Methodenartikel

Ex vivo Analyse van één molecuul van ryanodinereceptor 2-assemblage in hart- en neuronaal weefsel

385 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68408

⸱

15 juli 2025

 , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie presenteert een op blaasjes gebaseerde beeldvormingsmethode met één molecuul die de oorspronkelijke receptororganisatie behoudt, waardoor nauwkeurige kwantificering van stoichiometrie en brede toepassingen in receptorassemblage, functie en ziekteonderzoek mogelijk zijn.

Samenvatting

Het begrijpen van receptorassemblage is van cruciaal belang voor het ophelderen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan hun functie en regulatie in fysiologische processen. Hoewel traditionele in vitro studies met één molecuul gebaseerd zijn op het isoleren van eiwitten uit heterologe expressiesystemen, slagen ze er vaak niet in om de in vivo fysiologische complexiteit vast te leggen die betrokken is bij de organisatie en assemblage van celoppervlakte-eiwitten. Dit protocol maakt gebruik van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) om GFP-gelabelde Ryanodine Receptor 2 (RyR2) moleculen te bestuderen die zijn ingekapseld in blaasjes op nanoschaal. Deze blaasjes, gegenereerd uit organen die snel uit het dier worden geëxtraheerd, geven effectief een momentopname van de assemblagetoestand van de receptor op het moment van extractie, waardoor een gedetailleerde analyse van de subeenheidstoichiometrie en receptororganisatie mogelijk is als reactie op veranderingen in de fysiologische omgeving van het dier. Deze benadering maakt gebruik van TIRFM en stapsgewijze fotobleekanalyse om een uitlezing van receptorstoichiometrie te bieden. Beeldvorming van receptoren op het niveau van één molecuul vergemakkelijkt de detectie van heterogeniteit binnen de receptorpopulaties die in een levend dier zijn geassembleerd en maakt het mogelijk om veranderingen in assemblage die verband houden met ziektetoestanden te volgen. Als gevolg hiervan biedt deze methode een krachtig hulpmiddel voor het bepalen van de verdeling van receptorassemblages en hun correlatie met veranderingen in hun fysiologische omgeving.

Inleiding

Membraanreceptoren spelen een cruciale rol in fysiologische processen in het hele menselijk lichaam1. Een primaire functie is het bemiddelen van communicatie tussen cellen door de overdracht van extracellulaire stimuli om intracellulaire signaleringsgebeurtenissen te initiëren. Vanwege hun fundamentele rol bij signalering richt bijna 70% van de bestaande therapieën zich op membraanreceptoren2. Het zijn vaak oligomere structuren die zijn samengesteld uit meerdere subeenheden die zijn geassembleerd tot heteromere vormen met meerdere stoichiometrieën 3,4. Begrijpen hoe receptoren zich organiseren in functionele complexen is van cruciaal belang voor het ophelderen van hun rol in gezondheid en ziekte 5,6. Traditionele biochemische methoden, zoals immunoprecipitatie en western blotting, bieden gemiddelde ensemblemetingen, die de heterogeniteit in receptorsubpopulaties verdoezelen7. Daarentegen maken technieken met één molecuul de directe observatie van individuele receptoren mogelijk, waardoor de heterogeniteit binnen receptorpopulaties kan worden gekwantificeerd 8,9,10. Single-molecule-technieken zijn de standaard geworden om membraanreceptorassemblage, stoichiometrie en oligomerisatie te kwantificeren11,12. Deze benadering is op grote schaal toegepast op veel fysiologisch relevante membraanreceptoren met behulp van geïsoleerde eiwit- of celcultuuromstandigheden. Studies met één molecuul zijn voornamelijk gebaseerd op in vitro expressiesystemen, waarbij eiwitten kunnen worden geïsoleerd uit een cellulaire omgeving. De complexiteit binnen een levend systeem komt echter niet volledig tot uiting in dit soort heterologe expressiesystemen.

