uur - aan het begin en midden van de dag / subjectieve dag en aan het begin en midden van de nacht / subjectieve nacht. Hersenen worden dan goed gefixeerd voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). De vatcortex, met zijn precieze somatotopische organisatie, biedt een ideaal model voor een dergelijke analyse. Om het vereiste hersengebied te verkrijgen, worden de hersenen tangentieel doorgesneden met een vibratoom en vervolgens worden secties met de vatcortex geselecteerd en ingebed in Polybed-hars. Uit de voorbereide blokken met de geselecteerde vaten worden opeenvolgende ultradunne secties gesneden. Synaptische dichtheid, exciterend en remmend, wordt geanalyseerd aan de hand van elektronenmicrofoto's met behulp van de stereologische dissectormethode. Daarnaast worden TEM-beelden gebruikt voor 3D-reconstructies van dendritische stekels. Veranderingen in de vorm van dendritische stekels duiden op hermodellering van neuronen gedurende de dag. Het aantal prikkelende synapsen piekt tijdens de slaap (overdag) bij muizen, terwijl remmende synapsen pieken tijdens hun activiteitsfase (midden in de nacht).

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circadiane ritmes worden gegenereerd door circadiane klokken in bijna alle processen in een organisme. Bij dieren en mensen zijn ze gedetecteerd op moleculair, cellulair en organismeniveau, evenals in hun gedrag. Het circadiane systeem van een organisme bestaat uit de belangrijkste circadiane klok (pacemaker) en perifere klokken. Alle circadiane klokken genereren circadiane oscillaties door de cyclische expressie van klokgenen, die worden gecontroleerd door hun eiwitten. Het moleculaire mechanisme van de klok genereert circadiane ritmes met een periode van ~1 dag (langer of korter dan 24 uur), maar onder dag/nacht-omstandigheden wordt de periode van endogene ritmes gesynchroniseerd met 24 uur. Er zijn veel circadiane ritmes gedetecteerd in de fysiologie van het zenuwstelsel van ongewervelde dieren en gewervelde dieren; Sommige onderzoeken hebben echter aangetoond dat ze ook aanwezig zijn in synaptische en neuronale plasticiteit, dat wil zeggen veranderingen in het aantal en de structuur van synapsen en dendrieten 1,2,3,4.

De somatosensorische cortex van de muis biedt een uitstekende plek voor het bestuderen van synaptische plasticiteit gedurende de dag vanwege de goed gedefinieerde organisatie en directe link met de locomotorische activiteit van dieren 5,6,7,8,9. In laag IV van de somatosensorische cortex zijn er verschillende neurale structuren (vaten) die zelfs in een onbevlekt brein zeer merkbaar zijn10,11. Hun opstelling weerspiegelt de morfologie en organisatie van de snorharen op de snuit van het dier, waardoor sensorische stimuli nauwkeurig in kaart kunnen worden gebracht. De grote vaten zijn georganiseerd in vijf regelmatige rijen, elk met tussen de vier en zeven vaten. De rijen vaten die overeenkomen met grote snorharen zijn gemarkeerd met hoofdletters van A tot E en vertegenwoordigen de snorharen die vanaf het ooggebied langs de snuit naar beneden zijn gerangschikt. Elk vat bestaat uit twee hoofdgebieden: de holte, het centrale deel gevuld met neuropil, en de wand die de zijkant wordt genoemd, die wordt gedomineerd door de lichamen van stellaatcellen. De vaten zijn van elkaar gescheiden door gebieden met een lagere celdichtheid, septa genaamd. Elk vat ontvangt impulsen van een specifieke snorhaar die zich aan de contralaterale kant van de snuit van het dier bevindt10,12.

De indeling in specifieke vaten, gerangschikt in regelmatige rijen, maakt een snelle en gemakkelijke identificatie van het geselecteerde gebied mogelijk10,13. De selectie van vaten uit rij B voor analyse van circadiane veranderingen is gebaseerd op studies van activiteitsafhankelijke plasticiteit 14,15,16,17. Rij B wordt gekenmerkt door goed gedefinieerde somatotopische grenzen en bevat slechts vier verschillende grote vaten, wat de locatie in monsters vereenvoudigt. Door zijn centrale positie is de neuronale activiteit van rij B gecorreleerd met natuurlijk muisgedrag, zoals milieu-exploratie en locomotorische activiteit. Voor het tellen van synapsen op dendritische stekels en schachten is het belangrijk om de centrale delen van de vaten te selecteren, waar cellichamen schaars zijn 12,15,18.

Immunohistochemie in combinatie met confocale microscopie beeldvorming is een techniek die een cruciale rol heeft gespeeld bij het ophelderen van de belangrijkste mechanismen van synaptische plasticiteit bij muizen. Hoewel het gebruik van confocale microscopie beelden met een hoge resolutie oplevert met verminderde achtergrondfluorescentie en verbeterde helderheid van de cellulaire structuur, lijdt het aan fotobleken en vereist het een complexe monstervoorbereiding, die de toestand van biologische weefsels kan veranderen. De afhankelijkheid van fluorescerende markers kan de soorten eiwitten beperken die tegelijkertijd kunnen worden bestudeerd vanwege hun overlapping. Confocale immunofluorescentiemicroscopie biedt een middel om specifieke eiwitten, hun expressieniveaus en lokalisatie geassocieerd met synaptische activiteit te labelen door antilichamen te gebruiken om doelantigenen in vaste weefselsecties te detecteren. Hoewel deze methode specificiteit en flexibiliteit biedt om verschillende eiwitten te bestuderen die betrokken zijn bij neurotransmissie, wordt deze beperkt door het onvermogen om real-time gegevens over dynamische processen te verstrekken vanwege de betrokken fixatiestap. De inconsistentie in de antilichaambinding kan ook leiden tot onbetrouwbare resultaten 19,20,21.

