Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

897 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68411

⸱

22 augustus 2025

 , 
1Institut de recherches cliniques de Montréal (IRCM), 2Programmes de biologie moléculaire, Université de Montréal, 3Département de Médecine, Université de Montréal

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Samenvatting

De groei en patroonvorming van embryonaal weefsel worden grotendeels gecontroleerd door signalen die lokaal worden uitgewisseld tussen celpopulaties in de weefsels zelf. Cytonemen zijn een type signaalfilopodia dat voor het eerst werd geïdentificeerd in Drosophila en dat de uitwisseling tussen signaalproducerende en signaalontvangende cellen verbindt en bemiddelt. In de zich ontwikkelende imaginaire schijf van de Drosophila-vleugel zijn cytonemen betrokken bij signaaluitwisseling tussen verschillende populaties cellen in het eigenlijke (DP) epitheel, die de volwassen vleugel zullen vormen, evenals tussen DP-cellen en cellen in aangrenzende schijf-geassocieerde weefsels. Cytonemen synapseren met doelwitcellen om intieme membraancontacten te vormen.

Hier presenteren we een protocol voor het kwantificeren van cytoneme-gemedieerd contact tussen DP-cellen en cellen van het aangrenzende peripodiale membraan (PerM) epitheel, dat van de DP-cellen wordt gescheiden door het schijflumen, met behulp van een GFP-reconstitutiebenadering in levende vleugelschijven. Met behulp van de GAL4-UAS- en LexA-LexAop-systemen worden complementaire fragmenten van split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), elk gefuseerd met het transmembraandomein van CD4, aan weerszijden van het schijflumen tot expressie gebracht. Beeldvorming van gereconstitueerde GFP-fluorescentie in preparaten van live vleugelschijven door middel van confocale microscopie wordt vervolgens gebruikt om beeldstapels te genereren waaruit gereconstitueerde GFP-fluorescentie kan worden gelokaliseerd en gekwantificeerd. Met behulp van dit systeem is het mogelijk om eiwitcoderende of RNA-interferentietransgenen tot co-expressie te brengen in cytoneme-producerende of doelwitcellen om hun effect op DP-PerM-celcontacten te meten. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden aangepast aan andere weefsels, maakt het dus mogelijk om factoren te identificeren die belangrijk zijn voor de vorming of functie van cytonen.

Inleiding

De ontwikkeling van embryonale weefsels wordt gecontroleerd door cellen die zich in 'organiserende centra' bevinden en die signalen geven aan verre cellen in een weefsel, en hun beslissingen beheersen om zich te vermenigvuldigen (d.w.z. groeien en delen) of een bepaald lot aan te nemen1. Deze niet-autonome signalering van cellen wordt gemedieerd door liganden die worden geproduceerd door organiserende centrumcellen die concentratiegradiënten door de weefsels vormen en concentratieafhankelijke reacties uitlokken. In veel gevallen worden deze liganden afgeleverd of opgepikt via lange actine-gebaseerde signaleringsfilopodia, cytonemen genaamd, die signaalverzendende en -ontvangende cellen in weefsels verbinden 2,3. Voor het eerst ontdekt in de imaginaire schijf4 van de Drosophila-vleugel, zijn cytonemen ook geïdentificeerd bij zoogdieren en andere gewervelde dieren 5,6,7,8,9. Een beter begrip van de rol van cytonemen in niet-autonome signalering van cellen, terwijl het zich in een vroeg stadium bevindt, is cruciaal om te ontcijferen hoe cellen communiceren om zich in weefsels te organiseren en hoe deze communicatielijnen worden gewijzigd in verschillende pathologische aandoeningen, waaronder ontwikkelingsmisvormingen en kanker.

Cytonemen kunnen zich uitstrekken van broncellen om liganden af te leveren aan doelcellen of van doelcellen om liganden dicht bij hun bronnen te ontvangen 2,3. Cytonemen maken intieme contacten met hun doelwitten, waar ze vermoedelijk synapsachtige structuren vormen, waar ligandoverdracht kan plaatsvinden 3,10,11. Dit contact kan plaatsvinden tussen de uiteinden van bron- en doelcytosemen of tussen cytoneumen en cellichamen3. Hoewel niet uitgebreid gekarakteriseerd, is celadhesie door adhesiemoleculen of door receptor-ligandinteracties in sommige gevallen nodig voor de juiste activering van stroomafwaartse signaleringsgebeurtenissen 12,13,14, waardoor dit een belangrijk aspect is van de cytoneme-biologie.