Om deze beperkingen te overwinnen, hebben we een aanpak ontwikkeld die membraanreceptoren in een fysiologisch relevante toestand isoleert en in beeld brengt door ze vast te leggen in nanoblaasjes die rechtstreeks zijn afgeleid van hart- en neuronale weefsels. Deze methode behoudt effectief de assemblagetoestand van de receptor op het moment van blaasjesvorming, waardoor de directe visualisatie van de stoichiometrie van de receptorsubeenheid mogelijk is, wat een cruciale indicator is van de respons van de receptor in verschillende fysiologische omgevingen. Deze benadering stelt ons in staat om de stoichiometrische assemblage van membraanreceptoren te onderzoeken die optreden in de complexe biologische omgeving van levende dieren zonder dat heterologe expressie of reconstitutie nodig is. Door gebruik te maken van Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM), bereiken we beeldvorming met een resolutie van één molecuul van met blaasjes ingekapselde receptoren en extraheren we fotobleeksporen om de samenstelling van de subeenheid te bepalen.

TIRFM is zeer geschikt voor beeldvorming van membraaneiwitten met één molecuul omdat het selectief fluoroforen exciteert binnen ~150 nm van het glasoppervlak, waardoor achtergrondfluorescentie van moleculen in oplossing 3,10 wordt verminderd. Deze opsluiting verbetert de signaal-ruisverhouding aanzienlijk, waardoor een nauwkeurige detectie van individuele membraanreceptorcomplexen mogelijk is. Door het stapsgewijs fotobleken van fluorescerend gelabelde receptoren te analyseren, kunnen we de stoichiometrie van de subeenheid direct bepalen en de potentiële heterogeniteit binnen receptorpopulaties beoordelen12. Dit is met name relevant voor ryanodinereceptor 2 (RyR2), een groot intracellulair Ca²⁺-afgiftekanaal dat een cruciale rol speelt bij de excitatie-contractiekoppeling in het hart, waar het zich alleen assembleert als een homo-tetrameer, en bij de synaptische functie in de hersenen, waar de assemblage ervan niet is vastgesteld 1,13,14. Gezien de aanwezigheid van meerdere RyR-isovormen in neuronale weefsels, blijft het onduidelijk of RyR2 puur homomere tetrameercomplexen vormt in de hersenen, bestaande uit vier identieke subeenheden zoals in het hart, of dat heteromere assemblages met RyR1 of RyR3 voorkomen in vivo 15,16,17,18.

Door blaasjes te isoleren uit specifieke delen van het hart en de hersenen, maakt deze methode het mogelijk om mogelijke weefselspecifieke verschillen in de organisatie van RyR2 te onderzoeken. We maken gebruik van de eigenschappen van RyR2 in hartweefsel, waar het alleen homotetrameren kan vormen, om een statistisch robuuste basis te bieden voor ex vivo single-molecule subunit stoichiometrie, en de bekende tetrameerassemblage dient als controle voor het onderzoeken van onbekende assemblages in andere organen. Het vermogen om receptoren in hun oorspronkelijke staat af te beelden met behoud van hun fysiologische interacties biedt een robuust kader voor het bestuderen van receptorassemblage in verschillende organen en onder verschillende fysiologische omstandigheden. Dit protocol beschrijft de workflow voor blaasjesisolatie, immobilisatie en beeldvorming van één molecuul van GFP-gelabeld RyR2, waardoor een nauwkeurige karakterisering van receptorstoichiometrie mogelijk is. Deze techniek vergroot niet alleen ons begrip van de RyR2-organisatie in hart- en neuronale weefsels, maar biedt ook bredere toepassingen voor het bestuderen van receptorassemblage en -regulatie in verschillende fysiologische en pathologische contexten 19,20,21.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