Het gebruik van elektronenmicroscopie in plaats van immunofluorescentiemethoden met lichtmicroscopie zorgt voor een aanzienlijk hogere resolutie en grotere precisie bij zowel lokalisatieselectie als het onderscheid van neurale structuren. Seriële transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) -secties helpen om de synaptische structuur op ultrastructureel niveau te visualiseren en hebben het voordeel dat ze worden gebruikt voor het bestuderen van synapsvorming of eliminatie. TEM stelt onderzoekers in staat om de fysische eigenschappen van synapsen en veranderingen in de dichtheid en structuur te analyseren die de plasticiteit van synapsen worden genoemd. Hoewel de voorbereiding en beeldvorming van monsters arbeidsintensief zijn, biedt TEM een gedetailleerder inzicht in veranderingen die optreden tijdens het leren, geheugenvorming en verwerking van sensorische informatie, en tijdens de dag, het jaar en de leeftijd van het dier.

Onze methode heeft tot doel de circadiane dynamiek van synaptische dichtheid en morfologie te onderzoeken door gebruik te maken van een benadering op basis van minimaal vier tijdstippen in combinatie met de stereologische dissectormethode op basis van seriële TEM-beelden. De stereologische dissectormethode maakt een betrouwbare schatting van het aantal synapsen mogelijk, zelfs bij gebruik van slechts enkele ultradunne seriële secties 22,23,24,25,26. De goed gedefinieerde somatotopische organisatie van de barrelcortex zorgt voor een nauwkeurige anatomische selectie van studielocaties, terwijl seriële TEM differentiatie van synapstypes (exciterend en remmend) en hun locaties (op dendritische stekels en schachten) mogelijk maakt. Deze methode biedt een waardevol hulpmiddel voor onderzoekers die dag- en circadiane neuroplasticiteit onderzoeken, waardoor kan worden onderzocht hoe omgevings- en interne factoren de synaptische dynamiek beïnvloeden. De afzonderlijke componenten van onze methode maken het mogelijk om deze toe te passen voor de analyse van neuroplasticiteitsveranderingen in een veel breder scala aan onderzoeken, niet noodzakelijkerwijs beperkt tot circadiaan-gerelateerde veranderingen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures waarbij dieren betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de bevoegde institutionele ethische commissie en uitgevoerd in overeenstemming met Richtlijn 2010/63/EU van het Europees Parlement en de Raad betreffende de bescherming van dieren die voor wetenschappelijke doeleinden worden gebruikt, evenals met nationale regelgeving. Alles werd in het werk gesteld om dierenleed tot een minimum te beperken en het aantal gebruikte dieren te verminderen.

1. Preparaat van hersenweefsel

  1. Offer muizen op vier verschillende tijdstippen om de 6 uur gedurende een cyclus van 24 uur, zowel in licht/donker (LD 12:12) als in constante duisternis (DD) (Figuur 1). In LD 12:12 voorwaarden, verwijzen naar Zeitgeber Tijd (ZT), waarbij ZT0 overeenkomt met het begin van de lichtfase en ZT12 met het begin van de donkere fase. Verwijs in constante duisternis naar de circadiane tijd (CT), waarbij CT0 het begin van de subjectieve dag vertegenwoordigt en CT12 het begin van de subjectieve nacht.
    OPMERKING: De tijdstippen zijn ZT0/CT0 (begin van de dag, subjectieve dag), ZT6/CT6 (midden van de dag, subjectieve dag), ZT12/CT12 (begin van de nacht, subjectieve nacht) en ZT18/CT18 (midden in de nacht, subjectieve nacht).
  2. Prik en fixeer muizenhersenen met 2,5% glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4).
  3. Verwijder elk brein uit de schedel en laat het gedurende 24 uur bij 4 °C in een fixerende oplossing (2,5% glutaaraldehyde en 2% paraformaldehyde in 0,1 M fosfaatbuffer, pH 7,4) liggen.
  4. Om de hersenen voor te bereiden op secties, snijdt u het cerebellum af en verdeelt u de hersenen in twee hemisferen (Figuur 2A,B).
  5. Kies een halfrond (rechts of links) en oriënteer deze zo dat de secties tangentieel naar de barrelcortex worden gesneden. Monteer de geselecteerde halve bol op de vibratoomhouder en lijm deze stevig vast (Figuur 2C).
  6. Snijd secties met een dikte van 60 μm (vibratome-sectiesnelheid: 7.10 en de frequentie: 5.00) (Figuur 2D) en breng vervolgens secties over naar het mengsel van 0.1 M fosfaatbuffer en fixatieve oplossing (1:5-verhouding).
  7. Onderzoek secties onder een lichtmicroscoop met 4x vergroting en verzamel alleen die met de zichtbare barrel field-cortex voor de volgende stap (Figuur 2E). Gebruik de holle slede om ervoor te zorgen dat de sectie constant in vloeistof blijft.

