Een stapsgewijze handleiding voor de isolatie en analyse van bladoppervlak en apoplastisch RNA met behulp van Arabidopsis-rozetten

Samenvatting

We beschrijven een eenvoudige maar zeer reproduceerbare methode om extracellulair RNA te isoleren van het bladoppervlak en de apoplast van Arabidopsis-planten.

Samenvatting

Het oppervlak van de bladeren van planten en de intercellulaire ruimte in de bladeren (de apoplast) dienen als belangrijke interfaces voor moleculaire uitwisseling tussen planten en hun op elkaar inwerkende microben. In eerder werk hebben we de aanwezigheid van een breed scala aan RNA-soorten in de apoplast van Arabidopsis-rozetten aangetoond. Meer recentelijk toonden onze bevindingen aan dat Arabidopsis-planten ook actief RNA afscheiden op hun bladoppervlakken. Om dit te onderzoeken, hebben we een zeer reproduceerbare methode ontwikkeld om zowel bladoppervlaktewas (LSW) als apoplastische wasvloeistof (AWF) van dezelfde set Arabidopsis-planten te verzamelen. Daarnaast hebben we een niet-invasieve techniek onderzocht met bladoppervlakte-uitstrijkje (LSS), waarmee we RNA konden verzamelen door het bladoppervlak voorzichtig af te vegen met steriele staafjes met wattenstaafjes. Om het risico op microbiële besmetting te minimaliseren, hebben we LSW-, AWF- en LSS-fracties gefilterd voordat we het extracellulaire RNA (exRNA) isoleerden. Bij het analyseren van het gezuiverde exRNA met behulp van denaturerende RNA-gelelektroforese, hebben we een breed scala aan lange en kleine RNA-soorten waargenomen in LSW-, LSS- en AWF-RNA-monsters. Verdere kwantificering en vergelijkende analyse tussen exRNA-monsters en experimentele omstandigheden werden uitgevoerd met behulp van de vrij toegankelijke software ImageJ. Dit protocol biedt een efficiënte, kosteneffectieve aanpak voor het isoleren en analyseren van kleine hoeveelheden exRNA uit plantenbladeren. Deze RNA-preparaten kunnen verder worden gekarakteriseerd door middel van sequencing en andere moleculaire analyses, en bieden inzicht in de dynamische rol van exRNA in plant-microbe interacties.

Inleiding

Bladeren worden gekoloniseerd door een verscheidenheid aan microben, waaronder bacteriën, schimmels, oomyceten en protisten, die planten kunnen helpen beschermen tegen biotische en abiotische stressoren, wat uiteindelijk de groei en ontwikkeling van planten bevordert 1,2,3,4. Het plantenblad heeft twee hoofdcompartimenten om hun op elkaar inwerkende microben te herbergen: epifytisch (bladoppervlak) en endofytisch (apoplast)². Het bladoppervlak wordt beschermd door een hydrofobe nagelriemlaag, die waterverlies voorkomt en componenten zoals wax en cutine bevat. Het bovenste (adaxiale) bladoppervlak bevat vaak gespecialiseerde haarachtige epidermale cellen, trichomen genaamd, die beschermen tegen UV-licht, de temperatuur reguleren en dienen als afschrikmiddel voor herbivorie. De apoplast daarentegen vergemakkelijkt de uitwisseling van gas en water voor fotosynthese en zorgt voor een vochtige omgeving die bevorderlijk is voor microbiële kolonisatie⁵. Ondanks deze verschillen geven beide bladcompartimenten de voorkeur aan bepaalde microben, waarbij epifytische microbiële netwerken complexer zijn in termen van diversiteit in vergelijking met de endofytische microbiële netwerken⁵. Hoe de samenstelling van deze microbiële gemeenschappen in elk extracellulair compartiment wordt gereguleerd, blijft slecht begrepen. We speculeren dat de structuur van de microbiële gemeenschap gedeeltelijk kan worden bepaald door extracellulair RNA (exRNA) dat door de waardplant wordt uitgescheiden.

In onze recente studie rapporteerden we de aanwezigheid van diverse RNA-soorten op het bladoppervlak die verschillen van RNA in de apoplast of cellysaten⁶. Hoewel het meeste onderzoek naar exRNA's in planten zich heeft gericht op kleine niet-coderende RNA's, zoals microRNA's (miRNA's) en kleine storende RNA's (siRNA's), is er minder aandacht besteed aan andere RNA-soorten, zoals rRNA- en tRNA-afgeleide fragmenten, die mogelijk cellulaire processen kunnen reguleren onafhankelijk van sequentiecomplementariteit, met name bij soorten zonder RNA-interferentiemechanismen ^{7,8, 9}. okt.