Verschillende studies hebben de techniek "GFP-reconstitutie over synaptische partners" (GRASP) toegepast op de analyse van cytoneme-contacten. Deze methode is ontwikkeld voor het identificeren en in kaart brengen van synaptische partners in complexe zenuwstelsels15. Het is gebaseerd op de expressie van de twee complementaire fragmenten van split-GFP (spGFP1-10 en spGFP11), elk gefuseerd met het extracellulaire gebied van een transmembraandomein (bijv. van CD4), in verschillende populaties van cellen. Als de plasmamembranen van cellen in die twee populaties in direct contact komen, brengt dit de complementaire domeinen van spGFP in de buurt, wat leidt tot de reconstitutie van GFP-fluorescentie. Deze benadering is in Drosophila gebruikt om het bestaan van cytoneme-contacten tussen cellen in de vleugelschijf en tussen de vleugelschijf en andere dicht bij elkaar liggende weefsels te identificeren 12,16,17,18,19,20,21.

Dit artikel beschrijft de toepassing van GRASP op de karakterisering van contacten tussen twee morfologisch verschillende epitheellagen van de imaginaire schijf van de Drosophila-vleugel, de eigenlijke schijf (DP) en het peripodiale membraan (PerM). Deze epitheellagen vormen een zak rond een centraal lumen, met aan de ene kant de pseudogestratificeerde zuilvormige DP-cellen en aan de andere kant de plaveiselcelcellen PerM, beide met hun apicale membranen naar binnen gericht in de richting van het lumen (Figuur 1A). Er is enig bewijs voor translumenale signalering tussen de twee lagen 22,23,24,25, en we hebben onlangs signalering van de DP gedocumenteerd om de proliferatie van PerM-cellen te beheersen die wordt gemedieerd door apicale cytonemen in de DP 21. Dit protocol omvat het gebruik van de GAL4/UAS en LexA/LexAop transgenexpressiesystemen om complementaire fragmenten van spGFP gefuseerd met CD4 tot expressie te brengen op de membranen van DP- en PerM-cellen. Het maakt gebruik van gereconstitueerde GFP-fluorescentie om membraancontact tussen de twee celpopulaties uit te lezen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De nubbin-GAL4-driver wordt gebruikt om CD4-spGFP1-10 specifiek in het vleugelzakgebied van de DP tot expressie te brengen (Figuur 1A). De PerM-LexA-driver21 wordt gebruikt om CD4-spGFP11 specifiek in de PerM tot expressie te brengen (Figuur 1A). Deze twee expressiesystemen zijn onafhankelijk van elkaar, waardoor gelijktijdige en specifieke expressie van verschillende transgenen in DP en PerM mogelijk is (Figuur 1B,C).

Het genetische basisschema omvat het kruisen van vliegen om larven van het genotype nub-GAL4/UAS-CD4-spGFP1-10 te genereren; PerM-LexA/LexAop-CD4-spGFP11. Als negatieve controle laten we het LexAop-CD4-spGFP11-transgen weg. Andere transgenen (bijv. eiwitcodering, dubbelstrengs RNA) kunnen naar wens tot expressie worden gebracht in de DP-laag (onder controle van UAS-sequenties) of in de PerM (onder controle van de LexA-operator).

Dit is een live beeldvormingsprotocol dat niet kan worden onderbroken. Materiaalvoorbereiding wordt geschat op ~10 min. Dissecties mogen niet langer dan 20 minuten per keer worden uitgevoerd vóór de beeldvorming. De beeldvorming duurt ~30 minuten en mag niet langer dan ~1 uur duren. Voor meerdere aandoeningen of een groot aantal monsters moet de procedure in meerdere rondes worden uitgevoerd om de beste resultaten te garanderen.