2. Hersenfixatie en -sectie

  1. Gebruik een penseel en breng de tissues voorzichtig over in een klein glazen petrischaaltje. Spoel vervolgens de hersendelen 3 x 5 minuten in de 0,1 M cacodylaatbuffer (BC, pH 7,4).
  2. Fixeer secties in 1% Osmiumtetroxide (OsO4) in 0,1 M BC met 1,5% kaliumferricyanide en laat 1 uur bij +4 °C staan.
    OPMERKING: Bereid de OsO4-oplossing onmiddellijk voor gebruik voor, aangezien OsO4 onstabiel is en de activiteit na verloop van tijd afneemt.
  3. Post-fix secties in 1% OsO4 in 0,1 M BC oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Voer al deze stappen uit terwijl u beschermende handschoenen draagt en onder de zuurkast met goed werkende ventilatie, aangezien OsO4 zeer giftig is.
    Afval moet worden bewaard in een aparte fles met een strakke dop. Zorg ervoor dat het product niet in de afvoer terechtkomt.
  4. Spoel na fixatie de secties 2 x 5 minuten af in gedestilleerd water.
  5. Incubeer in de volgende stap hersensecties gedurende 40 minuten in de oplossing van 70% ethanol met 1% uranylacetaat. Gebruik na het mengen een spuit met een filter (25 mm) en giet langzaam 2 ml van de oplossing in elk petrischaaltje met de tissues.
  6. Droog weefsels in oplopende concentraties alcohol: 70%, 80% en 90% ethanol gedurende elk 5 minuten en 100% ethanol, elk 3 x 5 minuten.
    OPMERKING: Het is mogelijk om tissues 's nachts in 70% ethanol te laten staan bij +4 °C.
  7. Was tissues in propyleenoxide 2 x 10 min.
    OPMERKING: Propyleenoxide is een zeer bijtende chemische stof; Gebruik het met voorzichtigheid bij het dragen van beschermende handschoenen en het werken onder de zuurkast. Het gebruik van een glazen container (glazen petrischaaltje) is cruciaal voor deze stap.
    Propyleenoxide is een uiterst ontvlambare vloeistof en damp. Afval moet worden bewaard in een aparte, goed gesloten glazen container. Laat het product niet in de riolering terechtkomen; er bestaat explosiegevaar.
  8. Vervang propyleenoxide door een mengsel van Polybed-hars en propyleenoxide (verhouding 1:1). Giet ten minste 2 ml van de oplossing in elke petrischaal met de partjes, dek af met een deksel en incubeer gedurende 40 minuten.
  9. Veranker ten slotte hersensecties in het mengsel van Polybed-hars en propyleenoxide (verhouding 3:1). Gebruik minimaal 2 ml van het mengsel per petrischaaltje, dek het af en laat 1,5 uur staan.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de tissues volledig zijn ondergedompeld en zorg ervoor dat ze niet boven de vloeistof zweven.
  10. Snijd de Aclar-film in stukken die overeenkomen met de grootte van een glasplaatje. Breng met behulp van een plastic pipet een kleine hoeveelheid hars aan op de Aclar-film en breng de hersensecties met een penseel over van de petrischaal naar de hars. Veranker elk deel tussen twee Aclar-films en incubeer gedurende 48 uur in een oven van 65 °C om te polymeriseren.