De methode die we hier beschrijven maakt de sequentiële isolatie van RNA mogelijk uit zowel bladoppervlaktewas (LSW) als apoplastische wasvloeistof (AWF) met behulp van dezelfde set Arabidopsis-planten. Daarnaast beschrijven we een niet-invasieve orthogonale techniek met een uitstrijkje van het bladoppervlak (LSS), waarmee RNA kan worden verzameld door het bespoten bladoppervlak voorzichtig af te vegen met steriele wattenstaafjes⁶. Om het risico op microbiële besmetting te minimaliseren, filteren we zowel de LSW- als de AWF-fracties voordat we het extracellulaire RNA isoleren. Om de kwantiteit en grootteverdeling van exRNA-monsters te beoordelen, beschrijven we een protocol waarbij gebruik wordt gemaakt van denaturerende polyacrylamidegelelektroforese in combinatie met beeldanalyse met behulp van de vrij toegankelijke software ImageJ. Dit protocol biedt een efficiënte, kosteneffectieve aanpak voor het isoleren en analyseren van kleine hoeveelheden exRNA. Deze RNA-preparaten kunnen verder worden gekarakteriseerd door middel van sequencing en moleculaire analyses, en bieden inzicht in de dynamische rol van extracellulair RNA in plant-microbe-interacties.

Het hieronder beschreven protocol verschilt van ons eerder beschreven protocol voor het isoleren van RNA uit extracellulaire blaasjes van planten¹⁰. Het huidige protocol vereist geen ultracentrifugatiestappen en maakt de isolatie van RNA mogelijk uit de totale extracellulaire wasvloeistof, niet alleen uit extracellulaire blaasjes. Het belangrijkste is dat het twee orthogonale methoden biedt voor het isoleren van RNA van het bladoppervlak. Voor zover wij weten, is de isolatie van RNA uit bladoppervlakken niet beschreven vóór onze recente publicatie⁶.

Protocol

1. Buffervoorbereiding en sterilisatie

1. Bereid een blaasjesisolatiebuffer (VIB) bestaande uit 20 mM 2-(N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES), pH 6,0, 2 mM CaCl₂ en 0,01 M NaCl in 1 l gedestilleerd water.
   OPMERKING: Kleine aanpassingen aan de concentratie van NaCl in VIB zijn aangebracht van 0,1 M tot 0,01 M om de ionische concentratie van de bladapoplast na te bootsen.
2. Autoclaaf de VIB gedurende 20 minuten bij 121 °C, vloeistofcyclus. U kunt de VIB ook filtersteriliseren met behulp van een vacuümfilter van 0,45 μm.
   OPMERKING: Deze stap is om ervoor te zorgen dat de buffer steriel is, aangezien elke microbiële besmetting kan leiden tot het uitlokken van planten en op zijn beurt tot variabiliteit in de resultaten. Deze buffer kan worden bewaard bij kamertemperatuur (zonder het deksel te openen na sterilisatie) voor kortstondige opslag of bij 4 °C voor langdurige opslag.

2. Plantaardig materiaal en groeiconditie

1. Zaai Arabidopsis thaliana Col-0 wildtype (WT) zaden in 4-inch ronde plastic potten met een standaard potgrond. Week de zaden na het zaaien met een biologisch fungicide (600 mg/L), bedek ze met een doorzichtige plastic koepel en bewaar ze 3 dagen in het donker op 4 °C om synchrone kieming te veroorzaken.
2. Breng de potten met zaden over naar een temperatuurgecontroleerde kortedaggroeikamer die is ingesteld op 24 °C onder een fotoperiode van 9 uur licht/15 uur donker met een fotosynthetische fotonfluxdichtheid van 150 μmol^·m−2·s⁻¹ op plantniveau (50:50 mix van 3.500 en 5.000 K spectrum 32-watt fluorescentielampen).
3. Breng na ongeveer 10 dagen de individuele zaailingen over naar 36-cellige tray-inzetstukken met potgrond en dek af met een doorzichtige plastic koepel gedurende 1-2 weken.
   OPMERKING: Een typisch experiment vereist ~12-24 gezonde planten voor elk genotype/behandeling. Er is opgemerkt dat planten van 6-7 weken oud de optimale hoeveelheid LSW- en AWF-RNA opleveren met het minste risico op cellulaire besmetting.
4. Afhankelijk van de gebruikte potgrond, geef de planten elke 10-15 dagen water om droogte of overstromingsstress te voorkomen.