  1. Transcardiale perfusie en orgaanextractie
    1. Verdoof de muis met CO₂ totdat de ademhaling stopt.
    2. Plaats de muis in rugligging en zet de ledematen vast.
    3. Maak een incisie in de middellijn langs de buik en strek deze lateraal uit in de richting van de ribbenkast om de borstholte bloot te leggen.
    4. Steek voorzichtig een naald in de linkerventrikel en doorsnijd het rechter atrium om perfusate drainage mogelijk te maken.
    5. Voor de bereiding van de blaasjes, perfuseer met koude 1x PBS totdat de bloedsomloop is vrijgemaakt.
    6. Voor cryosectie, na PBS-perfusie, ga door met perfunderen met 4% paraformaldehyde (PFA) om weefsels te fixeren.
    7. Haal het hart er voorzichtig uit en leg het direct op ijs.
    8. Knip met een fijne schaar voorzichtig langs de middellijn van de hoofdhuid en pel de huid terug om de schedel bloot te leggen.
    9. Maak een incisie aan de basis van de schedel bij het foramen magnum.
    10. Wrik met een fijne tang voorzichtig de schedel open langs de longitudinale spleet en verwijder botfragmenten om de hersenen bloot te leggen.
    11. Til de hersenen voorzichtig op met behulp van een gebogen tang en snijd de hersenzenuwen door om ze volledig intact te verwijderen.
    12. Indien gebruikt voor cryosectie, fixeer de hersenen dan in 4% PFA bij 4 °C gedurende 24 uur.
    13. Indien gebruikt voor de bereiding van blaasjes, plaats de hersenen dan onmiddellijk op ijs zonder fixatie voor verdere verwerking.
  2. Cryosectie
    1. Verwijder de hersenen of het hart van 4% PFA en dep droog.
    2. Veranker het hele orgaan in een OCT-verbinding in een cryomold.
    3. Vries het ingebedde weefsel in door de vorm in een vriezer van -80 °C te plaatsen tot deze volledig is gestold.
    4. Vóór het snijden moeten de cryostaatkamer en de kop van het monster in evenwicht worden gebracht tot -20 °C.
    5. Breng het bevroren OCT-blok van de vriezer van -80 °C over naar de cryostaatkamer en laat het 10 minuten in evenwicht zijn.
    6. Reinig de klauwplaat met 70% ethanol, droog deze af en breng een dunne laag OCT aan als lijm.
    7. Bevestig het bevroren OCT-blok op de boorkop en zorg voor de juiste richting.
    8. Steek de klauwplaat in de houder van het cryostaatmonster en pas de positie van het mes aan.
    9. Knip overtollige OCT weg totdat het weefseloppervlak bloot komt te liggen.
    10. Snijd het weefsel in met een dikte van 10 μm en verzamel secties op glasplaatjes.
    11. Nadat de secties 1 uur aan de lucht zijn gedroogd bij kamertemperatuur, brengt u montagemedia aan op de secties en plaatst u een dekglaasje om het monster af te dichten.
    12. Laat de montagemedia uitharden voordat u de objectglaasjes bij 4 °C opbergt voor beeldvorming.
  3. Bereiding van blaasjes
    1. Voorbereiding van het hartblaasje
      1. Extraheer het hart na transcardiale perfusie met 1x PBS en leg het op ijs.
      2. Ontleed met een steriel scalpel ongeveer 30 mg ventriculaire spier vanaf de onderkant van het hart.
      3. Breng het weefsel over naar een centrifugebuis met 4-5 ml 10 mM NaHCO₃ met 5 mM NaN₃ om de integriteit van de blaasjes te behouden.
      4. Homogeniseer het weefsel met behulp van een homogenisator tot het volledig gelyseerd is.
      5. Centrifugeer het homogenaat bij 10.000 × g gedurende 20 minuten om groot vuil te verwijderen en het supernatant op te vangen.
      6. Voer ultracentrifugatie uit bij 37.000 g × gedurende 65 minuten, gooi vervolgens het bovenstaande weg en suspendeer de pellet opnieuw in 3-4 ml 20 mM Trismaleaatbuffer (pH 6,8) met 0,6 M KCl.
      7. Herhaal de ultracentrifugatie bij 37.000 × g gedurende nog eens 65 minuten om opgeloste actomyosine te verwijderen.
