Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een afstotingsmodel voor rattentransplantaat van darmtransplantatie met geëxterioriseerde ileostoma voor beoordeling van de longitudinale prognose

775 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68412

⸱

10 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, Graduation School of Medicine, The University of Osaka, 2Department of Stem Cell Therapy Science, Graduate School of Medicine, The University of Osaka

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een op ratten gebaseerd darmtransplantatiemodel met ileostoma voor tijdsverloopbeoordeling van geneesmiddelinterventie op transplantaatafstoting.

Samenvatting

Tot op heden blijft orgaantransplantatie de belangrijkste behandeling voor orgaanfalen. Bij verschillende vaste organen blijft de prognose van de patiënt na darmtransplantatie onbevredigend, voornamelijk als gevolg van afstoting van het transplantaat. Deze uitdaging vereist verdere verbetering van chirurgische technieken of de ontwikkeling van nieuwe postoperatieve farmacologische interventies. Dit artikel presenteert een rattenmodel van afstoting van darmtransplantaattransplantaten om als platform voor dergelijk onderzoek te dienen. Een deel van het ileum geïsoleerd uit de Fischer 344 (F344)-stam werd geallotransplanteerd aan een Lewis (LEW)-rat, gevolgd door toediening van tacrolimus in een bepaalde dosis en schema. Er werd een exteriorized ileostoma geconstrueerd om niet-invasieve, longitudinale monitoring van de weefselstatus van het allotransplantaat mogelijk te maken. Een trichromatisch lineair regressiemodel werd getraind met behulp van ileostomabeelden en gebruikt om een op beelden gebaseerd beoordelingsschema op te stellen dat in staat is om de ileostomastatus te evalueren op een schaal van 0 tot 10. Evaluatie wees uit dat de gezondheid van het transplantaat verslechterde vanaf de derde week na transplantatie. Histologische analyses van het allotransplantaat bevestigden tekenen van chronische afstoting vanaf postoperatieve dag (POD) 28, vergelijkbaar met die waargenomen bij menselijke patiënten, en valideerden de resultaten van de beoordeling van het niet-invasieve ileostomabeeld. Het hier gepresenteerde darmtransplantaatmodel en de bijbehorende beoordelingsmethoden zullen naar verwachting de ontwikkeling van behandelingen voor darmtransplantatie vergemakkelijken.

Inleiding

Orgaanfalen is een aandoening waarbij een of meer vitale organen suboptimaal functioneren en de gezondheid niet kunnen behouden. Vertraagde medische aandacht is vaak dodelijk of gaat gepaard met secundaire complicaties zoals infecties1. Voor de meeste organen is vervanging van het defecte orgaan de enige haalbare optie voor langdurig herstel. Sinds de ontdekking van herverwerving van stamvorming door somatische cellen2, is gepostuleerd dat deze geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) volledige organogenese mogelijk kunnen maken en een vrijwel onbeperkte bron van organen voor vervanging kunnen bieden. Door kennis van de embryonale ontwikkeling te combineren met een zorgvuldige controle van signaalsignalen, is succes geboekt bij het genereren van meerdere weefsels op de schaal van organoïden. Hoewel er recentelijk aanzienlijke vooruitgang is geboekt in specifieke organen zoals de ogen3,4, blijft allotransplantatie van menselijke donoren de gangbare benadering voor de meeste vitale organen, hoewel er recentelijk aanzienlijke vooruitgang is geboekt in specifieke organen 3,4.

Bij inwendige organen blijft darmtransplantatie onbevredigende prognostische resultaten vertonen en vereist verdere chirurgische verfijning of medicamenteuze interventie5. Nieuwe interventies worden zelden rechtstreeks bij menselijke proefpersonen getest en worden vaak eerst geëvalueerd in diermodellen van darmtransplantatie. Het huidige artikel beschrijft een rattenmodel van afstoting van darmtransplantaten om te dienen als beoordelingsplatform voor deze potentiële therapeutische ontwikkelingen.

