Een op GFP-complementatie gebaseerd systeem met dubbele expressie voor het beoordelen van cel-celcontact gemedieerd door cytonemen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel

Summary

We beschrijven een protocol voor het meten van contacten tussen cellen in aangrenzende epitheellagen in levende imaginaire schijven van de Drosophila-vleugel met behulp van een op GFP-reconstitutie gebaseerde benadering.

Abstract

De groei en patroonvorming van embryonaal weefsel worden grotendeels gecontroleerd door signalen die lokaal worden uitgewisseld tussen celpopulaties in de weefsels zelf. Cytonemen zijn een type signaalfilopodia dat voor het eerst werd geïdentificeerd in Drosophila en dat de uitwisseling tussen signaalproducerende en signaalontvangende cellen verbindt en bemiddelt. In de zich ontwikkelende imaginaire schijf van de Drosophila-vleugel zijn cytonemen betrokken bij signaaluitwisseling tussen verschillende populaties cellen in het eigenlijke (DP) epitheel, die de volwassen vleugel zullen vormen, evenals tussen DP-cellen en cellen in aangrenzende schijf-geassocieerde weefsels. Cytonemen synapseren met doelwitcellen om intieme membraancontacten te vormen.

Hier presenteren we een protocol voor het kwantificeren van cytoneme-gemedieerd contact tussen DP-cellen en cellen van het aangrenzende peripodiale membraan (PerM) epitheel, dat van de DP-cellen wordt gescheiden door het schijflumen, met behulp van een GFP-reconstitutiebenadering in levende vleugelschijven. Met behulp van de GAL4-UAS- en LexA-LexAop-systemen worden complementaire fragmenten van split-GFP (spGFP1-10, spGFP11), elk gefuseerd met het transmembraandomein van CD4, aan weerszijden van het schijflumen tot expressie gebracht. Beeldvorming van gereconstitueerde GFP-fluorescentie in preparaten van live vleugelschijven door middel van confocale microscopie wordt vervolgens gebruikt om beeldstapels te genereren waaruit gereconstitueerde GFP-fluorescentie kan worden gelokaliseerd en gekwantificeerd. Met behulp van dit systeem is het mogelijk om eiwitcoderende of RNA-interferentietransgenen tot co-expressie te brengen in cytoneme-producerende of doelwitcellen om hun effect op DP-PerM-celcontacten te meten. Dit systeem, dat gemakkelijk kan worden aangepast aan andere weefsels, maakt het dus mogelijk om factoren te identificeren die belangrijk zijn voor de vorming of functie van cytonen.

Introduction

De ontwikkeling van embryonale weefsels wordt gecontroleerd door cellen die zich in 'organiserende centra' bevinden en die signalen geven aan verre cellen in een weefsel, en hun beslissingen beheersen om zich te vermenigvuldigen (d.w.z. groeien en delen) of een bepaald lot aan te nemen¹. Deze niet-autonome signalering van cellen wordt gemedieerd door liganden die worden geproduceerd door organiserende centrumcellen die concentratiegradiënten door de weefsels vormen en concentratieafhankelijke reacties uitlokken. In veel gevallen worden deze liganden afgeleverd of opgepikt via lange actine-gebaseerde signalering....

Protocol

De nubbin-GAL4-driver wordt gebruikt om CD4-spGFP1-10 specifiek in het vleugelzakgebied van de DP tot expressie te brengen (Figuur 1A). De PerM-LexA-driver²¹ wordt gebruikt om CD4-spGFP11 specifiek in de PerM tot expressie te brengen (Figuur 1A). Deze twee expressiesystemen zijn onafhankelijk van elkaar, waardoor gelijktijdige en specifieke expressie van verschillende transgenen in DP en PerM mogelijk is (Figuur 1B,C).

Het genetische basisschema omvat het kruisen van vl....

Results

Om het nut van de GRASP-procedure voor het meten van contacten tussen DP- en PerM-cellen te testen, hebben we vleugelschijven van vier verschillende genotypen onderzocht: wildtype negatieve controleschijven (genotype: w¹¹¹⁸) die alleen achtergrondniveaus van autofluorescentie in het GFP-kanaal weergeven; schijven die de CD4-spGFP1-10 tot expressie brengen in de DP-laag, maar zonder het CD4-spGFP11-transgen, dat het fluorescentieniveau vertoont dat alleen door GFP1-10 .......

Discussion

Cytonemen spelen een belangrijke rol bij de verdeling van liganden en beheersen de groei en organisatie van zich ontwikkelende weefsels. Signaaluitwisseling vindt plaats waar cytoneme-tips intieme membraancontacten maken met hun doelen. In dit protocol beschrijven we een eenvoudige methode voor het analyseren van cytoneme-gemedieerde contacten tussen epitheellagen in de vleugelschijf met behulp van de GRASP-techniek.

De hier gepresenteerde techniek vereist min.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Discovery V12 dissection microscope	Zeiss		dissection microscope
Dumont #55 forceps, Biology tips	Fine Science Tools	11255-20	dissecting forceps
EP-Slik (slik20358)	BDSC	Panneton et al. 2015	fly strain for expressing Slik
FIJI		Schindelin J. et al. (2012)	image analysis software
Hoechst 33342	ThermoFisher Scientific	H3570	live imaging nuclear stain
LexAop-CD4-spGFP11	BDSC	93018	fly strain
LSM 700 confocal microscope	Zeiss		confocal microscope
nub-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Centre (BDSC)	86108	fly strain
PerM-LexA		Rambaud, Joseph et al., 2025	fly strain
PYREX 9-depression glass spot platesell	Corning Life Sciences	7220-85	for collecting and washing larvae
Schneider's Drosophila Medium	ThermoFisher Scientific	21720024	live-imaging medium
SecureSeal imaging spacers, 8-well, 0.12 mm thick	Grace Bio-Labs	654008	spacer
SYLGARD 184 silicone elastomer kit	Sylgard	3097358-1004	for making dissection plates
UAS-CD4-spGFP1-10	BDSC	93017	fly strain
Zen Black	Zeiss		acquisition software