3. Beeldvorming en doorsnede van de barrel cortex

  1. Fotografeer hersensecties met 2x objectiefvergroting met een lichtmicroscoop (Figuur 2F).
  2. Verzamel alle afbeeldingen en importeer ze in grafische software.
    1. Als u afbeeldingen wilt openen, klikt u op Bestand |Open en selecteer de afbeeldingen met Shift |Openen. De afbeeldingen worden in aparte vensters geopend.
    2. Begin met het stapelen van afbeeldingen uit de cortex (het kleinste stukje) en ga door totdat alle secties correct zijn uitgelijnd.
    3. Klik met de rechtermuisknop op Laag 1 |Dupliceer laag op elke afbeelding. Voer in het dialoogvenster het afbeeldingsnummer in als naam, kies één afbeelding als doelbestand en klik op OK. Herhaal deze stappen voor alle afbeeldingen en dupliceer ze in hetzelfde doelbestand.
    4. Lijn de afbeeldingen uit om het loopveld te reconstrueren en zorg voor de juiste anatomische orde. Gebruik de tool Verplaatsen om elke laag handmatig te positioneren en klik vervolgens op Bewerken |Transformeren |Draai of spiegelen om de oriëntatie indien nodig aan te passen. Als u de uitlijning wilt verfijnen, gebruikt u Bewerken | Transformeren | Vervorm en verplaats de hoeken van het beeld zodat ze onafhankelijk van elkaar overeenkomen met de anatomische structuren. Om de uitlijning te vergemakkelijken, stelt u de overvloeimodus van de bovenste laag in op Overlay in het deelvenster Lagen .
    5. Vergelijk anatomische oriëntatiepunten zoals loopcontouren en bloedvaten om de juiste positionering te garanderen. Om de stapel op te slaan, klikt u op Bestand |Opslaan als, geef het bestand een naam en kies de indeling (PSD of TIFF); klik vervolgens op OK.
  3. Bekijk de meerdere secties met het vatveld achtereenvolgens en identificeer zichtbare vaten in elke sectie.
  4. Schets handmatig elk zichtbaar vat op een extra gemeenschappelijke laag en zorg voor de reconstructie van het hele vatveld. Als u een extra laag wilt maken, klikt u op Laag |Nieuw |Laag, geef de laag een naam en klik op OK. Selecteer het penseel op de werkbalk en teken op de nieuwe laag handmatig elk zichtbaar staafje.
    1. Gebruik voor meer precisie de zoom en pas de penseelgrootte naar behoefte aan. Als u wilt in- en uitzoomen op de afbeelding, gebruikt u de zoomtool of drukt u op Ctrl + "+" / Ctrl + "-". Als u de penseelgrootte wilt wijzigen, klikt u met de rechtermuisknop op het canvas terwijl het penseel actief is en verplaatst u de schuifregelaar Grootte .
  5. Identificeer de geselecteerde loop op basis van deze reconstructie.
  6. Zoek het geselecteerde vat onder de lichtmicroscoop op basis van het patroon van het vatveld (vijf rijen, elk met vier tot zeven vaten) en de opstelling van bloedvaten die de locatie in het vatveld aangeven.
  7. Identificeer in elk gedeelte met een zichtbare vatcortex het geselecteerde vat onder een stereomicroscoop en knip het samen met het aangrenzende vat uit met behulp van een scheermesje.
  8. Verwijder het kleine stukje van het gedeelte, lijm het op een harsblok en leg het weg om te drogen. Knip later de overtollige hars rond het weefsel af.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u het stuk tissue plat op het oppervlak van de hars legt.
  9. Gebruik een ultramicrotoom en een diamantmes om ultradunne opeenvolgende secties (3-6 secties, 65 nm dik) te snijden (Figuur 3A) en verzamel op met vorm gecoate, single-slot nikkelroosters (2 x 0,75 mm).
  10. Eenmaal droog, contrasteer de monsters met 2% uranylacetaat gedurende 3 minuten en 0,03% loodcitraat gedurende 1,5 minuut.
    OPMERKING: Om contrast hiermee is het belangrijk om de roosters een paar keer te wassen en ze na elke stap volledig te laten drogen. Gebruik spuiten met filters voor uranylacetaat en loodcitraat.
  11. Maak opeenvolgende beelden vanuit de holte van de geselecteerde cilinder (bijvoorbeeld B2) onder een TEM (80 kV versnellende spanning bij vergrotingen van 4K of 8K, afhankelijk van het gebied en het volume dat nodig is voor de analyse.
    OPMERKING: Gewoonlijk wordt ten minste een totaal volume van 100 μm3 per dier geanalyseerd.

4. Analyse van het beeld

OPMERKING: Het maken en uitlijnen van stapels TEM-afbeeldingen kan op dezelfde manier worden gedaan met zowel gratis software (zoals GIMP) als commerciële software (bijv. Photoshop). Ook reconstructies kunnen op dezelfde manier worden uitgevoerd met behulp van zowel commerciële software (bijv. 3D Studio Max) als volledig gratis programma's, zoals Blender.