Om de subtiele mismatch van het humaan leukocytenantigeen (HLA) na te bootsen die bij mensen werd waargenomen, werd een geslachtsgematcht (mannelijk) ileumsegment geïsoleerd uit een Fischer 344 (F344) rat getransplanteerd in een Lewis (LEW) rat, gevolgd door toediening van suboptimale doses van het immunosuppressivum tacrolimus tijdens de acute fase om afstoting van het transplantaat in de chronische fase te induceren. Dit donor-ontvangerpaar deelt dezelfde loci van het major histocompatibiliteitscomplex, maar verschilt in minor histocompatibiliteitsantigenen6. Bij deze methode werd een deel van het getransplanteerde slijmvlies geëxterioriseerd als een ileostoma om het visuele tijdsverloop van de transplantatieprognose en afstotingsstatus mogelijk te maken. Daarnaast wordt een complementaire, op ileostomabeelden gebaseerde methode gepresenteerd voor het kwantificeren van de afstotingstoestand, gevalideerd door overeenkomstige histologische veranderingen in het getransplanteerde transplantaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Graduate School of Medicine, The University of Osaka, onder referentienummer 04-018-003 en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Osaka. Ontvangende mannelijke Lewis (LEW) ratten (met een gewicht van 200-250 g, 7-9 weken oud) en donormannelijke Fischer 344 (F344) ratten (met een gewicht van 200-250 g, 10-12 weken oud) werden gebruikt. Voorafgaand aan de operatie werd de buikstreek geschoren en gesteriliseerd met 70% ethanol. Details van de reagentia en apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Donoroperatie

  1. Vast de donorrat gedurende 12 uur voorafgaand aan de operatie.
  2. Verdoof de donorrat met geïnhaleerd isofluraan (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Plaats de rat loodrecht op de bediener. Stel de stereomicroscoop tijdens de procedure in op een vergroting van 5x. Gebruik 5-0 zijde voor ligatie.
    OPMERKING: Het isofluraandebiet was 1,5 l/min. Isofluraan werd toegediend in een dosis van 2,5% tijdens de eerste incisie in de buik en werd tijdens de operatie op 1,5% gehouden. Adequate anesthesie werd bevestigd door de afwezigheid van teenreflex bij het knijpen van de teen. Breng indien nodig dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen na het bevestigen van de anesthesie.
  3. Voer een incisie van 8 cm in de middellijn uit om de buikholte te openen. Verleng de bovenste incisie naar het xiphoid-proces om een duidelijke visualisatie van de poortader (PV) te garanderen.
  4. Ontleed het Treitz-ligament en draai de dunne darm 180 graden met de klok mee om de darmrotatie om te keren.
  5. Observeer de mesenteriale vasculaire lussen en kies een goed gevasculariseerde transplantaatplaats, ongeveer 10 cm lang van het ileum (Figuur 1A1).
  6. Ontleed het distale mesenterium en lig de superieure mesenteriale slagader (SMA) en de superieure mesenteriale ader (SMV) van het distale ileum. Zorg ervoor dat SMA/SMV worden weggesneden van de proximale ligatie. Onjuiste ligatie kan bloedingen veroorzaken en de transplantaatperfusie in gevaar brengen.
  7. Verplaats de maag en milt craniaal om de PV duidelijk bloot te leggen.
  8. Ontleed en ligate de middelste darmslagader/-ader en de rechter darm-ader/-ader, gelegen aan de linkerkant van de SMA/SMV.
  9. Ontleed het mesenterium aan de rechterkant van de SMA/SMV en ligate de jejunale tak. Vermijd lig te dicht bij de SMV om knikken te voorkomen (Figuur 1A2).
  10. Scheid de SMA-basis voorzichtig met behulp van een wattenstaafje en lig het mesenterium tussen de aorta boven de SMA en de PV. Dit gebied bevat de superieure mesenteriale lymfeklieren en talrijke lymfevaten.
  11. Identificeer en ligate de rechter nierslagader, die zich aan de rechterkant van de aorta bevindt (Figuur 1A3).
  12. Injecteer gehepariniseerde zoutoplossing (200 E / 2 ml) in de penisader.
  13. Bepaal de uiteindelijke transplantaatlengte en ligeer overtollige mesenteriale takken. Ligate rechte slagaders aan zowel de proximale als de distale uiteinden van het transplantaat.
  14. Ligate de aorta onder de SMA, ligate vervolgens de aorta boven de SMA en accijns de SMA-basis samen met een cirkelvormig stuk van de aorta. Snijd de poortader door bij de levertrilm en zorg voor een schuine snede om een grote anastomoseopening te creëren.
    1. Ga verder met het doorsnijden van de proximale en distale vasculaire lussen en de darm. Plaats het geëxtraheerde transplantaat in een koude zoutoplossing (4 °C) (figuur 1A4).
  15. Verwijder de proximale aortaligatie om verbloeding te induceren en euthanasie van de donorrat (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).