      8. Resuspendeer de laatste pellet in 0,5 ml 20 mM trismaleaatbuffer (pH 6,8) met 50 mM KCl om de oplossing van het hartblaasje te verkrijgen en bewaar deze bij -80 °C.
    2. Voorbereiding van het hersenblaasje
      1. Extraheer de hersenen na transcardiale perfusie met 1x PBS en plaats deze op ijs.
      2. Snijd de hersenen in secties van 1 mm met behulp van een coronale matrix van de muizenhersenen van 1 mm.
      3. Identificeer het derde en vierde deel van de bulbus olfactorius en ontleed zorgvuldig: 1) de buitenste corticale laag van beide hemisferen; 2) de hippocampus, gelegen in het centrale gebied van de sectie.
      4. Isoleer vanaf het achterste uiteinde het cerebellum door een dwarse snede aan de basis te maken.
      5. Bundel dezelfde hersengebieden van vijf muizen om te zorgen voor voldoende blaasjes.
      6. Homogeniseer het weefsel onmiddellijk met behulp van een Dounce-homogenisator in 2 ml koude homogenisatiebuffer (0,32 M sucrose, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA, proteaseremmer, pH 7,4).
      7. Voeg 3 ml extra homogenisatiebuffer toe en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 200 × g om grote weefselfragmenten te verwijderen.
      8. Verzamel het bovenstaande en centrifugeer bij 1.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C om de kernfractie te verwijderen.
      9. Centrifugeer het bovenstaande vervolgens gedurende 20 minuten bij 10.000 × g bij 4 °C om de mitochondriën te verwijderen.
      10. Ultracentrifugeer het resulterende supernatans bij 100.000 g × gedurende 2 uur bij 4 °C om de blaasjes te pelleteren.
      11. Resuspendeer de uiteindelijke blaasjeskorrel in 1x PBS om de oplossing van het hersenblaasje te verkrijgen en bewaar deze bij -80 °C.
  4. Karakterisering van nanovesikels via Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)
    1. Monteer de detectiecel volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Schakel het instrument in en start de compatibele software.
    3. Vul een spuit van 1 ml met gedeïoniseerd (DI) water en spoel de systeemslang handmatig door totdat de achtergrond vrij is van verontreinigingen.
    4. Bereid het nanoblaasjesmonster voor door het te verdunnen in 1x PBS.
    5. Laad ~1 ml van het verdunde nanoblaasjesmonster in een schone spuit van 1 ml en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
    6. Injecteer het monster handmatig in de detectiecel en pas de focus aan totdat de blaasjes duidelijk zichtbaar zijn.
    7. Bevestig de spuit op de spuitpomp en stel het debiet in op 200 μl/s in het hardwarepaneel.
    8. Stel in het SOP-paneel de meetduur in op 60 s, het aantal cycli op 5 en controleer of de temperatuurregeling is ingeschakeld en ingesteld op 25 °C. Sla de instellingen op als een nieuwe SOP door op Save SOP te klikken en het bestand de juiste naam te geven (bijvoorbeeld 'nanovesicle_standard.sop').
    9. Configureer in het deelvenster Vastleggen de instrumentinstellingen door een cameraniveau van 13 en een initiële detectiedrempel van 3 te selecteren.
    10. Klik op Uitvoeren en selecteer de eerder opgeslagen SOP. De software voert de meting automatisch uit volgens de instellingen.
    11. Als u klaar bent, klikt u op Analyseren om elke video te verwerken. Pas de detectiedrempel aan om ervoor te zorgen dat alle deeltjes duidelijk zichtbaar zijn en klik op Voltooien nadat de batchanalyse is voltooid. Exporteer het resultaat door te klikken op Gegevens exporteren | Alle metingen en opslaan als een CSV-bestand voor later gebruik.
    12. Spoel na voltooiing van het experiment het systeem door met ~ 2 ml DI-water totdat er geen resterende blaasjes meer zijn.
    13. Injecteer lucht door de slang om eventuele resterende vloeistof te verwijderen en zorg ervoor dat het systeem droog is voor het volgende gebruik.

