Dit protocol beschrijft de CTAB-methode om hoogwaardige DNA uit mycobacteriën te extraheren, waarbij de uitdagingen van hun harde, mycolinezuurrijke celwanden worden overwonnen. Het proces omvat enzymatische vertering, cellysie met CTAB en DNA-zuivering door organische extractie en ethanolprecipitatie. Deze methode produceert DNA dat geschikt is voor moleculaire studies en is betrouwbaar voor mycobacterieel onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie van het volledige genoom van deoxyribonucleïnezuur uit Mycobacterium-soorten via de Cetyltrimethylammoniumbromide-techniek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Efficiënte en betrouwbare DNA-extractie is een fundamentele stap in de moleculaire biologie, waarbij hoogwaardig genetisch materiaal wordt geleverd voor latere toepassingen zoals PCR, sequencing en genomische analyses. De unieke celwandsamenstelling van mycobacteriën, rijk aan lipiden en mycolinzuren, vormt echter aanzienlijke uitdagingen voor efficiënte DNA-isolatie. De cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)-methode wordt veel toegepast vanwege de efficiëntie bij het extraheren van hoogzuiver DNA uit mycobacteriesoorten, waaronder zowel snel- als langzaam groeiende stammen. De techniek omvat enzymatische verstoring van bacteriële cellen met behulp van lysozym en proteïnase K, gevolgd door de lyse van celcomponenten met CTAB, die selectief bindt en een complex vormt met polysacchariden en eiwitten. DNA-zuivering en -concentratie worden bereikt door organische oplosmiddelextractie en ethanolprecipitatie. Volgens onze gegevens levert het CTAB-protocol hoge hoeveelheden DNA op (200 - 1000 ng/μL) met hoge kwaliteit en minimale besmetting, zoals bewezen door gelelektroforese en NanoDrop-analyse. Het DNA dat uit verschillende mycobacteriële soorten wordt gewonnen, is van hoge zuiverheid en geschikt voor diverse moleculaire studies. Deze studie toont de procedurele stappen van de CTAB-methode aan en benadrukt het nut ervan bij het overwinnen van de unieke uitdagingen die gepaard gaan met mycobacteriële DNA-extractie.
Inleiding
Het extraheren van hoogkwalitatief goed DNA is een fundamentele stap in de moleculaire biologie, essentieel voor latere toepassingen zoals PCR, whole genome sequencing en andere genomische studies. Voor Mycobacterium, een geslacht dat zowel pathogene soorten omvat zoals Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) als niet-pathogene omgevingssoorten zoals Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), kan DNA-extractie lastig zijn vanwege hun dikke, lipidenrijke en hydrofobe celwanden 1,2,3. Deze sterke celwand vereist het gebruik van gespecialiseerde lysemethoden om de cellen te verstoren en effectief genomisch DNA vrij te geven.
De cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)-methode is betrouwbaar gebleken voor het isoleren van hoogwaardig DNA van verschillende mycobacteriesoorten 4,5. CTAB, een cationisch tenactivist, bindt aan polysacchariden en andere celcomponenten, waardoor hun verwijdering tijdens het extractieprocesmogelijk wordt 6. Zelfs bij moeilijke monsters zorgt het CTAB-gebaseerde protocol voor efficiënte isolatie van intact en puur DNA, vooral in combinatie met enzymatische lyse, warmtebehandeling en organische oplosmiddelextracties 7,8. De CTAB-methode heeft een cruciale rol gespeeld in efficiënte DNA-extractie uit mycobacteriële soorten, specifiek voor onderzoek naar whole-genome sequencing, metagenomics en moleculaire diagnostiek, waarvoor zuiver en hoogwaardig DNA-inputmateriaal nodig is. In vergelijking met andere DNA-extractietechnieken zoals bead-beating of commerciële kits, biedt het hier gepresenteerde CTB-protocol een duidelijk voordeel bij het behouden van DNA-integriteit, een essentiële factor voor long-read sequencing en epigenetische toepassingen. Hoewel eerdere studies lagere DNA-opbrengsten met CTAB hebben gerapporteerd ten opzichte van mechanische verstooringsmethoden, benadrukken ze ook het vermogen om DNA-afschuiving te minimaliseren en DNA-integriteitte behouden 11,12. Om beperkingen in zuiverheid en opbrengst aan te pakken, is het huidige protocol geoptimaliseerd met kortere incubatietijden en verbeterde consistentie tussen diverse monstertypes. Deze verfijning werd ondersteund door bevindingen van Opperman et al., die aantoonden dat door CTAB geëxtraheerd DNA uit Mycobacterium avium-culturen voldoende concentratie en kwaliteit had voor downstream toepassingen zoals 16S rRNA-sequencing en lijnprobe-assays, wat de toepassing van het CTAB-protocol als veelzijdig en schaalbaar hulpmiddel voor mycobacterieel onderzoek verder ondersteunde, met name in studies die intact genomisch DNA vereisen voor geavanceerde moleculaire analyses13. Daarnaast vereist next-generation sequencing (NGS) doorgaans 100-1000 ng hoogwaardige genomische DNA14 en in het geval van long-read sequencing, zoals PacBio-sequencing, ≥5 μg hoogwaardige DNA15, dus wanneer grote hoeveelheden hoogwaardige en intacte DNA nodig zijn, blijft CTAB een effectieve methode16.
Het opzetten van efficiënte, consistente en effectieve DNA-extractiemethoden van moeilijk te analyseren microben is noodzakelijk om reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid in laboratoria te waarborgen, met name voor stamidentificatie en epidemiologische studies 5,7. Dit protocol geeft details voor het extraheren van volledig genoom-DNA uit Mycobacteriën met behulp van de CTAB-methode. Het huidige protocol is bedoeld om onderzoekers in staat te stellen consistente en betrouwbare resultaten te behalen in hun moleculaire biologische workflows door de valkuilen aan te pakken en de uitdagingen van de kenmerkende mycobacteriële celwand17 te overwinnen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De representatieve resultaten zijn gegenereerd met goedkeuring van de REC: BES ethische commissie, Universiteit Stellenbosch (BES-2024-22504). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Bereiding van mycobacteriële cultuursuspensie
OPMERKING: Afhankelijk van de te onderzoeken soort moet deze stap worden uitgevoerd in een Biosafety niveau 2 (BSL-2) of een Biosafety niveau 3 (BSL-3) laboratorium. De broedtijd en omstandigheden van de kweek hangen ook af van de groeibehoeften van de mycobacteriële soort, vanwege hun verschillende groeisnelheden en fysiologische kenmerken.
- Bereid 5 mL of 8 mL bacteriële cultuur voor in respectievelijk Middlebrook 7H9 vloeibare media of MGIT-media, aangevuld met OADC, en incubeer bij 37 °C gedurende de vereiste periode om bacteriële groei mogelijk te maken. Langzaam groeiende mycobacteriën hebben 10-14 dagen nodig, terwijl snelgroeiende mycobacteriën ongeveer 2-5 dagen nodig hebben.
OPMERKING: Een suspensie van mycobacteriële cellen kan worden bereid door een lus vol kolonies in steriel dubbel gedestilleerd water te schrapen als de startcultuur afkomstig is van solide agarplaten (bijv. Middlebrook 7H10 agar). - Giet de vloeibare cultuur in 15 mL buizen.
- Verbrand de cultuur bij 80 °C gedurende 1 uur in een broedmachine.
- In het geval van Mycobacterium tuberculosis of andere pathogene soorten die BSL-3 vereisen, wordt de door hitte gedode culturen overgebracht naar het BSL-2 laboratorium.
2. Celwandvertering en DNA-extractie
OPMERKING: Zodra de kweek door warmte is geïnactiveerd, kunnen de volgende stappen veilig worden uitgevoerd in een Biosafety niveau 2 (BSL-2) laboratorium. Als het doel extractie is voor long-read sequencing of alternatieve toepassingen die hoog molecuulgewicht DNA vereisen, zorg dan dat je brede pipetpunten gebruikt en bij vortexstappen vortex vervangt door inversie of pipetmenging.
