Dit protocol beschrijft de CTAB-methode om hoogwaardige DNA uit mycobacteriën te extraheren, waarbij de uitdagingen van hun harde, mycolinezuurrijke celwanden worden overwonnen. Het proces omvat enzymatische vertering, cellysie met CTAB en DNA-zuivering door organische extractie en ethanolprecipitatie. Deze methode produceert DNA dat geschikt is voor moleculaire studies en is betrouwbaar voor mycobacterieel onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie van het volledige genoom van deoxyribonucleïnezuur uit Mycobacterium-soorten via de Cetyltrimethylammoniumbromide-techniek
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Efficiënte en betrouwbare DNA-extractie is een fundamentele stap in de moleculaire biologie, waarbij hoogwaardig genetisch materiaal wordt geleverd voor latere toepassingen zoals PCR, sequencing en genomische analyses. De unieke celwandsamenstelling van mycobacteriën, rijk aan lipiden en mycolinzuren, vormt echter aanzienlijke uitdagingen voor efficiënte DNA-isolatie. De cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB)-methode wordt veel toegepast vanwege de efficiëntie bij het extraheren van hoogzuiver DNA uit mycobacteriesoorten, waaronder zowel snel- als langzaam groeiende stammen. De techniek omvat enzymatische verstoring van bacteriële cellen met behulp van lysozym en proteïnase K, gevolgd door de lyse van celcomponenten met CTAB, die selectief bindt en een complex vormt met polysacchariden en eiwitten. DNA-zuivering en -concentratie worden bereikt door organische oplosmiddelextractie en ethanolprecipitatie. Volgens onze gegevens levert het CTAB-protocol hoge hoeveelheden DNA op (200 - 1000 ng/μL) met hoge kwaliteit en minimale besmetting, zoals bewezen door gelelektroforese en NanoDrop-analyse. Het DNA dat uit verschillende mycobacteriële soorten wordt gewonnen, is van hoge zuiverheid en geschikt voor diverse moleculaire studies. Deze studie toont de procedurele stappen van de CTAB-methode aan en benadrukt het nut ervan bij het overwinnen van de unieke uitdagingen die gepaard gaan met mycobacteriële DNA-extractie.
Inleiding
Het extraheren van hoogkwalitatief goed DNA is een fundamentele stap in de moleculaire biologie, essentieel voor latere toepassingen zoals PCR, whole genome sequencing en andere genomische studies. Voor Mycobacterium, een geslacht dat zowel pathogene soorten omvat zoals Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) als niet-pathogene omgevingssoorten zoals Mycobacterium smegmatis (M. smegmatis), kan DNA-extractie lastig zijn vanwege hun dikke, lipidenrijke en hydrofobe celwanden 1,2,3. Deze sterke c....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De representatieve resultaten zijn gegenereerd met goedkeuring van de REC: BES ethische commissie, Universiteit Stellenbosch (BES-2024-22504). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Bereiding van mycobacteriële cultuursuspensie
OPMERKING: Afhankelijk van de te onderzoeken soort moet deze stap worden uitgevoerd in een Biosafety niveau 2 (BSL-2) of een Biosafety niveau 3 (BSL-3) laboratorium. De broedtijd en omstandigheden van de kweek hangen ook af van de groeibehoeften van de mycobacteriële soort, vanwege hu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit DNA-extractieprotocol met behulp van de CTAB-methode (Figuur 1) werd beoordeeld bij verschillende mycobacteriële soorten zoals M. tuberculosis, M. abscessus en M. chelonea. DNA werd geëxtraheerd en vergeleken op opbrengst, zuiverheid en integriteit van het geëxtraheerde DNA in verschillende monsters.
De DNA-concentratie varieerde tussen de mycobacteriële soorten en varieerde tussen 190-600 ng/μL en i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Representatieve resultaten tonen het nut van de CTAB-methode aan bij het extraheren van DNA uit mycobacteriesoorten en het aanpakken van de uitdagingen die gepaard gaan met het extraheren van DNA uit deze organismen. Mycobacteriën staan bekend om hun complexe en lipidenrijke celwanden2. De huidige resultaten benadrukken verschillende cruciale aspecten die bijdragen aan het succes van deze techniek, omdat het hooggeconcentreerd, hoogwaardige intact DNA levert dat g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.