2. Verwerking van transplantaten

  1. Identificeer de superieure mesenteriale slagader (SMA) en de poortader (PV).
  2. Doordrenk het transplantaat voorzichtig met 15 ml koude zoutoplossing via de SMA (Figuur 1B1). Controleer of al het bloed is vervangen en dat de kleur van het transplantaat bleek of wit wordt.
  3. Was het lumen van het darmtransplantaat en verwijder de ontlasting.
  4. Houd het transplantaat ondergedompeld in verse koude zoutoplossing tot de transplantatie.

3. Operatie van de ontvanger

  1. Verdoof de ontvangende rat met geïnhaleerd isofluraan (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Plaats de rat loodrecht op de bediener.
    1. Stel de stereomicroscoop in op 5× voor algemene procedures en op 12,5× tijdens vasculaire anastomose. Gebruik 5-0 zijde voor ligatie en 8-0 Synthetisch polypropyleen hechtdraad voor vasculaire anastomose. Plaats de rat op een verwarmingskussen om onderkoeling tijdens de operatie te voorkomen.
      OPMERKING: Het isofluraandebiet was 1,5 l/min. Isofluraan werd toegediend in een dosis van 2,5% tijdens de eerste incisie in de buik en werd tijdens de operatie teruggebracht tot 1,5%. Anesthesie werd bevestigd door de afwezigheid van teenreflex na een teenbeknelling. Breng indien nodig veterinaire zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen na bevestiging van de anesthesie.
  2. Injecteer vóór de operatie 0,5 mg/kg tacrolimus intramusculair. Maak een incisie in de middellijn (~5 cm) en open de buikholte.
  3. Beweeg de darm en de dikke darm craniaal en ontleed het Treitz-ligament. Wikkel de darm en dikke darm in vochtig gaas en plaats ze op het lichaam van de rat.
  4. Ontleed het peritoneum over de inferieure vena cava (IVC) en aorta (Figuur 1B2). Identificeer en ligate de rechter gonadale slagader en ader. Zoek de juiste urineleider.
  5. Draai de rat 90° tegen de klok in zodat de kop naar links van de bediener wijst. Klem de IVC boven de rechter nierader met behulp van een gebogen Bulldog vaatklem.
  6. Snijd de IVC-muur in met een schaar om een ovale opening te creëren. Spoel met zoutoplossing en plaats een steunhechtdraad op de caudale rand van de IVC (Figuur 1B3-1). Zorg ervoor dat de veneuze anastomoseopening groot is (~1 cm) en rek de PV-wand voldoende uit bij de anastomose.
  7. Plaats het transplantaat aan de linkerkant van de rat en plaats de PV en SMA in de buurt van de IVC en aorta. Richt het distale ileum naar het hoofd. Wikkel het transplantaat in koud, vochtig gaas en breng ijs aan om een lage temperatuur te behouden.
  8. Steek de steunhechtnaald (8-0 synthetische polypropyleen hechtdraad) door de caudale rand van de PV. Gebruik een muggenklem om de hechtingsspanning onder controle te houden.
  9. Hecht en bind de schedelrand van de PV vast aan de IVC (PV naar IVC). Anastomose van de achterste PV-wand (IVC naar PV) (Figuur 1B3-2). Bind de steunhechtdraad aan de rechterkant van de PV. Anastomose vervolgens de voorste PV-wand (PV tot IVC).