- Centrifugeer de 15 mL buis op 3220 x g gedurende 15-30 minuten bij kamertemperatuur (RT). Gooi het doorzichtige supernatant weg (zorg dat al het medium verwijderd is).
- Suspensieer de kweekpellet grondig opnieuw in 300 μL Tris-EDTA (TE) buffer.
- Breng de opnieuw gesuspendeerde pellet over in een 2 mL buis.
- Voeg 100 μL lysozym (10 mg/mL) toe en meng door 5 keer op en neer te pipetten, en tik dan voorzichtig op de buis om een gelijkmatige verspreiding te garanderen.
- Incubeer het mengsel bij 37 °C op een roterende broedmachine 's nachts (~16 uur; een lagere incubatietijd kan de lyse-efficiëntie verlagen en zo leiden tot een lage DNA-opbrengst).
- De volgende dag bereid je een mengsel van 5 μL proteïnase K (10 mg/mL) en 70 μL van 10% SDS. Als er bijvoorbeeld vijf monsters zijn, bereid dan 350 μL van 10% SDS en 25 μL van Proteinase K voor. Meng door de buis om te keren om schuimvorming te voorkomen.
- Voeg 75 μL van het mengsel toe aan elk monster.
- Meng door te tappen en te incuberen op 65 °C gedurende 10 minuten in een broedmachine of verwarmingsblok, met intermitterende menging door inversie te doen.
- Voeg 100 μL van 5 M NaCl toe.
- Voeg 100 μL voorverwarmde CTAB/NaCl-oplossing toe bij 65 °C.
OPMERKING: Verhit de CTAB/NaCl-oplossing tot 65 °C voordat je de nauwkeurigheid van het pipetteren verzekert, rekening houdend met de viscositeit van de stof bij RT. - Meng door te tappen tot de oplossing melkachtig wordt.
- Incubeer op 65 °C gedurende 10 minuten in een broedmachine of verwarmingsblok, met intermitterende menging door inversie.
- Voeg een gelijk volume (~ 675 μL) chloroform/isoamylalcoholoplossing (24:1) toe aan elk monster en meng door te tappen.
OPMERKING: Voer deze stap uit in een dampkap, want chloroform is giftig bij inademing en vereist voorzichtige behandeling. - Centrifugeer de monsters op 12000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspireer zorgvuldig 550-600 μL van de waterige (bovenste) fase in steriele 1,5 mL buizen en label deze op de juiste manier.
OPMERKING: Wees voorzichtig dat je de andere lagen niet verstoort. Als er per ongeluk lagen worden verstoord, centrifugeer dan de buis opnieuw.
3. DNA-precipitatie en elusie
- Voeg een gelijk volume (550-600 μL) ijskoude isopropanol toe en meng door de buizen om te keren.
OPMERKING: Als de DNA-concentratie hoog is, kan er witte neerslag ontstaan tijdens het mengen. - Incubeer de buizen bij -20 °C gedurende 30 minuten tot 1 uur.
OPMERKING: Langere incubatietijden kunnen de DNA-precipitatie18 verhogen, maar kunnen ook leiden tot het samenvoegen van zouten. Daarom kan een nachtelijke incubatie worden uitgevoerd als een lage DNA-concentratie wordt verwacht. - Centrifugeer op de hoogste snelheid (~21130 x g) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om het onoplosbare DNA te pelletten.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de voorzijde van de 1,5-buis naar binnen wijst in de centrifugerotor. In deze stap slaat het DNA neer aan de onderkant en langs de achterkant van de buizen. Dit is belangrijk om te voorkomen dat het mogelijk onzichtbare pelletje in de volgende stap wordt verstoord. Een wit neerslag of pelletje kan zichtbaar zijn als de DNA-concentratie hoog is. Het ontbreken van een pellet duidt niet op een mislukte extractie; Ga verder met de resterende stappen. - Aspireer het supernatant aan de voorzijde van de buis zonder de DNA-pellet te verstoren of snel te decanteren, terwijl je ervoor zorgt dat de pellet ongestoord blijft.