3. Verzameling van RNA van het bladoppervlak

1. Op centrifugatie gebaseerde methode (Leaf Surface Wash; LSW)
   1. Gebruik voor elke replicaat 6-7 weken oude Arabidopsis-planten.
   2. Voeg Silwet-L77 (hierna bevochtigingsmiddel genoemd) toe aan de steriele VIB in een eindconcentratie van 0,001% (1 μL in 100 ml VIB) alvorens met de isolatie van LSW te beginnen.
      OPMERKING: Silwet-L77 is een bevochtigingsmiddel, dat de oppervlaktespanning vermindert en de buffer in staat stelt om bladoppervlakken te coaten.
   3. Breng 100 ml VIB over in een spuitfles van 500 ml.
   4. Maak de Arabidopsis-rozetten voorzichtig los van de wortels met een fijne schaar.
   5. Verwijder overtollig vuil van de bladsteel met een zachte borstel.
   6. Leg de rozetten op een plat dienblad met het abaxiale oppervlak naar boven.
   7. Spuit het abaxiale oppervlak in met VIB + bevochtigingsmiddel met behulp van vijf pompjes van de spuitfles.
   8. Draai de rozetten voorzichtig om en spuit het adaxiale oppervlak vijf keer in met VIB+ bevochtigingsmiddel.
   9. Om LSW te herstellen, plaatst u de gespoten rozetten voorzichtig in naaldloze spuiten van 60 ml met gaten aan de onderkant (er passen maximaal twee rozetten van 6 weken oud per spuit) die in centrifugeflessen van 250 ml worden geplaatst. Wikkel de spuit met parafilm om de hals om de punt van de spuit boven de bodem van de fles te hangen (zie afbeelding 1 ter referentie).
      OPMERKING: Voor details over het voorbereiden van de spuiten van 60 ml met gaten, zie het eerder gepubliceerde protocol¹¹.
   10. Centrifugeer de geladen flessen bij 100 g gedurende 10 minuten bij 4 °C (JA-14 rotor).
   11. Filtreer de LSW door een spuitfilter van 0,22 μm en vang het filtraat op in een centrifugeerbuis van 50 ml die op ijs is geplaatst.
       OPMERKING: Normaal gesproken zouden 12 planten aan het einde ongeveer 30 ml LSW opleveren met behulp van dit protocol. Dit is echter slechts een schatting op basis van het aantal sprays dat bij elke stap wordt uitgevoerd. Dit volume is normaal gesproken kleiner dan het gespoten volume, omdat een deel van de gespoten buffer verloren gaat tijdens het hanteren.
2. Methode voor het uitstrijkje van het bladoppervlak (LSS)
   1. Spuit de losgemaakte rozetten in met VIB+ bevochtigingsmiddel zoals beschreven in de vorige paragraaf (stappen 3.1.1-3.1.7).
   2. Om LSS te herstellen, veegt u de adaxiale en abaxiale oppervlakken af met steriele staafjes met wattenstaafjes en drukt u de geweekte uiteinden tegen de binnenwand van een centrifugatiebuis van 15 ml om de vloeistof eruit te persen.
      OPMERKING: De adaxiale en abaxiale LSS-monsters kunnen in afzonderlijke buizen worden verzameld op basis van de experimentele opstelling en het verwachte resultaat.
   3. Filtreer de LSS-monsters door een spuitfilter van 0,22 μm in een centrifugatiebuis van 15 ml die op ijs is geplaatst.
      OPMERKING: Afhankelijk van het aantal planten dat is afgenomen, kunnen per experiment verschillende hoeveelheden LSS worden verzameld.

Figuur 1: Gereedschap dat wordt gebruikt voor het wassen van bladoppervlakken en het isoleren van apoplastische wasvloeistof. (A) Om LSW en AWF op te vangen, worden twee hele Arabidopsis thaliana rozetten in een spuit van 60 ml geplaatst met acht extra gaten die met een verwarmde tang in het uiteinde van de spuit worden gesmolten om kanalen te creëren waar de was doorheen kan stromen. (B) Deze naaldloze spuit wordt vervolgens omwikkeld met parafilm in het nekgebied zoals afgebeeld. (C) Met deze stap past de spuit in een centrifugefles van 250 ml zonder de bodem van de fles aan te raken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Opvang van apoplastische wasvloeistof (AWF)

1. Plaats dezelfde set planten die worden gebruikt voor LSW- of LSS-isolatie in een bekerglas en spoel ze voorzichtig twee keer af met gedestilleerd water.
2. Infiltreer de rozetten met VIB gedurende 20 s als volgt:
   OPMERKING: Hoewel het proces van vacuüminfiltratie goed is beschreven in een eerder gepubliceerd protocol¹¹, is het hier gereproduceerd om het huidige protocol duidelijk te maken.
   1. Plaats de rozetten voorzichtig in een koffiezetapparaat van de Franse pers met 300-500 ml VIB. Plaats het deksel op de Franse pers en laat de zuiger voorzichtig zakken totdat de planten volledig onder water staan.
   2. Plaats de Franse pers met planten en buffer in een vacuümkamer. Vacuüm gedurende 20 s met behulp van een vacuümpomp. De buffer moet net beginnen te koken.
   3. Laat het vacuüm los en haal de Franse pers uit de vacuümkamer, haal het deksel eraf en giet de VIB in een aparte plastic beker van 500 ml. Haal de rozetten uit de Franse pers.
      OPMERKING: De VIB kan meerdere keren op dezelfde dag worden hergebruikt voor één genotype, maar als de VIB eenmaal is gebruikt voor vacuüminfiltratie, mag deze niet worden bewaard voor gebruik op een andere dag.
   4. Verwijder overtollig VIB van de planten door de bladeren voorzichtig te schudden en vervolgens over een papieren handdoek te borstelen.
3. Verwijder overtollige buffer van de bladoppervlakken door voorzichtig te deppen met vloeipapier.
4. Om de apoplastische wasvloeistof (AWF) op te vangen, plaatst u de rozetten in naaldloze spuiten van 60 ml die in centrifugeflessen van 250 ml worden geplaatst, zoals beschreven voor LSW-opvang en centrifugeert u deze gedurende 4 minuten bij 30 °C bij 600 × g met langzame acceleratie.
5. Filtreer de gepoolde AWF door een spuitfilter van 0,22 μm en vang het filtraat op in een centrifugebuis van 15 ml die op ijs is geplaatst.
   OPMERKING: Normaal gesproken zouden 12 planten aan het einde ongeveer 6 ml AWF opleveren met behulp van dit protocol. Gefilterde LSW, AWF en LSS kunnen direct worden gebruikt of bij -80 °C worden bewaard tot verder gebruik.
6. Noteer het verse gewicht (FW) van de planten die voor elke replicaat zijn gebruikt na AWF-isolatie. Gebruik vervolgens deze meting om de hoeveelheid RNA in elk monster te normaliseren (Figuur 2).