    1. Voordat de anastomose wordt voltooid, klemt u het transplantaat PV vast en injecteert u gehepariniseerde zoutoplossing. Bind de hechtdraad vast en laat de IVC-klem los (Figuur 1B3-3).
      OPMERKING: De eerste bloeding kan optreden bij de anastomose, maar deze wordt meestal spontaan onder controle gehouden.
  10. Klem de aorta boven de bifurcatie van de darmbeenbeen vast met een gebogen Bulldog-klem.
  11. Snijd de aortawand in. Plaats een steunhechtdraad (8-0 synthetische polypropyleen hechtdraad) op de schedelrand van de aorta en de SMA (~4-5 mm) (Figuur 1B4-1). Houd de hechting vast met een muggenklem om de spanning onder controle te houden.
  12. Geef nog een 8-0 door naald door de caudale rand van de SMA en de aorta. Bind vast en begin met anastomose aan de rechterkant van de rat (Figuur 1B4-2). Bind de steunhechtdraad vast.
  13. Draai de rat 180° zodat de kop naar rechts van de bediener wijst. Voltooi de SMA-naar-aorta-anastomose aan de linkerkant. Vóór de definitieve hechting klemt u het transplantaat PV vast en injecteert u gehepariniseerde zoutoplossing. Bind de hechtdraad vast (Figuur 1B4-3).
  14. Maak de aorta- en PV-klemmen los voor reperfusie (Figuur 1B5). De eerste bloeding kan optreden, maar deze kan onder controle worden gehouden met lichte druk met behulp van een wattenstaafje. Het transplantaatslijmvlies zou binnen enkele minuten roze moeten worden (Figuur 1B6).
  15. Draai de rat 90° zodat de kop naar de andere kant wijst. Maak twee incisies in de huid van 8 mm op de rechterbuik en exteioriseer de proximale en distale uiteinden van het ileumtransplantaat.
    1. Hecht de huid en transplanteer serosa met 5-0 polydioxanon (PDS) (Figuur 1B7). Sluit de incisie in de middellijn met 5-0 PDS om de operatie te voltooien.
      OPMERKING: Postoperatieve ratten moeten zorgvuldig worden gecontroleerd totdat ze volledig bij bewustzijn zijn. Keer niet terug naar de kooi voordat sternale lighouding is bereikt.

4. Postoperatieve behandeling

  1. Om het transplantaat tijdens de acute fase te behouden, injecteert u tacrolimus in een dosis van 0,5 mg/kg intramusculair op postoperatieve dagen (POD) 1-13, 20 en 277.
    OPMERKING: Dien opeenvolgende injecties toe op afwisselende benen. Als alternatief kan tacrolimus subcutaan worden toegediend.
  2. Injecteer meloxicam in een dosis van 0,4 mg/kg subcutaan op POD 1-3.
    OPMERKING: Ontvangende ratten verliezen meestal gewicht tot POD 7, met herstel door POD 14. Subcutane injecties met zoutoplossing kunnen worden toegediend om uitdroging als gevolg van vochtverlies door de ileostoma te verminderen. Onverwachte mortaliteit treedt op in ongeveer 20% van de gevallen vóór POD 7. De overleving en de algemene gezondheid zijn daarna doorgaans stabiel.