2. Beeldvorming

  1. Confocale beeldvorming van weefselcryosecties
    1. Schakel de confocale lasermicroscoop in en open de gekoppelde software.
    2. Selecteer het juiste objectief (20x lucht of 60x olie) en laad het voorbereide cryosectieglaasje op de microscooptafel.
    3. Configureer de laserinstellingen voor GFP-excitatie met behulp van een laserlijn van 488 nm met een emissiefilter van 535/70 nm.
    4. Optimaliseer beeldvormingsparameters, waaronder de grootte van de gaatjes (28,9 μm), de laserintensiteit (17%) en de detectorversterking (15,3), om de signaal-ruisverhouding te verbeteren en fotobleken te minimaliseren.
    5. Verkrijg indien nodig een Z-stack door de bovenste en onderste brandpuntsvlakken in te stellen en de juiste stapgrootte (0,275 μm) te definiëren.
    6. Schakel geautomatiseerde beeldstitching in met een overlapping van 15% bij het verkrijgen van afbeeldingen met een groot gebied.
    7. Pas de beeldresolutie aan en pas indien nodig framemiddeling toe om achtergrondgeluid te verminderen.
    8. Leg afbeeldingen vast en sla ze op in '.nd2'-formaat voor verdere analyse.
  2. Totale interne reflectiefluorescentie (TIRF) beeldvorming
    1. Immobilisatie van blaasjes via biocompatibel anker voor membraan (BAM) methode22
      1. Reinig de schalen met glazen bodem van 35 mm door ze gedurende 1 uur bij 45 °C te soniceren in 5 M NaOH, gevolgd door drie grondige spoelingen met DI-water.
      2. Sonificeer de gerechten in 0,1 M HCl gedurende nog eens 1 uur bij 45 °C, gevolgd door drie extra spoelingen met gedemineraliseerd water.
      3. Behandel het gereinigde glasoppervlak met 2% 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om amine-functionele groepen te introduceren.
      4. Spoel de schaal 3x af met DI water en ethanol om overtollige APTES te verwijderen en laat het drogen.
      5. Incubeer de schaal met 100 μM Oleyl-O(CH₂CH₂)nCO-CH₂CH₂-COO-NHS (Sunbright OE-020CS) in 1x PBS gedurende 10 min.
      6. Was de schaal met PBS om niet-gereageerd reagens te verwijderen.
      7. Breng blaasjes in de gewenste concentratie aan en incubeer gedurende 15 minuten om de blaasjes te binden.
      8. Spoel de schaal voorzichtig af met PBS om ongebonden blaasjes te verwijderen en zorg ervoor dat de geïmmobiliseerde blaasjes blijven zitten.
    2. Opstelling en acquisitie van TIRF-beeldvorming
      1. Schakel de omgekeerde fluorescentiemicroscoop, de laserbron van 488 nm en de EMCCD-camera in.
      2. Start Metamorph- en CellSens-software om beeldvorming te initialiseren.
      3. Reinig het 60x olie-immersiedoel (1.49 NA APO) met methanol om stof en achtergebleven olie te verwijderen.
      4. Breng een kleine druppel brekingsindex (RI) overeenkomende onderdompelingsolie aan op de objectieflens.
      5. Plaats de voorbereide blaasjesschaal op de microscooptafel en zorg ervoor dat deze gecentreerd is voor een optimale uitlijning.
      6. Pas de focus van de laserstraal aan door de excitatiestraal in het midden van de achteropening van het objectief te centreren in de epifluorescentiemodus.
      7. Gebruik de stappenmotor om de invalshoek van de laser aan te passen totdat de kritische hoek is bereikt, waardoor totale interne reflectie op het glasoppervlak wordt gegarandeerd.
      8. Identificeer het brandpuntsvlak door door de Z-as te scannen en onderscheid te maken: 1) het eerste scherpstelvlak, dat overeenkomt met het oppervlak van de glasbodem; 2) het tweede focusvlak, dat overeenkomt met het met blaasjes geïmmobiliseerde oppervlak.
      9. Zodra de blaasjes scherp zijn, past u autofocus toe in CellSens om de objectiefpositie op dit vlak te vergrendelen, waardoor drift tijdens de beeldvorming wordt voorkomen.
      10. Schakel de laser tijdelijk uit en verplaats de microscooptafel naar een nieuw gezichtsveld dat nog niet is blootgesteld aan excitatielicht.
      11. Begin met opnemen terwijl u tegelijkertijd de laser inschakelt, zodat u het volledige fotobleekproces kunt vastleggen zonder voorafgaande belichting.
      12. Verkrijg afbeeldingen met de volgende parameters: Belichtingstijd: 100 ms per frame, Acquisitiemodus: 900 continue frames per gezichtsveld, Versterkingsinstelling: 1.400.
      13. Herhaal het proces voor meerdere gezichtsvelden om ervoor te zorgen dat er voldoende gegevens worden verzameld.
      14. Sla afbeeldingsstapels op in TIFF-formaat voor verdere verwerking.