Figuur 2: Schematische illustraties van het protocol en de methode van het uitstrijkje van het bladoppervlak. (A) Schematische weergave van het stapsgewijze protocol voor de isolatie van het wassen van het bladoppervlak en apoplastische wasvloeistof met behulp van Arabidopsis-rozetten. (B) Schematische illustratie van de methode voor het uitstrijkje van het bladoppervlak (LSS) voor het isoleren van RNA van het bladoppervlak. Figuren aangepast van Figuur S1 en Figuur S4 van Borniego et al., 2025⁶. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Precipitatie van RNA

1. Precipiteer RNA door het vereiste volume AWF, LSW of LSS te mengen met 0,1 volume 3 M natriumacetaat (pH 5,2) en 1,0 volume koude isopropanol in een centrifugatiebuis van 15 ml.
2. Voeg glycogeen (20 mg/ml bouillon) toe aan een eindconcentratie van 20 μg/ml.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de centrifugebuisjes die worden gebruikt om RNA neer te slaan, kunnen worden gecentrifugeerd met een hoge snelheid van 13.000 × g. Breuk van buizen in deze stap kan leiden tot verlies van RNA-monsters.
3. Incubeer het mengsel bij -20 °C gedurende minimaal 1 uur of een nacht.
4. Centrifugeer de buizen bij 13.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C (JA-25.50 rotor).
5. Was de korrel twee keer met ijskoud 70% EtOH en laat hem niet langer dan 10 minuten aan de lucht drogen.
6. Resuspendeer de pellets in 100 μl ultrazuiver DNase/RNase-vrij water of VIB en breng het RNA over in centrifugebuisjes van 1,5 ml.
   OPMERKING: Na deze stap kan het geprecipiteerde RNA maximaal 2 weken bij -80 °C worden bewaard.

6. Op TRIzol gebaseerde RNA-isolatie

1. Voeg 1 ml TRIzol-reagens toe aan elke buis en meng door te schudden op een rotator.
   LET OP: Gebruik het voor het hanteren van TRIzol in een zuurkast, draag handschoenen en oogbescherming.
2. Plaats de buizen 10 minuten op een tafelrotator bij kamertemperatuur (RT).
3. Voeg 200 μL chloroform toe aan elke buis, gevolgd door een korte maar krachtige vortexstap.
   LET OP: Gebruik het voor het hanteren van chloroform in een zuurkast, draag handschoenen en oogbescherming.
4. Laat de buisjes ongeveer 3 minuten op RT staan en centrifugeer ze vervolgens 15 minuten bij 13.000 × g bij 4 °C.
5. Breng de waterige fase over in gelabelde centrifugebuisjes van 1,5 ml en voeg 10 μg RNase-vrij glycogeen en één volume koude isopropanol toe.
   LET OP: Voor biologisch gevaarlijk afval dat wordt gegenereerd (zoals fenolafval), verzamelt u organische oplosmiddelen in de daarvoor bestemde afvalcontainers volgens de richtlijnen van de instelling.
6. Incubeer de buisjes niet langer dan 1 uur bij -20 °C.
   OPMERKING: Het neerslaan van het RNA gedurende meer dan 1 uur in deze stap vermindert de efficiëntie van RNA-isolatie en leidt tot een zeer lage RNA-concentratie.
7. Om het RNA te pelleteren, centrifugeert u de buisjes gedurende 20 minuten bij 13.000 × g bij 4 °C.
8. Was de RNA-pellets twee keer met ijskoud 70% EtOH en laat ze aan de lucht drogen voordat u ze opnieuw suspendeert in 10-20 μL ultrapuur DNase/RNase-vrij water.
9. Bewaar het geresuspendeerde RNA bij -20 °C of -80 °C voor opslag op korte of lange termijn.

7. Verwijdering van fenol- of guanidineverontreiniging

1. Om fenol- of guanidinebesmetting uit de RNA-monsters te verwijderen, voert u een of twee seriële precipitaties uit met 96% EtOH en ammoniumacetaat.
2. Voeg 1 μg glycogeen toe aan 10 μL RNA-monsters en meng met 0,5 volume 7,5 M ammoniumacetaat vóór de toevoeging van 2,5 volumes 96-100% EtOH.
   OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van EtOH moet in deze stap 70-75% in het gehele volume zijn.
3. Incubeer het mengsel gedurende 30 minuten bij -80 °C en centrifugeer bij 13.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
4. Was de RNA-pellet twee keer met 70% EtOH en resuspendeer in 10 μL ultrazuiver DNase/RNase-vrij water.