1. Materiële voorbereiding

  1. Reinig voorafgaand aan de dissectie een pincet, een glazen depressiespotplaat met 9 putjes (of een andere container die geschikt is voor het verzamelen en reinigen van larven) en een herbruikbare Sylgard (siliconen) gecoate petrischaal die wordt gebruikt voor dissectie met 70% ethanol.
  2. Bereid microscoopglaasjes voor door 70% ethanol te wassen en vervolgens een beeldafstandsstuk op het gedroogde glaasje te plakken. Knip met een schaar afzonderlijke putjes uit de strook met 8 putjes en knip ze doormidden (Figuur 2A). Verwijder de beschermende achterkant aan één kant van elke helft en plak afstandhouders op de schuif, iets uit elkaar geplaatst om een beschutte ruimte te creëren in het midden waar de schijven worden geplaatst (Figuur 2B).
    OPMERKING: Onze ervaring is dat dit de montage van monsters vereenvoudigt, omdat het precieze volume van het medium dat naar de dia wordt overgebracht minder kritisch is. Elk klein overtollig volume stroomt gewoon door de opening naar buiten bij het wegglijden. Omdat we slechts een relatief korte tijd (meestal ~1 uur) beelden maken, ondervonden we geen problemen met medium droging.
  3. Ontdooi het medium voor live-beeldvorming (niet-aangevuld met Schneider's Drosophila Medium, bewaard in bevroren aliquots van 10 ml) en houd het gemakkelijk toegankelijk in een ijsemmer.
  4. Meng in een microcentrifugebuis van 2 ml 1,5 ml medium met 20 μl 200 μg/ml Hoechst 33342 (eindconcentratie 2,7 μg/ml). Houd de tube op ijs.
    OPMERKING: Deze specifieke vorm van Hoechst-kleurstof wordt gebruikt omdat deze zeer membraandoorlatend is. LET OP: Handschoenen moeten worden gebruikt bij het hanteren van Hoechst 33342. Gereedschap moet na gebruik worden gewassen.

2. Vleugelschijfdissectie en voorbereiding van de schuif

  1. Na genetische kruising en kweek bij 25°C, pluk je zwervende larven van de derde instar uit de buis en was je ze in koud live-imaging medium in een 9-well glazen depressie spotplaat.
    OPMERKING: Cytoneumen zijn erg kwetsbaar. In de volgende stappen moet ervoor worden gezorgd dat weefsels rond de schijven worden gemanipuleerd, waarbij wordt geprobeerd direct contact tussen de schijven en dissectiegereedschappen te vermijden. We bereiden drie of vier larven tegelijk voor, omdat het beschadigen van een paar schijven onvermijdelijk is, en dit kan pas merkbaar worden tijdens de beeldvormingsstappen.
  2. Breng de larven onder de ontleedmicroscoop over in een druppel levend beeldmedium op een met siliconen beklede petrischaal en begin met ontleden met behulp van twee ontleedtangen. Om dit te doen, houdt u eerst de kop en het voorste lichaamsdeel stabiel door de larven met een tang samen te knijpen op ongeveer een derde van de lichaamslengte (vanaf de voorste). Knijp met de tweede tang in het lichaam net achter de eerste tang. Trek vervolgens het achterste deel van de larven weg om de voorste "helft" te isoleren.
  3. Keer de voorste helft om door deze met een pincet aan weerszijden van het afgesneden uiteinde vast te zetten en de kop door te duwen met het andere paar (zoals het binnenstebuiten keren van een sok), om de interne structuren bloot te leggen, inclusief denkbeeldige schijven, luchtpijp, speekselklieren, vetlichaam en darmen.
  4. Verwijder voorzichtig de speekselklieren, het vetlichaam en de darmen en zorg ervoor dat u de laterale stammen van de luchtpijp niet verstoort, die over de vleugelschijven moeten liggen en deze moeten beschermen.
  5. Gebruik een tang om de gereinigde voorste helften met aangehechte vleugelschijven voorzichtig over te brengen in een druppel schoon live-imaging medium met Hoechst, geplaatst tussen de afstandhouders op een geprepareerde dia (Figuur 2C). Isoleer de vleugelschijven van de rest van de weefsels door ze voorzichtig bot te maken van de fijne takken van de luchtpijp die op de schijf zijn aangesloten, met behulp van een mes van de ontleedtang of een fijne wolfraamdraad die aan een ontleednaaldhouder is bevestigd. Gooi de rest van het karkas weg.
  6. Oriënteer de schijven met behulp van één mes van de snijtang of de snijnaald van wolfraamdraad. Vanwege hun afgeplatte druppelachtige vorm zullen vleugelschijven vallen met de DP of PerM naar boven gericht. Richt voor dit protocol alle schijven met de PerM-kant naar boven.
  7. Pas het mediumvolume aan om de put volledig te vullen, tot iets boven het niveau van de beeldafstandsafstandhouder, door het medium naar behoefte toe te voegen of te verwijderen. Verwijder de beschermende achterkant van de bovenkant van elke helft van de beeldafstandhouders en laat vervolgens voorzichtig een dekglaasje over het monster zakken. Druk voorzichtig op het dekglaasje waar het in contact komt met de beeldafstandhouders (bijv. met het afgeronde uiteinde van de snijtang) om ervoor te zorgen dat het dekglaasje aan het afstandsstuk hecht.
    NOTITIE: Het gemiddelde niveau moet iets boven de hoogte van het afstandsstuk liggen om te voorkomen dat luchtbellen worden opgesloten, maar niet zo hoog dat er een aanzienlijke stroming wordt gegenereerd wanneer het dekglaasje wordt neergelaten.