3. Beeldverwerking en data-analyse

  1. Confocale beeldverwerking
    1. Open de verkregen confocale afbeeldingen in de gekoppelde software.
    2. Pas de instellingen van de Look-Up Table (LUT) aan om de helderheid en het contrast te optimaliseren.
    3. Pas dezelfde LUT-aanpassingen gelijkmatig toe op alle afbeeldingen om de visuele consistentie te behouden.
  2. TIRF-videoverwerking en analyse van fluorescentie-intensiteit
    1. Videoverwerking voor visualisatie
      1. Open de verkregen TIRF-afbeeldingstacks (TIFF-indeling) in ImageJ voor visualisatie.
      2. Pas de helderheid en het contrast aan om de helderheid van het signaal te verbeteren, zodat fluorescerende blaasjes gemakkelijk te onderscheiden zijn van de achtergrond.
      3. Exporteer aangepaste afbeeldingen voor presentatie of verdere kwalitatieve analyse.
    2. Analyse van de fotobleekstap
      1. Tijdsporen extraheren
        1. Open het MATLAB-script (zie aanvullend bestand 1) met de naam "getTimeTraces.m" en voer het uit. Klik in de grafische gebruikersinterface (GUI) op Film laden en selecteer het TIRF-beeldvormingsbestand .tiff om de filmstapel van de blaasjes te importeren.
        2. Klik op Pieken zoeken om automatisch fluorescentiesignalen met één molecuul te identificeren. Signaalgebieden worden gemarkeerd met cirkels in het voorbeeldvenster.
        3. Klik op Gegevens invullen. Hiermee wordt het tijdintensiteitsspoor voor elke plek geëxporteerd naar een .xlsx bestand voor stroomafwaartse analyse.
      2. Handmatige stappentelling
        1. Voer het script "simpleGraph.m" uit (zie Aanvullend bestand 1) om de GUI te starten, klik op Gegevensbestanden laden en selecteer het .xlsx bestand dat in stap 3.2.2.1.3 is gegenereerd.
        2. Inspecteer de bleekstappen van elk tijdspoor dat in het linkerdeelvenster wordt weergegeven. Zorg ervoor dat alleen sporen die aan de volgende criteria voldoen, worden geaccepteerd voor analyse: 1) het tijdspoor bevat ten minste één afzonderlijke bleekstap. 2) De duur van één stap is minimaal 1 s. 3) Het intensiteitsverschil tussen stapniveaus is minimaal 3x de standaarddeviatie van de intensiteit na het bleken.
        3. Zoek aan de rechterkant het veld Stap # en gebruik de knoppen + of - om het aantal fotobleekstappen voor elk spoor in te voeren.
        4. Nadat u elke invoer hebt voltooid, klikt u op Volgende om naar de volgende tracering te gaan. Zodra alle sporen zijn verwerkt, genereert en bewaart de software automatisch een .txt bestand waarin het aantal stappen van elk spoor wordt vastgelegd.
      3. Samenvatting van het aantal stappen
        1. Voer het script "CombinedFiles.m" uit (zie Aanvullend bestand 1) om de GUI te openen.
        2. Typ de gewenste naam voor de samenvattingsuitvoer in het tekstvak.
        3. Klik op Meerdere simpleGraph-resultaten combineren tot één bestand. Selecteer in de bestandsbrowser een of meer gewenste .txt bestanden die zijn gegenereerd uit stap 3.2.2.2.3. Het script compileert automatisch alle gegevens over het aantal stappen en genereert een gecombineerd .xlsx-bestand met een samenvatting van de frequentie van 1-staps, 2-staps,... Sporen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om de toepasbaarheid van deze methode te bevestigen, hebben we eerst de expressie en lokalisatie van GFP-RyR2 geverifieerd door middel van confocale beeldvorming van cryosecties van hart- en neuronaal weefsel (Figuur 1). Het fluorescentiesignaal in hartweefsel vertoonde een dwarsgestreept patroon dat consistent was met de verwachte lokalisatie van RyR2 in cardiomyocyten, maar vertoonde een hoge intensiteit in bepaalde regio's...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie stelt een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol op voor ex vivo inkapseling en single-molecule beeldvorming van membraanreceptoren met behulp van GFP-gelabeld RyR2 als modelsysteem. Het protocol bevordert de huidige methoden aanzienlijk door stoichiometrische analyse van receptorcomplexen rechtstreeks uit natuurlijk weefsel mogelijk te maken, waardoor de fysiologische context van membraaneiwitten behouden blijft. Vergeleken met traditionele in vitro expressiesyst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