5. Beeldbeoordeling van de gezondheidstoestand van het darmtransplantaat

  1. Open een afbeelding van de ileostoma in Afbeelding J. Converteer de afbeelding naar een RGB-stapel door Afbeelding te selecteren > Type > RGB-stapel.
    OPMERKING: Als de afbeelding nog niet in RGB-indeling is, converteert u deze eerst naar RGB-kleur met behulp van Afbeelding > Type > RGB-kleur.
  2. Selecteer een interessegebied (ROI) dat alleen het zichtbare slijmvliesgebied van de ileostoma omvat.
  3. Meet de intensiteit van elk kanaal (rood, groen en blauw) binnen de geselecteerde ROI.
  4. Bereken de gezondheidsscore van het transplantaat met behulp van de volgende formule:
    Score = figure-protocol-1
    OPMERKING: Normaliseer de eindscore zodat: Als Score > 10, wijs dan een waarde van 10 toe; Als Score < 0, wijst u een waarde van 0 toe.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve beelden van de belangrijkste chirurgische controlepunten worden weergegeven in figuur 1. Het slagingspercentage van de reperfusie was bijna 100% en het postoperatieve overlevingspercentage was 80,0% (20 van de 25 operaties). Toen de procedures correct werden uitgevoerd en tacrolimus werd toegediend in de gespecificeerde dosering en het gespecificeerde schema, werd de geëxterioriseerde ileostoma meestal witachtig - een indicatie van afstoting ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel dierstudies essentieel zijn voor de ontwikkeling van verbeterde chirurgische en farmacologische interventies voor betere korte- en langetermijnresultaten van darmtransplantatie, is het empirisch moeilijk geweest om de techniek van darmtransplantatiechirurgie bij ratten vast te stellen. Hier worden chirurgische ingrepen van heterotope darmtransplantatie in detail beschreven. Bij deze methode waren de operatietijden van de donor en de ontvanger respectievelijk ongeveer 35 minuten en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Ka.T. is een wetenschappelijke oprichter, aandeelhouder van en ontving onderzoeksfinanciering van StemRIM Inc. Alle andere auteurs verklaren dat ze geen concurrerende belangen hebben.

Dankbetuigingen

Het Center for Medical Research and Education, Graduate School of Medicine, The University of Osaka, leverde de nodige instrumenten voor confocale microscopische beeldvorming van de allotransplantaten. Het werk werd ondersteund door een onderzoeksfonds van StemRIM tot Ka.T..

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-0 silk braided 40cm black alfresa pharma62-9965-34
5-0 silk braided 40cm white alfresa pharma62-9964-99
8-0 PROLENE BV130-5 45cmETHICONEP8730H
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG(H+L)InvitrogenA11005working conc.: 2ug/ml
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG(H+L)InvitrogenA21245working conc.: 2ug/ml
Barraquer Micro Needle Holder, 8mm CVD Jaw, 6"
Bulldog vascular clamp 35mmNatsumeC-42-S-2
Fischer 344 (F344)  Japan SLC (Shizuoka, Japan)donor, male, 10 tot 12 weken oud
Lewis (LEW) rats Japan SLC (Shizuoka, Japan)recipients, male, 7 tot 9 weken oud
MicroscissorsYDMCC06C
Microsurgery Suture Forceps - Curved, Platforms, Round Handles: 15 cm/6 in
Ms mAb to Collagen IabcamAB90395working conc.: 1000x verdunning
NORMAL SALINE 500 mLOTSUKA 3311401A8024
Plastic vascular double clampMicrosurgery training ltd
Prograf injectie 5 mgAstellas Pharma3999416A1028
Rb pAb to LamininabcamAB11575working conc.: 2ug/ml
Small animal anesthetizerMuromachi kikaiMK-A100
Surgical microscope OPMI-1FRCarl ZeissOPMI-1FR
SUTURE, 5/0 18 PDS II CLR MONO P, VAETHICONZ493G