3. Beeldvorming

  1. Beeldmonsters bij kamertemperatuur af met behulp van een confocale microscoop (argonionlaser met een golflengte van 488 nm voor GFP, UV-laser met een golflengte van 350 nm voor Hoechst) uitgerust met een 40x/1,30 NA olie-immersielens en microscopiesoftware. Verkrijg beeldstapels met een stapgrootte van 1 μm die zich uitstrekken van net boven het hoogste niveau van de PerM (waar de Hoechst-fluorescentie afneemt) tot de basale zijde van de DP, wat over het algemeen neerkomt op meer dan 100 afbeeldingen per stapel. Verkrijg herhaalde beeldstapels om timelapse-films te genereren.
    OPMERKING: We maken een beeld van een dia voor niet langer dan ~1-2 uur.
  2. Verkrijg voor de instellingen van de microscoopsoftware afbeeldingen met behulp van 8-bits codering, lijngemiddelde van 2, detectorversterking over het algemeen tussen 650 en 750 en gescheiden kanaalsporen om signaaldoorbloeding te verminderen. Gebruik identieke laser- en detectorinstellingen voor alle omstandigheden, vooraf bepaald door vooraf tests uit te voeren op elke toestand.
    OPMERKING: Bij een vergroting van 40x hebben onze afbeeldingen een resolutie van 5,0386 pixels per μm (pixelgrootte: 0,1985 x 0,1985 μm2). In onze opstelling omvatten de optimale confocale microscoopinstellingen de hoogst mogelijke laserintensiteit (zonder het weefsel te beschadigen) om zoveel mogelijk signaal op te vangen, terwijl tegelijkertijd weinig tot geen verzadiging wordt opgebracht; en de laagst mogelijke ruis zoals beoordeeld op negatieve controles, bereikt door de detectoroffset en acquisitiesnelheid te verminderen (indien nodig). We gebruiken over het algemeen minder dan 5% laservermogen en maximale scankopsnelheid ('9' in de Zen-software-instellingen). Een enkele beeldstapel duurt doorgaans ~1 minuut en 45 s om te verkrijgen, en afbeeldingen worden elke 2-3 minuten gemaakt voor timelapse-analyses.