OPMERKING: Het is beter om het supernatant te aspireren als de startcultuur klein is en een lage DNA-concentratie wordt verwacht. - Voeg 1000 μL ijskoude 75% ethanol toe.
- Meng door de buizen meerdere keren om te draaien.
- Centrifugeer op 12000 × g gedurende 30 minuten (in dezelfde oriëntatie als in stap 3).
- Aspireer of decant alle ethanol zonder de pellet te verstoren.
OPMERKING: Stappen 5-8 kunnen worden herhaald als er een hoge zout-coprecipitatie wordt verwacht. - Laat de buizen een nacht of minstens 30 minuten aan de lucht drogen bij RT.
- Voeg 25-50 μL TE-buffer (pH 8) toe aan elke buis om het DNA opnieuw te laten ophangen.
OPMERKING: Het DNA kan opnieuw worden gesuspendeerd in een Tris (10 mM, pH 8) buffer of nucleasevrij water als downstream toepassingen gevoelig zijn voor EDTA. - Laat de DNA-pellet een nacht opnieuw suspenderen bij 4 °C.
- Bewaar 2-3 dagen op 4 °C voordat je een kwaliteitscontrole uitvoert.
- Bewaar op -80 °C voor de lange termijn.
4. DNA-kwantificatie en kwaliteitscontrole
OPMERKING: DNA-kwaliteitscontrole wordt doorgaans uitgevoerd met een microvolumespectrofotometer en gelelektroforese. Een fluorescentie-gebaseerd kwantificatiesysteem kan ook worden gebruikt om geëxtraheerd DNA te kwantificeren.
- Spectrofotometermethode
- Meet de DNA-concentratie en bepaal de kwaliteit volgens de instructies van de fabrikant.
OPMERKING: Een DNA-monster heeft idealiter een verhouding van 260/280 tussen 1,7 en 2,0. Een waarde van 1,8 wordt meestal als puur beschouwd voor DNA. Waarden onder dit bereik geven aan dat er besmetting is met residueel eiwit, guanidine of andere reagentia die sterk worden opgenomen bij of nabij 280 nm. Een verhouding van 260/230 tussen 2,0-2,2 is ideaal. Als de verhouding lager is dan verwacht, kan dit wijzen op de aanwezigheid van verontreinigingen die bij 230 nm worden opgenomen, zoals EDTA, fenol en koolhydraten. Controleer ook de absorptiegrafieken die voor het monster zijn verkregen.
- Meet de DNA-concentratie en bepaal de kwaliteit volgens de instructies van de fabrikant.
- Gelelektroforese
- Voer agarosegelelektroforeseuit om de DNA-integriteit te beoordelen en te bepalen of fragmentatie of degradatie heeft plaatsgevonden.
- Om DNA te visualiseren onder het UV-geldocumentatiesysteem, gebruik je een 1,0% agarosegel met SYBR Safe-kleurstof. Laat de gel 45 minuten op 80 V draaien.
OPMERKING: Het doel is om duidelijke, duidelijke, hoogmoleculaire banden boven de hoogste band van de DNA-ladder te hebben. Gebruik elke keer een verse 1× TAE-buffer.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit DNA-extractieprotocol met behulp van de CTAB-methode (Figuur 1) werd beoordeeld bij verschillende mycobacteriële soorten zoals M. tuberculosis, M. abscessus en M. chelonea. DNA werd geëxtraheerd en vergeleken op opbrengst, zuiverheid en integriteit van het geëxtraheerde DNA in verschillende monsters.