Dankbetuigingen
De auteurs spreken hun oprechte dank uit aan het TB-genomicateam: Nabila Ismail, Melanie Grobbelaar, Emylin Costa en Rob M Warren, voor hun bijdragen aan de ontwikkeling en optimalisatie van dit protocol, evenals voor hun onschatbare steun gedurende deze studie. Dit werk en de betrokken mensen werden ondersteund door subsidies en financiering van de South African Medical Research Council (SAMRC), National Research Foundation (NRF) en Stellenbosch University (SU). De financiers hadden geen rol in het onderzoeksontwerp, gegevensverzameling, analyse of het voorbereiden van manuscripten.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 mL pipette tips | Elke leverancier | ||
| 10 µL pipette tips | Elke leverancier | ||
| 10% Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Merck (Sigma-Aldrich) | 71736-100 ML | |
| 15 mL polypropyleen buizen | Elke leverancier | ||
| 2 ml buizen en 1.5 ml buizen | Elke leverancier | ||
| 200 µl pipette tips | Elke leverancier | ||
| 2-PROPANOL, BIOREAGENT, VOOR MOLECULAIRE B& | Merck (Sigma-Aldrich) | I9516-1L | Bewaar in -20 °C |
| 37°C incubator | Elke leverancier | ||
| 5 M NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S6546 - 100 ML | |
| 65°C incubator | Elke leverancier | ||
| Agarose gel | Merck (Sigma-Aldrich) | ||
| Bio-Rad UV gel documentatiesysteem, | BioRad | ||
| Centrifuge (voor 15 ml buizen oe 50 ml) en Microfuge (voor 2 ml buizen) | Elke leverancier | ||
| CHLOROFORM VOOR ANALYSE EMPARTA® ACS | Merck (Sigma-Aldrich) | 1070242500 | |
| Chloroform/isoamyl alcohol (24:1) | In een afzuigpunt, meng 384 ml Chloroform en 16 ml Isoamyl alcohol | ||
| CTAB/NaCl oplossing | Merck (Sigma-Aldrich) | 52370-100 G | Los 4.1 g NaCl op in 80 ml gedistilleerd water. Terwijl geroerd wordt, voeg 10 g CTAB toe. Verwarm de oplossing in een 65°C incubator. Pas het volume aan tot 100 ml met gedistilleerd water. Bewaar op kamertemperatuur gedurende maximaal 6 maanden. |
| DNA 1 Kb ladder | Thermo Fisher Scientific | ||
| ETHYL ALCOHOL, PURE, 200 PROOF, VOOR MOL& | Merck (Sigma-Aldrich) | E7023-500ML | Meng 75 ml Absolute ethanol en 25 ml gedistilleerd water |
| Lysozyme (10 mg/ml) | Merck (Sigma-Aldrich) | 10837059001 | Reconstitueer gelyofiliseerd lysozyme (op kamertemperatuur gebracht) met gedistilleerd water tot 10 mg/ml |
| Middlebrook 7H9 media | Merck (Sigma-Aldrich) | M0178 | Volg de richtlijnen van de fabrikant voor het bereiden van de vloeibare media |
| MIDDLEBROOK OADC VERRIJKING 6 x 100 ml F | BD | 212240 | |
| Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) media | BD | 245122 | |
| NanoDrop systeem | Thermo Fisher Scientific | ||
| P10 pipette | Elke leverancier | ||
| P1000 pipette | Elke leverancier | ||
| P200 pipette | Elke leverancier | ||
| Proteinase K, recomb, PCR grd 2x250mg | Merck (Sigma-Aldrich) | 3115801001 | Reconstitueer het flesje met gelyofiliseerd Proteinase K met gedistilleerd water tot 10 mg/ml. Vries aliquoten in 2 ml buizen bij -20 °C |
| SYBR-safe | Thermo Fisher Scientific | ||
| Tris/EDTA (TE) buffer pH 8.0 | Merck (Sigma-Aldrich) | 8890-OP of 382499997 | |
| Vortex | Elke leverancier |
Referenties
- FBouso, J. M., Planet, P. J. Complete non-tuberculous mycobacteria whole genomes using an optimized DNA extraction protocol for long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 793(2019).
- Daffé, M., Marrakchi, H. Unraveling the structure of the ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