4. Analyse van het beeld

  1. Projectstacks met behulp van de projectiefunctie met maximale intensiteit van het ImageJ-softwarepakket (klik op afbeelding | Stapels | Z-project, selecteer Maximale intensiteit in het menu).
  2. Bepaal in de MIP-afbeeldingen het gebied van de vleugelzak op basis van het patroon van het vouwen van de vleugelschijf (met behulp van het Hoechst-kanaal) met behulp van Polygon Selection. Gebruik dezelfde selectie op het GFP-kanaal met de Clear Outside Function (klik op Bewerken | Buiten wissen) om elke pixelwaarde aan de buitenkant in te stellen op 0.
  3. Gebruik in de MIP-afbeeldingen het Hoechst-kanaal om de GFP-afbeeldingen op te schonen, met name het verwijderen van artefactische vlekken die in beide kanalen verschijnen door de betreffende pixelwaarde in te stellen op 0 (klik op Polygoonselectie en vervolgens op Bewerken | wissen).
  4. Gebruik in de opgeschoonde MIP-beelden de functie Histogram (klik op Analyseren | Histogram | Lijst) om de lijst met alle pixelwaarden op te halen en te kopiëren naar een tabel in een werkblad.
  5. Stel een drempelwaarde in op basis van de analyse van het achtergrondsignaal in negatieve controles (en vervolgens geverifieerd in andere steekproeven; zie de discussie).
  6. Bereken het percentage GFP-positief oppervlak met behulp van de volgende formule:
    %GFP-positief oppervlak = figure-protocol-1 × 100
  7. Normaliseer de gegevens aan het einde door elke waarde te delen door het gemiddelde van de referentievoorwaarde (die is ingesteld op 1).
    OPMERKING: Geldige pixel = pixel met een waarde ≥ 1, waarbij elke verwijderde pixel waarvan de waarde op 0 was ingesteld, effectief wordt genegeerd. Pixelwaarden van 0 komen niet van nature voor.
  8. Om te bepalen waar in de schijven het gereconstitueerde GFP-signaal zich bevindt, gebruikt u XZ-reslices van beeldstapels om naar de apicobasale as van het schijfepitheel te kijken. Voer de reslices uit in Fiji zonder interpolatie en vergroot de beeldhoogte in de Z-as met behulp van de schaalfunctie met bilineaire interpolatie om de zichtbaarheid te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om het nut van de GRASP-procedure voor het meten van contacten tussen DP- en PerM-cellen te testen, hebben we vleugelschijven van vier verschillende genotypen onderzocht: wildtype negatieve controleschijven (genotype: w1118) die alleen achtergrondniveaus van autofluorescentie in het GFP-kanaal weergeven; schijven die de CD4-spGFP1-10 tot expressie brengen in de DP-laag, maar zonder het CD4-spGFP11-transgen, dat het fluorescentieniveau vertoont dat alleen door GFP1-10 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cytonemen spelen een belangrijke rol bij de verdeling van liganden en beheersen de groei en organisatie van zich ontwikkelende weefsels. Signaaluitwisseling vindt plaats waar cytoneme-tips intieme membraancontacten maken met hun doelen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het analyseren van cytoneme-gemedieerde contacten tussen epitheellagen in de vleugelschijf met behulp van de GRASP-techniek.

De hier gepresenteerde techniek vereist min...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen tegenstrijdige belangen te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk is ondersteund door een CIHR-subsidie (PJT-162109) aan D.H. M.J. met een doctoraatsbeurs van de Institut de Recherches Cliniques de Montréal Foundation en van het Molecular Biology Program van de Universiteit van Montreal. De auteurs zijn zeer erkentelijk voor de hulp van het IRCM Microscopy and Imaging-platform.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Discovery V12 dissectiemicroscoopZeissdissectiemicroscoop
Dumont #55 pincet, Biologie tipsFine Science Tools11255-20dissectiepincet
EP-Slik (slik20358)BDSCPanneton et al. 2015 vliegend ras voor het tot expressie brengen van Slik
FIJISchindelin J. et al. (2012) beeldanalysesoftware
Hoechst 33342 ThermoFisher ScientificH3570 kernkleuring voor live imaging 
LexAop-CD4-spGFP11 BDSC93018vliegend ras
LSM 700 confocale microscoop Zeissconfocale microscoop
nub-GAL4Bloomington Drosophila Stock Centre (BDSC)86108vliegend ras
PerM-LexARambaud, Joseph et al., 2025vliegend ras
PYREX 9-putjes glas spotplatenCorning Life Sciences7220-85voor het verzamelen en wassen van larven
Schneider's Drosophila MediumThermoFisher Scientific21720024medium voor live imaging
SecureSeal beeldvormingsspaties, 8-putjes, 0,12 mm dik Grace Bio-Labs654008spatie
SYLGARD 184 siliconen elastomeersetSylgard3097358-1004voor het maken van dissectieplaten
UAS-CD4-spGFP1-10 BDSC93017vliegend ras
Zen BlackZeissacquisitiesoftware