De DNA-concentratie varieerde tussen de mycobacteriële soorten en varieerde tussen 190-600 ng/μL en i...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Representatieve resultaten tonen het nut van de CTAB-methode aan bij het extraheren van DNA uit mycobacteriesoorten en het aanpakken van de uitdagingen die gepaard gaan met het extraheren van DNA uit deze organismen. Mycobacteriën staan bekend om hun complexe en lipidenrijke celwanden2. De huidige resultaten benadrukken verschillende cruciale aspecten die bijdragen aan het succes van deze techniek, omdat het hooggeconcentreerd, hoogwaardige intact DNA levert dat g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs spreken hun oprechte dank uit aan het TB-genomicateam: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa en Rob M Warren, voor hun bijdragen aan de ontwikkeling en optimalisatie van dit protocol, evenals voor hun onschatbare steun gedurende deze studie. Dit werk en de betrokken mensen werden ondersteund door subsidies en financiering van de South African Medical Research Council (SAMRC), National Research Foundation (NRF) en Stellenbosch University (SU). De financiers hadden geen rol in het onderzoeksontwerp, gegevensverzameling, analyse of het voorbereiden van manuscripten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL pipette tips | Elke leverancier | ||
| 10 µL pipette tips | Elke leverancier | ||
| 10% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| 15 mL polypropyleen buizen | Elke leverancier | ||
| 2 ml buizen en 1.5 ml buizen | Elke leverancier | ||
| 200 µl pipette tips | Elke leverancier | ||
| 2-PROPANOL, BIOREAGENT, VOOR MOLECULAIRE B& | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Bewaar in -20 °C |
| 37°C incubator | Elke leverancier | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65°C incubator | Elke leverancier | ||
| Agarose gel | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Bio-Rad UV gel documentatiesysteem, | BioRad | ||
| Centrifuge (voor 15 ml buizen oe 50 ml) en Microfuge (voor 2 ml buizen) | Elke leverancier | ||
| CHLOROFORM VOOR ANALYSE EMPARTA® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) | In een afzuigpunt, meng 384 ml Chloroform en 16 ml Isoamyl alcohol | ||
| CTAB/NaCl oplossing | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Los 4.1 g NaCl op in 80 ml gedistilleerd water. Terwijl geroerd wordt, voeg 10 g CTAB toe. Verwarm de oplossing in een 65°C incubator. Pas het volume aan tot 100 ml met gedistilleerd water. Bewaar op kamertemperatuur gedurende maximaal 6 maanden. |
| DNA 1 Kb ladder | Thermo Fisher Scientific | ||
| ETHYL ALCOHOL, PURE, 200 PROOF, VOOR MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Meng 75 ml Absolute ethanol en 25 ml gedistilleerd water |
| Lysozyme (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstitueer gelyofiliseerd lysozyme (op kamertemperatuur gebracht) met gedistilleerd water tot 10 mg/ml |
| Middlebrook 7H9 media | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Volg de richtlijnen van de fabrikant voor het bereiden van de vloeibare media |
| MIDDLEBROOK OADC VERRIJKING 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) media | BD | 245122 | |
| NanoDrop systeem | Thermo Fisher Scientific | ||
| P10 pipette | Elke leverancier | ||
| P1000 pipette | Elke leverancier | ||
| P200 pipette | Elke leverancier | ||
| Proteinase K, recomb, PCR grd 2x250mg | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstitueer het flesje met gelyofiliseerd Proteinase K met gedistilleerd water tot 10 mg/ml. Vries aliquoten in 2 ml buizen bij -20 °C |
| SYBR-safe | Thermo Fisher Scientific | ||
| Tris/EDTA (TE) buffer pH 8.0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP of 382499997 | |
| Vortex | Elke leverancier |
Referenties
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the mycobacterial envelope. Microbiol Spectr. 7 (4), 7.4.1(2019).
- Wayne, L. G., Sohaskey, C. D. Nonreplicating persistence of Mycobacterium tuberculosis. Annu Rev Microbiol. 55 (1), 139-163 (2001).