Referenties

  1. Pedersen, P. B., Henriksen, D. P., Brabrand, M., Lassen, A. T. Organ failure, aetiology and 7-day all-cause mortality among acute adult patients on arrival to an emergency department: A hospital-based cohort study. Eur J Emerg Med. 28 (6), 448-455 (2021).
  2. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  3. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  4. Soma, T., et al. Induced pluripotent stem-cell-derived corneal epithelium for transplant surgery: a single-arm, open-label, first-in-human interventional study in Japan. Lancet. 404 (10466), 1929-1939 (2024).
  5. Parizhskaya, M., et al. Chronic rejection of small bowel grafts: Pediatric and adult study of risk factors and morphologic progression. Pediatr Dev Pathol. 6 (3), 240-250 (2003).
  6. Isono, M., Poltorak, M., Kulaga, H., Adams, A. J., Freed, W. J. Certain host-donor strain combinations do not reject brain allografts after systemic sensitization. Exp Neurol. 122 (1), 48-56 (1993).
  7. Li, Y., et al. Long-term comparison of rat model of chronic allograft rejection of orthotopic small bowel transplantation induced by cyclosporine versus tacrolimus. Transplant Proc. 45 (5), 1811-1815 (2013).
  8. Kitamura, K., et al. Orthotopic small bowel transplantation in rats. J Vis Exp. (69), e4102(2012).
  9. Kitamura, K., et al. Chronic rejection after intestinal transplantation: A systematic review of experimental models. Transplant Rev. 33 (3), 173-181 (2019).
  10. Pech, T., et al. Combination therapy of tacrolimus and infliximab reduces inflammatory response and dysmotility in experimental small bowel transplantation in rats. Transplantation. 93 (3), 249-256 (2012).
  11. Stringa, P., et al. Small bowel transplantation in rats: A multicenter experience summarizing the pitfalls to be overcome. Trends Transplant. 10 (1), 1-7 (2017).
  12. Gerlach, U. A., et al. Intragraft and systemic immune parameters discriminating between rejection and long-term graft function in a preclinical model of intestinal transplantation. Transplantation. 101 (5), 1036-1045 (2017).
  13. Pech, T., et al. Intestinal regeneration, residual function and immunological priming following rescue therapy after rat small bowel transplantation. Am J Transplant. 12 (Suppl 4), S9-S17 (2012).
  14. Swenson, S. M., Roberts, J. P., Rhee, S., Perito, E. R. Impact of the Pediatric End-Stage Liver Disease (PELD) growth failure thresholds on mortality among pediatric liver transplant candidates. Am J Transplant. 19 (12), 3308-3318 (2019).
  15. Kimura, K., Money, S. R., Jaffe, B. M. The effects of size and site of origin of intestinal grafts on small-bowel transplantation in the rat. Surgery. 101 (5), 618-622 (1987).
  16. Abu-Elmagd, K. M., et al. Preformed and de novo donor-specific antibodies in visceral transplantation: Long-term outcome with special reference to the liver. Am J Transplant. 12 (11), 3047-3060 (2012).
  17. Lavin, Y., et al. Tissue-resident macrophage enhancer landscapes are shaped by the local microenvironment. Cell. 159 (6), 1312-1326 (2014).
  18. Stakenborg, M., et al. Enteric glial cells favor accumulation of anti-inflammatory macrophages during the resolution of muscularis inflammation. Mucosal Immunol. 15 (6), 1296-1308 (2022).
  19. Li, Y. -T., Takaki, E., Ouchi, Y., Tamai, K. Guided monocyte fate to FRβ/CD163+ S1 macrophage antagonises atopic dermatitis via fibroblastic matrices in mouse hypodermis. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 14(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Rattenmodellongitudinale beoordelingmonitoring van allograftentoediening van tacrolimushistologische analysebeeldgebaseerde beoordelingchronische afstoting
Een afstotingsmodel voor rattentransplantaat van darmtransplantatie met geëxterioriseerde ileostoma voor beoordeling van de longitudinale prognose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.