8. RNA-gelelektroforese voor kwantificering en vergelijking

1. Bereid een minigel (7,2 cm x 8,6 cm x 0,75 mm) met 10% of 15% polyacrylamide en 7 M ureum in 1x Tris-Boric Acid EDTA (TBE, pH 8,4) met 40% acrylamide/Bis-oplossing, 37,5:1. Als alternatief kan een in de handel verkrijgbare mini-gel (15% TBE-ureumgel) worden gebruikt om de RNA-monsters uit te voeren.
2. Meng RNA-monsters (1:1) met 2x denaturerende laadbuffer (95% formamide, 10 mM EDTA, 0,02% SDS, 0,02% broomfenolblauw en 0,01% xyleencyanol), denatureer bij 65 °C gedurende 5 minuten en plaats onmiddellijk op ijs.
3. Los de RNA-monsters op in 0.5x TBE lopende buffer bij RT bij 220 V gedurende ongeveer 1 uur en 15 min.
4. Gebruik voor groottestandaarden een 1:1 mix van ssRNA met een laag bereik en 14-30 nt ssRNA-laddermarkers.
5. Bevlek de gel met 1x SYBR gold nucleic acid gel vlek in 0,5x TBE gedurende 10 min, was tweemaal met gedestilleerd water en beeld af met behulp van een beeldvormingssysteem (Figuur 3).
6. Om het RNA te kwantificeren dat in elke baan is opgelost, gebruikt u de gelanalysemethode die wordt beschreven in de ImageJ-documentatie onder het kopje "Gelanalyse": https://imagej.net/ij/docs/menus/analyze.html
7. Aangezien elke keer 100 ng/μL CL-RNA wordt geladen om het bandpatroon tussen CL- en exRNA-monsters te vergelijken, schat u de concentratie van exRNA-monsters ten opzichte van CL-RNA (Figuur 4).

Figuur 3: Plantenbladeren zijn bedekt met divers RNA. 100 ng RNA uit bladcellysaat (CL) en 2 μL RNA geïsoleerd uit AWF en LSW werden gescheiden op een 15% denaturerende polyacrylamidegel en gekleurd met SYBR Gold nucleïnezuurkleuring om de RNA-bandingpatronen te visualiseren en te vergelijken. RNA-groottestandaarden worden weergegeven in de meest linkse rijstrook. Densitometriemetingen verkregen met behulp van ImageJ-gelanalyse worden onderaan elke baan aangegeven en geven de hoeveelheid RNA aan ten opzichte van het RNA in de totale lysaatbaan van de bladcel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Herhaalde extractie van LSW-RNA. LSW werd eerst geïsoleerd met VIB zonder Silwet L-77 of variërende concentraties van Silwet L-77 (0,001% of 0,01%). Herhaalde isolatie van LSW met behulp van dezelfde set Arabidopsis-planten kan worden gebruikt om LSW-RNA te verrijken met behulp van VIB + Silwet L-77 (0,001%). L1, L2 en L3 geven RNA-monsters aan die zijn geïsoleerd met behulp van LSW die zijn verzameld door drie opeenvolgende centrifugatierondes na het spuiten van dezelfde set planten. Het verhogen van de concentratie van het bevochtigingsmiddel van 0,001% naar 0,01% verbeterde de LSW-RNA-isolatie niet. Densitometriemetingen die zijn verkregen met behulp van ImageJ-gelanalyse worden onderaan elke baan aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

9. Alternatieve methode om RNA te kwantificeren met behulp van een methode op basis van microtiterplaten

1. Bereid standaard RNA-oplossingen met behulp van CL RNA in ultrapuur RNase/DNase-vrij water. Bepaal het juiste concentratiebereik voor de normen op basis van de verwachte concentratie van de monsters. Gebruik de volgende RNA-concentraties: 0, 6.75, 12.5, 25, 50, 100, 200 ng/μL en bereid een voldoende volume van elke standaard voor om twee technische replicaten mogelijk te maken.
2. Bereid 1,5x SYBR Gold nucleïnezuurgelkleuring voor in 500 mM Tris HCl pH = 8.
   LET OP: SYBR Gold is pH-afhankelijk en heeft een optimale kleurgevoeligheid tussen pH = 7,0 en 8,0.
3. Microplate opstelling:
   1. Voeg 99 μL dH₂O toe aan elk putje.
   2. Voeg 1 μL RNA toe aan elk putje. Gebruik 1 μL voor zowel RNA-monsters als RNA-standaarden.
   3. Voeg 50 μL 1,5x SYBR Gold toe aan elk putje.
4. Stel de parameters op de microplaatlezer als volgt in:
   Schudden - Lineair of orbitaal: 0:03 (MM:SS)
   Lees - Fluorescentie-eindpunt met excitatiegolflengte ingesteld op 496 nm en emissiegolflengte ingesteld op 540 nm.
5. Bouw een kalibratielijn met behulp van de waarden van de standaarden. Bereken met behulp van de kalibratielijnvergelijking de RNA-concentraties in de monsters.
   OPMERKING: Alternatieve kleurstoffen kunnen worden gebruikt om RNA te kwantificeren in TRIzol-geïsoleerde monsters. Vergelijkbare resultaten werden verkregen met Ribo488 RNA-kwantificeringsreagens. Voor deze kleurstof heeft het bedrijf een gedetailleerde handleiding verstrekt. Verdun de kleurstof kort 1000x (1 tot 1000) met 200 mM Tris pH = 8. Om vervolgens de metingen uit te voeren, voegt u 99 μL geautoclaveerde dH₂O toe aan elk putje + 1 μL RNA (monster of standaard) + 100 μL van de Ribo488-verdunning, incubeert u 5 minuten en kwantificeert u de fluorescentie met behulp van een plaatlezer met behulp van 480 nm excitatie en 520 nm emissie. Standaardcurven verkregen met behulp van de twee RNA-kleurstoffen worden weergegeven in figuur 5.