  1. Om de dichtheid van synapsen te schatten, stapelt u minimaal drie TEM-afbeeldingen in de grafische software (Afbeelding 6). Hoe groter het aantal seriële afbeeldingen, hoe hoger de nauwkeurigheid van de berekeningen.
    1. Als u afbeeldingen wilt openen, klikt u op Bestand |Open en selecteer de afbeeldingen met Shift |Geopend; De afbeeldingen worden in aparte vensters geopend.
    2. Klik voor elke afbeelding met de rechtermuisknop op Laag 1 |Dubbele laag. Voer in het dialoogvenster het afbeeldingsnummer in als naam, kies één afbeelding als bestemming en klik op OK. Herhaal dezelfde stappen voor alle afbeeldingen en dupliceer ze op dezelfde bestemming.
    3. Als u de stapel wilt opslaan, klikt u op Bestand |Opslaan als, geef het bestand een naam, kies de indeling (PSD of TIFF) en klik op OK.
  2. Als u TEM-afbeeldingen wilt uitlijnen, selecteert u de bovenste afbeeldingslaag en stelt u de overvloeimodus in op Overlay in het deelvenster Lagen . Gebruik Bewerken |Transformeren |Roteren of de tool Omdraaien om de afdrukstand aan te passen. Gebruik de tool Verplaatsen om structuren uit te lijnen.
    1. Gebruik voor nauwkeurigere aanpassingen Bewerken |Transformeren | Vervormen om de hoeken van de afbeelding onafhankelijk van elkaar te verplaatsen. Om de precisie te vergroten, houdt u Ctrl ingedrukt en sleept u afzonderlijke hoekpunten. Gebruik veranderingen in de grootte en vorm van mitochondriën en axonale myelinescheden tussen opeenvolgende TEM-afbeeldingen om de juiste volgorde van de afbeeldingen te verifiëren.
  3. Gebruik een dissectormethode voor het tellen van synapsen.
    1. Voeg een laag toe aan de EM-afbeeldingsstapel door te klikken op Laag |Nieuw |Laag |Oké. Zorg ervoor dat de nieuwe laag transparant is (zonder achtergrondopvulling).
    2. Als u het analysegebied wilt definiëren, klikt u op Laag |Nieuw |Laag |Oké; selecteer vervolgens de Rechthoekige tool, ga naar Laag |Laag Stijl |Lijn, stel de lijnkleur, dikte en positie (binnen aanbevolen) in, klik op OK en teken een rechthoek. Selecteer Vullen: 0%. Markeer alle synapsen in de TEM-afbeeldingen die twee aangrenzende geselecteerde randen van de rechthoek niet kruisen (bijvoorbeeld de rechter- en onderkant of de boven- en linkerkant).
    3. Voeg een nieuwe laag voor annotaties toe door te klikken op Laag |Nieuw |Laag |Oké. Gebruik het penseel om synapsen op de nieuwe laag te markeren. Gebruik de zoomtool en de handtool voor nauwkeurige markeringen.
    4. Kies een kleur om excitatoire synapsen te markeren en een andere voor remmende synapsen. Als u de kleur wilt wijzigen, klikt u op het vak voor de voorgrondkleur op de werkbalk, selecteert u een kleur in het venster Kleurkiezer en klikt u op OK.
  4. Als TEM-beelden grote structuren bevatten (bijv. gemyeliniseerde zenuwvezels, grote dendrieten of delen van het cellichaam), gebruik dan een raster met meerdere vierkanten. Dit maakt het mogelijk om pleinen uit te sluiten die volledig worden ingenomen door grote constructies.
    1. Voeg een nieuwe transparante laag toe door te klikken op Laag |Nieuw |Laag |Oké. Schakel de rasterweergave in door op Beeld |Tonen |Raster en schakel het uitlijnen naar raster in door op Beeld |Uitlijnen naar |Raster.
    2. Stel de rasterafstand in door op Bewerken |Voorkeuren |Gidsen, Raster & Plakjes. Selecteer het gereedschap Lijn , stel de modus in op Vorm of Pixels, stel de lijndikte in (bijv. 1 px) en teken verticale en horizontale lijnen langs het zichtbare raster om het hele afbeeldingsgebied te bestrijken.
  5. Definieer de secties "boven" en "onder" voor elke afbeeldingsstapel. Tel alleen synapsen die afwezig zijn in de laatste afbeelding, maar wel in de vorige afbeeldingen. Dit maakt een nauwkeurige identificatie van synapsen mogelijk zonder hun aantal te overschatten.
  6. Gebruik de schaal op de afbeelding en bereken het volume van de steekproef (stapel TEM-afbeeldingen). Meet het gebied waar de synapsen worden geteld en vermenigvuldig met het aantal TEM-afbeeldingen in de stapel en de dikte van de ultradunne secties.
  7. Deel het aantal synapsen door volume om de synapsdichtheid per volume-eenheid te bepalen.
  8. Gebruik alle TEM-beelden die een dendritische wervelkolom bevatten (meestal 10-12 opeenvolgende elektronenmicrofoto's) om een dendritische wervelkolom en de synapsen die deze vormt te reconstrueren.
    1. Open de afbeeldingsstapel in de grafische software. Selecteer het gereedschap Bijsnijden, markeer het gebied met de dendritische ruggengraat in de stapel en druk op Enter. Het geselecteerde gebied wordt bijgesneden in alle zichtbare lagen. Maak er slechts één tegelijk zichtbaar, verberg andere lagen met behulp van het oogpictogram in het lagenpaneel.
    2. Sla elke bijgesneden afbeelding afzonderlijk op door op Bestand |Opslaan als, geef het bestand een naam, kies een indeling (JPG aanbevolen) en klik op OK. Herhaal dit voor elke laag in de stapel.
      OPMERKING: Voordat u de afbeeldingen overbrengt naar een 3D-reconstructiesoftware, kunt u het beste eerst de elementen die worden gereconstrueerd met kleuren markeren.
    3. Voeg een nieuwe laag toe voor annotatie door op Laag | Nieuw |Laag | Oké.
    4. Stel de dekking van de laag in op 30-50% in het deelvenster Lagen .