We willen graag de UKY Light microscopy core en het Bioelectronics and Nanomedicine Center bedanken voor het gebruik van hun faciliteiten. Ondersteuning voor dit werk werd geboden door de NIH (GM138837 en GM138882). Figuur 2 (https://BioRender.com/s69w811) en Figuur 3 (https://BioRender.com/y54b47) zijn gemaakt in BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass DiameterMattekP35G-1.5-14-C
Andwin Scientific Tissue-Tek Cryomold Molds/AdaptersFisher ScientificNC9542860
APTESMillipore Sigma440140-100ML(3-aminopropyl)triethoxysilaan
Bio-Gen PRO200 Laboratory HomogenizerPro Scientific1204B59
cellSENSOlympus Scientific Solutionsn/a
EMCCD cameraAndorn/aiXon Ultra 897
Ethanol absoluut ≥100% (v/v) USP voor moleculaire biologie (200 Proof)VWR71006-012
Leica CM1860Leican/acryostat
MetaMorph AdvancedMolecular Devicesn/a
Nanosight NS300 (met Nanosight NTA-software)Malvern Panalyticaln/a
Nikon AXR Inverted Confocal MicroscopeNikonn/a
Olympus IX83 gemotoriseerde autofocus geïnverteerde fluorescentiemicroscoopOlympusn/aTIRFM
Paraformaldehyde 4% in PBS klaar voor gebruik fixeermiddelVWR76221-378
Fosfaatbufferoplossing (PBS) 20x, Ultra Pure GradeVWR97062-950
Natriumhydroxide, korrels, Reagent GradeVWR97064-526
SUNBRIGHT OE-020CS +NOF America Corporationn/aOleyl-O(CH2CH2)nCO-CH2CH2-COO-NHS
Tissue-Tek O.C.T. CompoundSakuraM71484
VectaMount AQ Aqueous Montage MediumVector LaboratoriesH-5501-60