Figuur 5: Standaardcurven verkregen met behulp van een RNA-kwantificeringsmethode op basis van microtiterplaten. Twee verschillende RNA-kleurstoffen, SYBR Gold (links) en Ribo488 (rechts) leveren consistente resultaten op met twee technische replicaten per monster. Beide methoden kunnen worden gebruikt om RNA-kwantificering uit te voeren. Elke keer dat RNA moet worden gekwantificeerd, moet echter een standaardcurve worden verkregen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Een schematisch overzicht van het hierboven beschreven stapsgewijze protocol voor het isoleren van bladoppervlaktewas (LSW) en apoplastische wasfracties (AWF) van Arabidopsis-planten is weergegeven in figuur 2A. Deze methode maakt het mogelijk om zowel LSW als AWF te extraheren uit slechts drie tot zes planten per replicaat, terwijl consistent equivalente hoeveelheden RNA uit beide fracties worden verkregen. Om de RNA-concentratie in cellysaten te meten, maken we gebruik van NanoDrop-spectrofotometrie. Voor de RNA-monsters die zijn afgeleid van LSW, LSS en AWF, vertrouwen we echter op densitometrische kwantificering van SYBR Gold-gekleurde polyacrylamidegels. Deze kwantificeringsstap is nodig omdat de extracellulaire fracties een onbekende verontreiniging bevatten - waarschijnlijk polysacchariden - die soms kunnen cozuiveren en interfereren met op absorptie gebaseerde RNA-kwantificeringsmethoden, wat leidt tot een overschatting van de RNA-concentratie. Om deze beperking te overwinnen, zijn we van plan om in ons toekomstige werk niet-fenolgebaseerde RNA-zuiveringsmethoden te gebruiken.

Denaturerende RNA-gelanalyse onthulde de aanwezigheid van een breed scala aan RNA-soorten in LSW en AWF, waaronder zowel lange als kleine RNA's (Figuur 3). Met name werden equivalente RNA-hoeveelheden met succes geïsoleerd uit zowel het bladoppervlak als de apoplastische fracties, waarbij de RNA-hoeveelheden werden genormaliseerd per vers gewicht (FW) van de plant. Verrassend genoeg verschilden de RNA-grootteprofielen van de LSW- en AWF-fracties significant van elkaar en van het profiel van totaal cellysaat (CL) RNA. Deze verschillen suggereren dat de exRNA-fracties niet besmet zijn met cellulair RNA. Van de drie fracties vertoonde het apoplastische RNA (AWF) de grootste diversiteit in grootteverdeling, wat suggereert dat apoplastisch RNA meer gedegradeerd is dan RNA op het bladoppervlak.

Om de aanwezigheid van RNA op het oppervlak van Arabidopsis-bladeren verder te onderzoeken, gebruikten we wattenstaafjes. Deze methode stelde ons in staat om afzonderlijk en sequentieel RNA te verzamelen van de adaxiale (bovenste) en abaxiale (onderste) bladoppervlakken⁶. Uit deze analyses bleek dat beide bladoppervlakken vergelijkbare hoeveelheden RNA bevatten. Bovendien ondersteunt het vermogen om RNA te verzamelen door simpelweg buffer van het bladoppervlak te absorberen zonder dat centrifugeren nodig is, de conclusie dat RNA zich inderdaad op het bladoppervlak bevindt, in plaats van tijdens het centrifugeren via de huidmondjes te worden geëxtraheerd.