    5. Selecteer het penseel , kies een andere kleur voor elke structuur (bijv. dendritische ruggengraat, synaps) en markeer de elementen. Werk alleen aan de nieuwe laag om de originele afbeelding te behouden. Als u klaar bent, voegt u de annotatielaag samen met de afbeelding, klikt u met de rechtermuisknop op de bovenste laag en voegt u Omlaag samen. Herhaal deze stappen voor elk TEM-beeld dat een dwarsdoorsnede van de dendritische wervelkolom bevat.
  9. Breng de TEM-beelden met zichtbare dwarsdoorsneden van de dendritische wervelkolom over naar 3D-reconstructiesoftware. Als u het standaardkubusobject wilt verwijderen, klikt u met de rechtermuisknop op het object en verwijdert u het. Als u het viewportperspectief wilt uitlijnen voordat u afbeeldingen uploadt, klikt u op Z op de navigatiegizmo of drukt u op Numpad 7. Als u afbeeldingen wilt uploaden, klikt u op Toevoegen |Afbeelding |Verwijs, selecteer de eerste afbeelding en dubbelklik erop om te bevestigen. Herhaal dit voor elke afbeelding en zorg ervoor dat het viewportperspectief overal consistent blijft.1
    OPMERKING: Om de weergave te draaien, houdt u de middelste muisknop ingedrukt en beweegt u de muis of gebruikt u de navigatiegadget. Als u de weergave wilt pannen, houdt u Shift + middelste muisknop ingedrukt, verplaatst u de muis of gebruikt u De weergave verplaatsen.
  10. Plaats de TEM-beelden op de juiste afstand, rekening houdend met de dikte van de ultradunne secties (Figuur 4A). Als u de laatste TEM-afbeelding langs de Z-as wilt plaatsen, klikt u op de afbeelding, klikt u op Objecteigenschappen (rechterzijbalk) en voert u de waarde in Locatie Z in. De afbeeldingen kunnen nu worden verdeeld over de eerste en de laatste afbeelding. Om ze te verspreiden, selecteert u alle afbeeldingen, drukt u op N om het N-paneel te openen en klikt u op het tabblad Bewerken (in het N-paneel) | Dist Z.
    OPMERKING: Voordat u aanpassingen maakt, lijnt u het viewportperspectief uit en klikt u op Z op de navigatiegizmo of drukt u op Numpad 7.
    De tool Verspreiden moet ingeschakeld zijn om de afbeeldingen te distribueren. Om het te activeren, ga je naar Bewerken | Voorkeuren | Haal extensies op, zoek naar "Distribute" en klik op Installeren. Eenmaal ingeschakeld, blijft de tool Verspreiden actief in verschillende sessies en hoeft deze niet opnieuw te worden geactiveerd, zolang dezelfde versie van het programma wordt gebruikt.
  11. Schets handmatig de vorm van de dendritische wervelkolom op elk beeld met behulp van een enkele curve per TEM-afbeelding (Figuur 4B,C).
    1. Zorg ervoor dat alleen de eerste TEM-afbeelding zichtbaar is. Verberg in de scèneverzameling alle andere objecten met behulp van het oogpictogram . Als u een basiscurve voor het overzicht wilt maken, klikt u op Toevoegen |Kromme |Cirkel. Verplaats het BézierCircle-object, houd G ingedrukt, beweeg de muis en klik om de wijzigingen te accepteren .
    2. Als u de grootte van het profiel van de dendritische wervelkolom wilt aanpassen, schaalt u het object, houdt u S ingedrukt, beweegt u de muis en klikt u erop. Ga naar het tabblad Modelleren met het BézierCircle-object geselecteerd. Lijn het viewportperspectief opnieuw uit en klik op Z op de navigatiegizmo of druk op Numpad 7.
    3. Als u de vorm van de curve wilt aanpassen, selecteert u een controlepunt, houdt u G ingedrukt, beweegt u de muis en klikt u erop.
    4. Als u de richting en sterkte van de handgrepen wilt aanpassen, selecteert u een greeppunt, drukt u op G om te verplaatsen of op S om te schalen en klikt u om te bevestigen. Herhaal dit voor elk punt.
    5. Als u een nieuw controlepunt wilt toevoegen, selecteert u twee bestaande controlepunten, houdt u Shift ingedrukt en klikt u op elk punt, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Onderverdelen. Wanneer de curve voldoende overeenkomt met de grens van het profiel van de dendritische wervelkolom, gaat u naar het tabblad Lay-out , klikt u met de rechtermuisknop op het BézierCircle-object en het Object dupliceren en klikt u zonder de muis te bewegen. Maak hetzelfde aantal BézierCircle-kopieën als er TEM-afbeeldingen zijn die voor de reconstructie worden gebruikt. Lijn ze uit met de gerangschikte TEM-afbeeldingen met behulp van de tool Verspreiden , zoals in stap 4.10.
    6. Pas elke BézierCircle-curve op het tabblad Modellering aan zodat deze overeenkomt met het profiel van de dendritische wervelkolom in elke afbeelding. Zorg ervoor dat alleen het momenteel bewerkte BézierCircle-object en de bijbehorende TEM-afbeelding tegelijk zichtbaar zijn.
      OPMERKING: Alle acties met de rechtermuisknop die voor bepaalde stappen nodig zijn, moeten binnen de scènegrens worden uitgevoerd. De opeenvolgende krommen moeten overeenkomen met de begrenzingen van de opeenvolgende coupes van de dendritische wervelkolom en hetzelfde aantal controlepunten bevatten.
  12. Verbind aangrenzende lijnen met behulp van de 3D-reconstructiefunctie om een doorlopend oppervlak te vormen en de uiteindelijke 3D-vorm te creëren (Afbeelding 4D).
    1. Zorg ervoor dat alleen de BézierCircle-objecten zichtbaar zijn. Verberg in de scèneverzameling alle andere objecten met behulp van het oogpictogram in de zijbalk.