Referenties

  1. Ng, J. K., Tamura, K., Buscher, D., Izpisua-Belmonte, J. C. Molecular and cellular basis of pattern formation during vertebrate limb development. Curr Top Dev Biol. 41, 37-66 (1999).
  2. Kornberg, T. B. Cytonemes and the dispersion of morphogens. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (6), 445-463 (2014).
  3. Daly, C. A., Hall, E. T., Ogden, S. K. Regulatory mechanisms of cytoneme-based morphogen transport. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 119(2022).
  4. Ramirez-Weber, F. A., Kornberg, T. B. Cytonemes: cellular processes that project to the principal signaling center in Drosophila imaginal discs. Cell. 97 (5), 599-607 (1999).
  5. Hall, E. T., et al. Cytoneme delivery of Sonic Hedgehog from ligand-producing cells requires Myosin 10 and a Dispatched-BOC/CDON co-receptor complex. Elife. 10, e61432(2021).
  6. Sanders, T. A., Llagostera, E., Barna, M. Specialized filopodia direct long-range transport of SHH during vertebrate tissue patterning. Nature. 497 (7451), 628-632 (2013).
  7. Stanganello, E., et al. Filopodia-based Wnt transport during vertebrate tissue patterning. Nat Commun. 6, 5846(2015).
  8. Hall, E. T., et al. Cytoneme signaling provides essential contributions to mammalian tissue patterning. Cell. 187 (2), 276-293.e23 (2024).
  9. Zhang, C., Brunt, L., Ono, Y., Rogers, S., Scholpp, S. Cytoneme-mediated transport of active Wnt5b-Ror2 complexes in zebrafish. Nature. 625 (7993), 126-133 (2024).
  10. Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Glutamate signaling at cytoneme synapses. Science. 363 (6430), 948-955 (2019).
  11. Wood, B. M., et al. Cytonemes with complex geometries and composition extend into invaginations of target cells. J Cell Biol. 220 (5), e202101116(2021).
  12. Gonzalez-Mendez, L., Seijo-Barandiaran, I., Guerrero, I. Cytoneme-mediated cell-cell contacts for Hedgehog reception. Elife. 6, e24045(2017).
  13. Du, L., Sohr, A., Li, Y., Roy, S. GPI-anchored FGF directs cytoneme-mediated bidirectional contacts to regulate its tissue-specific dispersion. Nat Commun. 13 (1), 3482(2022).
  14. Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein. Science. 343 (6173), 1244624(2014).
  15. Feinberg, E. H., et al. GFP Reconstitution Across Synaptic Partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  16. Yang, S., et al. Competitive coordination of the dual roles of the Hedgehog co-receptor in homophilic adhesion and signal reception. Elife. 10, e65770(2021).
  17. Patel, A., et al. Cytonemes coordinate asymmetric signaling and organization in the Drosophila muscle progenitor niche. Nat Commun. 13 (1), 1185(2022).
  18. Chen, W., Huang, H., Hatori, R., Kornberg, T. B. Essential basal cytonemes take up Hedgehog in the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144 (17), 3134-3144 (2017).
  19. Huang, H., Kornberg, T. B. Myoblast cytonemes mediate Wg signaling from the wing imaginal disc and Delta-Notch signaling to the air sac primordium. Elife. 4, e06114(2015).
  20. Hatori, R., Kornberg, T. B. Hedgehog produced by the Drosophila wing imaginal disc induces distinct responses in three target tissues. Development. 147 (22), dev195974(2020).
  21. Rambaud, B., et al. Slik sculpts the plasma membrane into cytonemes to control cell-cell communication. EMBO J. 44 (8), 2186-2210 (2025).
  22. Gibson, M. C., Schubiger, G. Peripodial cells regulate proliferation and patterning of Drosophila imaginal discs. Cell. 103 (2), 343-350 (2000).
  23. Gibson, M. C., Lehman, D. A., Schubiger, G. Lumenal transmission of decapentaplegic in Drosophila imaginal discs. Dev Cell. 3 (3), 451-460 (2002).
  24. Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Egfr/Ras pathway mediates interactions between peripodial and disc proper cells in Drosophila wing discs. Development. 130 (20), 4931-4941 (2003).
  25. Pallavi, S. K., Shashidhara, L. S. Signaling interactions between squamous and columnar epithelia of the Drosophila wing disc. J Cell Sci. 118 (Pt 15), 3363-3370 (2005).
  26. Pedelacq, J. D., Cabantous, S. Development and applications of superfolder and split fluorescent protein detection systems in biology. Int J Mol Sci. 20 (14), 3479(2019).
  27. Panneton, V., et al. Regulation of catalytic and non-catalytic functions of the Drosophila Ste20 kinase Slik by activation segment phosphorylation. J Biol Chem. 290 (34), 20960-20971 (2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cytoneme-gemedieerd contactDrosophila-vleugel盘live-imagingconfocale microscopiesplit-GFP-systeemperipodiale membraanweefselgroeisignaleringeiwitexpressie
Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.