Een primaire aanpassing die ons in staat stelde om een overvloedige hoeveelheid RNA van het bladoppervlak te extraheren, was de toevoeging van het bevochtigingsmiddel. We hebben bijna twee keer meer RNA teruggevonden na toevoeging van bevochtigingsmiddel (in een zeer lage concentratie van 0,001%) aan de VIB. Dit verschil in concentratie van RNA verkregen met en zonder Silwet L-77 geeft aan dat het gebruik van een bevochtigingsmiddel het oplossen van RNA op het bladoppervlak verbetert. Het verhogen van de concentratie van het bevochtigingsmiddel van 0,001% naar 0,01% verbeterde de LSW-RNA-isolatie echter niet (Figuur 4). Met name het herhalen van de isolatie van LSW-RNA uit dezelfde bladeren leverde extra RNA op (ongeveer 63% van het herstel verkregen uit de eerste wasbeurt), wat suggereert dat bladeren voortdurend RNA op het oppervlak afscheiden, waarbij bijna tweederde ervan wordt vervangen binnen de ongeveer 30 minuten die nodig zijn om de bladeren te verwerken. Om de totale LSW-RNA-opbrengst te verhogen wanneer het plantmateriaal beperkt is, is het dus mogelijk om dezelfde bladeren meerdere keren achter elkaar te wassen. We raden echter niet meer dan drie wasbeurten aan, omdat de behandeling kan leiden tot cumulatieve schade aan het bladmateriaal, zoals beoordeeld aan de hand van de groene kleur van de wasvloeistof. Voor deze experimenten werd de RNA-concentratie geschat met behulp van op RNA-gel gebaseerde densitometrie-analyse. De hierboven beschreven RNA-kwantificeringsmethode op basis van microtiterplaten kan echter worden gebruikt voor nauwkeurige kwantificering van RNA bij het beoordelen van meerdere monsters tegelijk (Figuur 5).

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe bladoppervlaktewas (LSW), bladoppervlakteuitstrijkje (LSS) en apoplastische wasvloeistof (AWF) kunnen worden geïsoleerd van gezonde Arabidopsis-rozetten, gevolgd door RNA-extractie. Kritieke stappen zijn onder meer de voorbereiding en sterilisatie van VIB voordat het experiment wordt uitgevoerd, het kweken van de planten onder gecontroleerde omstandigheden en het gebruik van Silwet-L77 om ervoor te zorgen dat het bladoppervlak goed wordt bedekt door de VIB. Deze procedures zouden gelijke hoeveelheden RNA moeten opleveren van zowel LSW als AWF, genormaliseerd door het gewicht van verse bladeren. Het terugwinnen van RNA uit deze extracellulaire fracties vereist een zorgvuldige behandeling, vooral met betrekking tot RNA-pellets na neerslagstappen.

Hoewel het bovenstaande protocol is geoptimaliseerd voor Arabidopsis-bladeren, hebben we het ook met succes toegepast op andere plantensoorten met slechts kleine aanpassingen. RNA-extractie uit het bladoppervlak kan worden geoptimaliseerd door twee primaire aanpassingen door te voeren: ten eerste door meerdere LSW-isolatierondes uit te voeren en ten tweede door de concentratie van het bevochtigingsmiddel te verhogen. Plantensoorten met zeer hydrofobe bladoppervlakken, zoals rijst^12,13, kunnen hogere concentraties van het bevochtigingsmiddel nodig hebben.

Daarnaast hebben we een niet-invasieve methode beschreven om RNA van het bladoppervlak te verzamelen met behulp van wattenstaafjes. Met deze RNA-isolatiemethode voor het bladoppervlak zorgen we ervoor dat de opvangbuis in een ijsemmer wordt geplaatst. Aangezien het RNA op het bladoppervlak wordt uitgescheiden en zich ophoopt bij kamertemperatuur, gaan we ervan uit dat het zelfs tijdens het verzamelproces stabiel blijft. We hebben ook de bandingpatronen van LSW en LSS-RNA vergeleken, en die laten niet veel verschil zien in termen van degradatie.

Het bovenstaande protocol maakt gebruik van TRIzol-reagens om RNA te zuiveren van LSW, LSS of AWF. Dit reagens maakt gebruik van fenol om eiwitten te verwijderen. We hebben echter vastgesteld dat zuivering op basis van TRIzol geen polysacchariden zoals pectine verwijdert, die overvloedig aanwezig zijn in LSW en AWF⁶. Dergelijke cozuiverende moleculen kunnen problemen veroorzaken met de kwantificering van RNA met behulp van spectrofotometrie of fluorometrie. We vertrouwen daarom op densitometrie-analyse op basis van RNA-gel om exRNA-concentraties te beoordelen. Op dit moment onderzoeken we zuiveringsmethoden op basis van kolommen die moeten zorgen voor een betere scheiding van RNA uit polysachariden. Deze methoden beperken echter vaak het herstel van kleine RNA's, omdat het silicamembraan is geoptimaliseerd om RNA-moleculen groter dan ~200 nucleotiden te binden. Kleine RNA's kunnen tijdens het binden door het membraan gaan of verloren gaan tijdens wasstappen. Daarom vertrouwen we tot nu toe alleen op de op TRIzol gebaseerde methode voor uitgebreider herstel van alle RNA-groottes, inclusief kleine RNA's, hoewel dit een zorgvuldige behandeling en fasescheiding vereist.