    2. Om het dendritische ruggengraatobject te maken, gaat u naar het tabblad Lay-out , selecteert u alle BézierCircle-objecten, klikt u met de rechtermuisknop en klikt u op Deelnemen. Converteer het samengevoegde object naar een mesh door met de rechtermuisknop te klikken en Converteren naar |Gaas.
    3. Om de randen van het samengevoegde object te verbinden, gaat u naar het tabblad Modellering , drukt u op 2 om de modus Randselectie te openen |Selecteren |Allemaal |rechtsklik |Brug Rand Lussen.
    4. Om het gat bovenaan het object op te vullen, deselecteert u alles door naast het object te klikken, houdt u Alt ingedrukt en klikt u op een randgedeelte van de bovenste richel, klik met de rechtermuisknop, selecteer Randen uitzetten, sleep omhoog op de Z-as, druk op S en beweeg de muis om de nieuwe randlus te verkleinen, klik om de wijziging te accepteren. Terwijl de nieuwe randlus nog steeds is geselecteerd, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Nieuw gezicht van randen. Vul de onderste opening op dezelfde manier.
    5. Als u het object vloeiender wilt maken, gaat u naar het tabblad Lay-out , klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Schaduw vloeiend. Om de vorm verder glad te strijken, ga naar Modifiers (rechterzijbalk) |Modifier toevoegen |Genereren |Onderverdeling oppervlak. Stel zowel het Viewport- als het Render-niveau in op dezelfde waarde (aanbevolen 1).
  13. Herhaal stap 4.11-4.12 voor reconstructie van synapsen (Figuur 4E,F).
  14. Wijs een kleur toe aan elke structuur en gebruik de renderingfunctie om de uiteindelijke afbeelding voor te bereiden (Afbeelding 4G,H). Ga naar het menu Viewport Shading en selecteer Gerenderde om een voorbeeld van materiaalwijzigingen te bekijken. Selecteer het object dat u wilt kleuren en klik op Materiaal (rechterzijbalk) |Nieuw |pas de basiskleur aan.
    1. Om het uiterlijk van het materiaal te verfijnen, past u de schuifregelaars Ruwheid of Metaal naar behoefte aan. Gebruik deze methode om aan elke structuur een afzonderlijke kleur toe te wijzen.
    2. Om de scèneverlichting aan te passen, klikt u op het object Licht, houdt u G ingedrukt en beweegt u de muis om het te verplaatsen. Om de lichtintensiteit te wijzigen, gaat u naar Data (rechterzijbalk) en past u de vermogenswaarde aan.
    3. Om de camera te positioneren, richt u de viewport zo dat deze naar de gereconstrueerde ruggengraat is gericht zoals deze in de uiteindelijke afbeelding zou moeten verschijnen, drukt u op Ctrl + Alt + Numpad 0. Selecteer het zichtbare cameraframe, houd G ingedrukt en beweeg de muis om het indien nodig te verplaatsen.
    4. Om u voor te bereiden op het renderen, gaat u naar de uitvoer (rechterzijbalk), wijzigt u de waarden voor resolutie X en Y zodat deze overeenkomen met de gewenste afbeelding. Als u de beeldkwaliteit wilt verbeteren, gaat u naar Render (rechterzijbalk) |Renderen, pas de waarde van Samples aan tussen 120 en 250. Ga voor een transparante achtergrond naar Render |Bioscoop |vink Transparant aan. Om de afbeelding te renderen, drukt u op F12 of gaat u naar Renderen (bovenste menu) |Afbeelding renderen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om onze methode goed toe te passen op de analyse van circadiane synaptische veranderingen, is het noodzakelijk om te beginnen met het selecteren van ten minste vier tijdstippen met gelijke tussenpozen, met twee punten voor elke fase van de activiteit van de dieren (elke 6 uur). Op deze aangewezen tijdstippen worden de dieren geofferd en worden hun hersenen verzameld. Deze benadering maakt het mogelijk om dagelijkse of circadiane patronen van synaptische plasticiteit te identificeren en k...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteerden we de methodologie die wordt gebruikt voor het bestuderen van de circadiane plasticiteit van synapsen en de reconstructie van dendritische stekels in de vatcortex van muizen. Om betrouwbare resultaten te garanderen, moet het onderzoek naar circadiane plasticiteit ten minste vier tijdstippen bevatten. Ons onderzoek toonde aan dat gegevens van twee tijdstippen - één tijdens de rustfase (dag) en één tijdens de activiteitsfase (nacht) - informatie gaven over de dagelijkse ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt ondersteund door subsidies van het National Science Centre in Polen, NCN OPUS20 nr UMO-2020/39/B/NZ7/03366 aan EP en het Jagiellonian University Medical College, nr N41/DBS/001129 aan MJ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Aclar filmAgar scientificAGL4458
Blender software versie: v. 2.91.2
Cacodylic acid, sodium salt trihydratePolysciences01131-100
Concave slideMenzel9.161 151
Diamond knife Diatome15-USMeshoek: Ultra 45° 
Digital camera Nikon DXM 1200 F
di-Sodium Hydrogen Phosphate DodecahydratePOCH799280115
Embedding resinPolysciences08792-1Luft formulering 
EthanolPol-AuraPA-11-0004
GIMP softwareversie: v 3.0.4
Lead citrateTAABL018
Light microscopy Nikon Optiphot
Osmium tetroxide Polysciences0223C-10Kristallijn (99,95%)
Paintbrush
Photoshop softwareversie: CS5
Potassium ferricyanideSigmaaldrichP8131
Propylene oxide Sigmaaldrich82320puriss. p.a., ≥99,5% (GC)
Single slot gridsAgar scientificAGG25252 x 0,75 mm of 2 x 1 mm
Sodium chloride Chempur117941206
Sodium dihydrogen phosphate dihydrateChempur117991808
Stereo microscopepzo
Syring filter BiosensBS25PES045
TEM JoelJEM-2100
UltramicrotomeLeicaUC7
Uranyl acetateLachema
VibratomeLeicaVT1000 S