- Mohammadi, S., et al. Optimal DNA isolation method for detection of non-tuberculous mycobacteria by polymerase chain reaction. Adv Biomed Res. 6 (1), 133(2017).
- Van Soolingen, D., et al. Occurrence and stability of insertion sequences in Mycobacterium tuberculosis complex strains: Evaluation of an insertion sequence-dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. J Clin Microbiol. 29 (11), 2578-2586 (1991).
- Wilson, K. Preparation of genomic DNA from bacteria. Curr Protoc Mol Biol. 56 (1), 2.4.1-2.4.5 (2001).
- Van Embden, J. D., et al. Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA fingerprinting: Recommendations for a standardized methodology. J Clin Microbiol. 31 (2), 406-409 (1993).
- Wang, W. -F., et al. Genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis isolates and construction of a Beijing lineage reference genome. Genome Biol Evol. 12 (2), 3890-3905 (2020).
- Epperson, L. E., Strong, M. A scalable, efficient, and safe method to prepare high quality DNA from mycobacteria and other challenging cells. J Clin Tuberc Other Mycobact Dis. 19, 100150(2020).
- Warren, R., et al. Safe Mycobacterium tuberculosis DNA extraction method that does not compromise integrity. J Clin Microbiol. 44 (1), 254-256 (2006).
- Amaro, A., Duarte, E., Amado, A., Ferronha, H., Botelho, A. Comparison of three DNA extraction methods for Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium avium subsp. avium. Lett Appl Microbiol. 47 (1), 8-11 (2008).
- Arslan, N., Demiray-Gurbuz, E., Ozkutuk, N., Esen, N., Özkütük, A. A. Comparison of four different DNA isolation methods from MGIT culture for long-read whole genome sequencing of Mycobacterium tuberculosis. Jundishapur J Microbiol. 17 (9), e148070(2024).
- Opperman, C. J., et al. Mycobacterium avium DNA extraction: Implications for NTM identification and amplicon sequencing. South Afr J Infect Dis. 40 (1), 5(2025).
- Froenicke, L. Illumina and Aviti sample and library requirements. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/illumina-aviti-sample-and-library-requirements (2015).
- Froenicke, L. PacBio Revio and Sequel II library prep & sequencing. DNA Technol Core. , https://dnatech.ucdavis.edu/pacbio-revio-and-sequel-ii-library-prep-sequencing (2016).
- Dippenaar, A., et al. Droplet-based whole genome amplification for sequencing minute amounts of purified Mycobacterium tuberculosis DNA. Sci Rep. 14, 9931(2024).
- Doig, C. The efficacy of the heat-killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Li, Y., et al. A systematic investigation of key factors of nucleic acid precipitation toward optimized DNA/RNA isolation. Biotechniques. 68 (4), 191-199 (2020).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. N.Y. (2012).
- Van Soolingen, D., Hermans, P. W., De Haas, P. E., Van Embden, J. D. Insertion element IS1081-associated restriction fragment length polymorphisms in Mycobacterium tuberculosis complex species: A reliable tool for recognizing Mycobacterium bovis BCG. J Clin Microbiol. 30 (7), 1772-1777 (1992).
- Doig, C., Seagar, A. L., Watt, B., Forbes, K. J. The efficacy of the heat killing of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Pathol. 55 (10), 778-779 (2002).
- Dippenaar, A., et al. Exploring the potential of Oxford Nanopore Technologies sequencing for Mycobacterium tuberculosis sequencing: An assessment of R10 flowcells and V14 chemistry. PLOS ONE. 19 (6), e0303938(2024).
- Chang, A., et al. Metagenomic DNA sequencing to quantify Mycobacterium tuberculosis DNA and diagnose tuberculosis. Sci Rep. 12, 16972(2022).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J., Pagotto, F., Reimer, A. Metagenomics: The next culture-independent game changer. Front Microbiol. 8, 1069(2017).
- Marshall, J. E., et al. Methods of isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria from environmental samples: A scoping review. Tuberculosis. 138, 102291(2023).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