Bovendien zien we bij het uitvoeren van RNA-gelanalyse geen fragmenten kleiner dan 80 nt voor totale cellulaire RNA-monsters in vergelijking met AWF- en LSW-RNA's, voornamelijk vanwege de lage abundantie in vergelijking met de grote hoeveelheden rRNA en tRNA. De aanwezigheid van kleinere banden in de AWF en LSW is te wijten aan de degradatie van de overvloedige rRNA's en tRNA's, die van nature optreedt na de secretie van RNA in het extracellulaire compartiment van planten, en het is geen artefact dat wordt geïntroduceerd tijdens het verzamelen en hanteren van planten, zoals bevestigd door sequencing en northern blot-analyse⁶.

Onze isolatiemethode voor het wassen van het bladoppervlak is een veelzijdig hulpmiddel met een aanzienlijk potentieel voor een breed scala aan onderzoekstoepassingen. Het moet de isolatie van biomoleculen van het bladoppervlak mogelijk maken, zoals RNA, eiwitten en andere metabolieten die centraal kunnen staan bij het begrijpen van de interacties tussen planten en microben. Als identificatie van de microben die aanwezig zijn in AWF en LSW gewenst is, kan dit worden bereikt door filtratie door het 0,22 μm-filter te elimineren.

Planten interageren met een breed scala aan microben, waaronder bacteriën, schimmels en virussen, die complexe gemeenschappen vormen op hun oppervlak¹. Deze microbiële gemeenschappen kunnen ingrijpende effecten hebben op de plantengroei, ziekteresistentie en de verwerving van voedingsstoffen ^2,3,4. Door het wassen van het bladoppervlak met deze methode te isoleren en te analyseren, kunnen onderzoekers exRNA en microbiële metabolieten isoleren, microbiële gemeenschappen op het bladoppervlak identificeren en onderzoeken hoe deze gemeenschappen op moleculair niveau worden gereguleerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
14-30 nt ssRNA ladder marker	Takara	3416
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	20170-038
10 mL needleless syringe	BD	303347
15 mL falcon tubes	VWR	89039-668
15% Mini-PROTEAN TBE-Urea Gel, 10 well/12 well, 30 µL/20 µL	Bio-Rad	4566053 / 4566055
36-cell tray inserts	True Leaf Market
40% acrylamide and bis-acrylamide solution, 37.5:1	Bio-Rad	1610148
4-inch round pots	True Leaf Market
50 mL falcon tubes	VWR	89039-656
50 mL needleless syringe	BD	309653
96 well plate black bottom	Grenier	655090
Acrodisc 0.22 μm syringe filter	Pall	4192
Acrodisc 0.45 μm syringe filter	Pall	4454
Ammonium persulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	C1016
Chloroform (RNase-free)	Macron Fine Chemicals	MK444110
Clear plastic domes	Hummert International	11 3348	Elke plastic dome kan worden gebruikt om de planten te bedekken en de vochtigheid te handhaven
Cotton-tipped stick medical grade	Uline	S-21102
Ethanol (Rnase-free)	Decon Laboratories, Inc.	2716GEA
French Press coffee maker, 24 fl oz	Snow Peak	CS-111
Growing tray without holes 10 x 20	True Leaf Market
Ice bucket	Schuett-Biotech, Spongex	3-680 052
Isopropanol	Thermo Scientific	149320050
JA-14 fixed-angle rotor	Beckman Coulter; model: JA-14	339247
Kimwipes	KCWW, Kimberly-Clark	34120
Low range ssRNA lader	NEB	N0364S
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Microplate reader	BioTek	Synergy H1
Miracle-Gro	Miracle-Gro	24-8-16	Het is een alles-in-één plantenvoeding. Afhankelijk van de grondbron die wordt gebruikt om de planten te laten groeien, kan de toepassing worden aangepast.
Nalgene centifuge bottle 250 mL (w/out cap)	Nalgene	3120
Paper towels
ParaFilm M Lab Film	Parafilm	S-25929
Plastic beaker (500 mL)	Uline	S-21658
RNase-free glycogen (20 mg/mL)	Thermo Scientific	R0561
RootShield Plus WP Biological Fungicide	BioWorks	68539-9
Scissors
Silwet L-77	Phytotech labs	S7777	Elk merk Silwet L-77 kan worden gebruikt. Silwet verliest echter zijn werkzaamheid in de loop van de tijd. Het is ideaal om het eenmaal per jaar te vervangen.
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S7653
Soft nylon hair paint brush	US. Art Supply	No. 6
Spray bottle	Uline	S-7272	Elke spuitfles kan worden gebruikt, maar de spuitinstellingen moeten op douche staan.
Sungro Professional Growing Mix	Sungro
Sungro Propagation Mix	Sungro
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x concentrate in DMSO)	Thermo Scientific	S11494
TEMED	Thermo Scientific	17919
TRIzol reagent	Invitrogen	15596026
Ultrapure Dnase/Rnase-free water	Invitrogen	10977015
Urea	Sigma-Aldrich	U5378
Vacuum chamber, 0.20 Cu. Ft.	SP Scienceware - Bel-Art Products - H-B Instrument	F42031-0000
Vacuum pump, 3.5 CFM	Ideal Vacuum Products	P101532
Weighing scale	Escali	WBB480535	Dit is slechts een voorbeeld. Elke weegschaal kan worden gebruikt.