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jasinska, M., Pyza, E. Circadian plasticity of mammalian inhibitory interneurons. Neural Plast. 2017, 1-12 (2017).
  2. Krzeptowski, W., Hess, G., Pyza, E. Circadian plasticity in the brain of insects and rodents. Front Neural Circuits. 12, 32(2018).
  3. Mansilla, A., et al. Molecular mechanisms that change synapse number. J Neurogenet. 32 (3), 155-170 (2018).
  4. Frank, M. G. Renormalizing synapses in sleep: the clock is ticking. Biochem Pharmacol. 191, 114533(2021).
  5. Jasinska, M., et al. Daily rhythm of synapse turnover in mouse somatosensory cortex. Acta Neurobiol Exp. 74 (1), 104-110 (2014).
  6. Jasinska, M., et al. Circadian rhythmicity of synapses in mouse somatosensory cortex. Eur J Neurosci. 42 (8), 2585-2594 (2015).
  7. Jasinska, M., et al. Circadian clock regulates the shape and content of dendritic spines in mouse barrel cortex. PLOS ONE. 14 (11), e0225394(2019).
  8. Jasinska, M., et al. Circadian changes of dendritic spine geometry in mouse barrel cortex. Front Neurosci. 14, 578881(2020).
  9. Jasinska, M., et al. Light-modulated circadian synaptic plasticity in the somatosensory cortex: link to locomotor activity. Int J Mol Sci. 25 (23), 12870(2024).
  10. Woolsey, T. A., Vander Loos, H. The structural organization of layer IV in the somatosensory region (SI) of mouse cerebral cortex. Brain Res. 17 (2), 205-242 (1970).
  11. Woolsey, T. A., Welker, C., Schwartz, R. H. Comparative anatomical studies of the Sml-face cortex with special reference to the occurrence of "barrels" in layer IV. J Comp Neurol. 164 (1), 79-94 (1975).
  12. Armstrong-James, M., Fox, K. Spatiotemporal convergence and divergence in the rat SI barrel cortex. J Comp Neurol. 263 (2), 265-281 (1987).
  13. Barrel cortex. Fox, K. , Cambridge University Press. (2008).
  14. Jasinska, M., et al. Rapid, learning-induced inhibitory synaptogenesis in murine barrel field. J Neurosci. 30 (3), 1176-1184 (2010).
  15. Knott, G. W., Quairiaux, C., Genoud, C., Welker, E. Formation of dendritic spines with GABAergic synapses induced by whisker stimulation in adult mice. Neuron. 34 (2), 265-273 (2002).
  16. Jasinska, M., et al. Effect of associative learning on memory spine formation in mouse barrel cortex. Neural Plast. 2016, 1-11 (2015).
  17. Jasinska, M., et al. Fear learning increases the number of polyribosomes associated with excitatory and inhibitory synapses in the barrel cortex. PLOS ONE. 8 (2), e54301(2013).
  18. White, E. L. Ultrastructure and synaptic contacts in barrels of mouse SI cortex. Brain Res. 105 (2), 229-251 (1976).
  19. Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing whole-brain activity and development at the single-cell level using light-sheet microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
  20. Serrano, M. E., Kim, E., Petrinovic, M. M., Turkheimer, F., Cash, D. Imaging synaptic density: the next holy grail of neuroscience. Front Neurosci. 16, 796129(2022).
  21. Woelfle, S., et al. CLARITY increases sensitivity and specificity of fluorescence immunostaining in long-term archived human brain tissue. BMC Biol. 21 (1), 113(2023).
  22. Weibel, E. R. Stereological methods. Vol. 1: practical methods for biological morphometry. , Academic Press. London. (1979).
  23. Sterio, D. C. The unbiased estimation of number and sizes of arbitrary particles using the disector. J Microsc. 134 (2), 127-136 (1984).
  24. Gundersen, H. J. G. Stereology of arbitrary particles. J Microsc. 143 (1), 3-45 (1986).
  25. Fiala, J. C., Harris, K. M. Cylindrical diameters method for calibrating section thickness in serial electron microscopy. J Microsc. 202 (3), 468-472 (2001).
  26. Napper, R. M. A. Total number is important: using the disector method in design-based stereology to understand the structure of the rodent brain. Front Neuroanat. 12, 16(2018).
  27. Perez-Cruz, C., Simon, M., Czéh, B., Flügge, G., Fuchs, E. Hemispheric differences in basilar dendrites and spines of pyramidal neurons in the rat prelimbic cortex: activity- and stress-induced changes. Eur J Neurosci. 29 (4), 738-747 (2009).
  28. Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
  29. Mikula, S., Binding, J., Denk, W. Staining and embedding the whole mouse brain for electron microscopy. Nat Methods. 9 (12), 1198-1201 (2012).
  30. Videnovic, A., Zee, P. C. Consequences of circadian disruption on neurologic health. Sleep Med Clin. 10 (4), 469-480 (2015).
  31. Logan, R. W., McClung, C. A. Rhythms of life: circadian disruption and brain disorders across the lifespan. Nat Rev Neurosci. 20 (1), 49-65 (2018).
  32. Nassan, M., Videnovic, A. Circadian rhythms in neurodegenerative disorders. Nat Rev Neurol. 18 (1), 7-24 (2021).
  33. Shen, Y., et al. Circadian disruption and sleep disorders in neurodegeneration. Transl Neurodegener. 12 (1), 8(2023).
  34. Dufort-Gervais, J., Mongrain, V., Brouillette, J. Bidirectional relationships between sleep and amyloid-beta in the hippocampus. Neurobiol Learn Mem. 160, 108-117 (2019).
  35. Adler, P., et al. Aging disrupts the circadian patterns of protein expression in the murine hippocampus. Front Aging Neurosci. 11, 368(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transmission Electron MicroscopyCircadian Synaptic PlasticityBarrel CortexMouse BrainSynaptic DensityDendritic Spine ReconstructionExcitatory SynapsesInhibitory SynapsesStereological Dissector MethodTangential Brain Sectioning

Related Articles