Referenties

  1. Taur, Y., Frishman, W. H. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) and its role in heart disease. Card Rev. 13 (3), 142-146 (2005).
  2. Lundstrom, K. Structural genomics and drug discovery. J Cell Mol Med. 11 (2), 224-238 (2007).
  3. Levitz, J., et al. Mechanism of assembly and cooperativity of homomeric and heteromeric metabotropic glutamate receptors. Neuron. 92 (1), 143-159 (2016).
  4. Fox-Loe, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. Organelle-specific single-molecule imaging of α4β2 nicotinic receptors reveals the effect of nicotine on receptor assembly and cell-surface trafficking. J Bio Chem. 292 (51), 21159-21169 (2017).
  5. Degani-Katzav, N., Gortler, R., Gorodetzki, L., Paas, Y. Subunit stoichiometry and arrangement in a heteromeric glutamate-gated chloride channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (5), E644-E653 (2016).
  6. Aryal, S. P., Fu, X., Masud, A. A., Neupane, K. R., Richards, C. I. Single-molecule studies of membrane receptors from brain region specific nanovesicles. Bio-protocol. 11 (10), e4018(2021).
  7. Schneeweis, L. A., et al. Comparison of ensemble and single molecule methods for particle characterization and binding analysis of a pegylated single-domain antibody. J Pharm Sci. 104 (12), 4015-4024 (2015).
  8. Hines, K. E. Inferring subunit stoichiometry from single molecule photobleaching. J Gen Phys. 141 (6), 737-746 (2013).
  9. Lee, J., Lee, T. H. Single-molecule investigations on histone h2a-h2b dynamics in the nucleosome. Biochem. 56 (7), 977-985 (2017).
  10. Aggarwal, V., Ha, T. Single-molecule pull-down (SiMPull) for new-age biochemistry: methodology and biochemical applications of single-molecule pull-down (SiMPull) for probing biomolecular interactions in crude cell extracts. Bioessays. 36 (11), 1109-1119 (2014).
  11. Sungkaworn, T., et al. Single-molecule imaging reveals receptor-g protein interactions at cell surface hot spots. Nature. 550 (7677), 543-547 (2017).
  12. Fu, X., et al. Brain region specific single-molecule fluorescence imaging. Anal Chem. 91 (15), 10125-10131 (2019).
  13. Anderson, K., et al. Structural and functional characterization of the purified cardiac ryanodine receptor-Ca2+ release channel complex. J Bio Chem. 264 (2), 1329-1335 (1989).
  14. Waddell, H. M. M., Mereacre, V., Alvarado, F. J., Munro, M. L. Clustering properties of the cardiac ryanodine receptor in health and heart failure. J Mol Cell Card. 185, 38-49 (2023).
  15. Peng, W., et al. Structural basis for the gating mechanism of the type 2 ryanodine receptor ryr2. Science. 354 (6310), aah5324(2016).
  16. Xiao, B., et al. Isoform-dependent formation of heteromeric Ca2+ release channels (ryanodine receptors). J Bio Chem. 277 (44), 41778-41785 (2002).
  17. Xu, L., Wang, Y., Yamaguchi, N., Pasek, D. A., Meissner, G. Single channel properties of heterotetrameric mutant ryr1 ion channels linked to core myopathies. J Biol Chem. 283 (10), 6321-6329 (2008).
  18. Chagovetz, A. A., Klatt Shaw, D., Ritchie, E., Hoshijima, K., Grunwald, D. J. Interactions among ryanodine receptor isotypes contribute to muscle fiber type development and function. Dis Model Mech. 13 (2), dmm038844(2019).
  19. Yao, J., et al. Limiting RyR2 open time prevents Alzheimer's disease-related neuronal hyperactivity and memory loss but not β-amyloid accumulation. Cell Rep. 32 (12), 108169(2020).
  20. Hiess, F., et al. Subcellular localization of hippocampal ryanodine receptor 2 and its role in neuronal excitability and memory. Comm Biol. 5 (1), 183(2022).
  21. Clowsley, A. H., et al. Analysis of RyR2 distribution in HEK293 cells and mouse cardiac myocytes using 3D MINIFLUX microscopy. bioRxiv. , (2023).
  22. Kato, K., et al. Immobilized culture of nonadherent cells on an oleyl poly(ethylene glycol) ether-modified surface. Biotech. 35 (5), 1014-1021 (2003).
  23. Yin, Q., Aryal, S. P., Song, Y., Fu, X., Richards, C. I. Quantitative single-molecule analysis of ryanodine receptor 2 subunit assembly in cardiac and neuronal tissues. Anal Chem. 96 (41), 16298-16306 (2024).
  24. Moonschi, F. H., et al. Cell-derived vesicles for single-molecule imaging of membrane proteins. Angew Chem Int Ed. 54 (2), 481-484 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Totale interne reflectiehartweefselreceptorassemblagestapsgewijs fotoblekenGFP labelingnanovesikelsreceptorschoichiometrie
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen