Methodenartikel

Bioprinting van hydrogeltumorplakjes als 3D-model voor mantelcellymfoom

1.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68417

⸱

12 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology and University of Tuebingen, 2Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institute, 3Department of Clinical Pathology, Robert Bosch Hospital, 4Robert Bosch Hospital, 5Departments of Clinical Pharmacology, Pharmacy and Biochemistry, University of Tuebingen, 6iFIT Cluster of Excellence (EXC 2180), Image-guided and Functionally Instructed Tumor Therapies, University of Tuebingen, 7German Cancer Consortium (DKTK) and German Cancer Research Center (DKFZ), Partner Site Tuebingen, 8National Center for Tumor Diseases (NCT), NCT South-West, a partnership between DKFZ, University Hospital Tuebingen, University of Tuebingen, Tuebingen, Bosch Health Campus, Stuttgart, Robert Bosch Hospital, Stuttgart, University Hospital Ulm, and Ulm University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het genereren, kweken en analyseren van mantelcellymfoom in 3D-geprinte hydrogel-tumorplakjes.

Samenvatting

Mantelcellymfoom (MCL) is een zeldzaam, agressief B-celneoplasma dat vaak terugvalt en slechts een beperkte respons vertoont op conventionele chemotherapie. Een grote uitdaging in MCL-onderzoek is het ex vivo kweken van primaire MCL-cellen, aangezien cellen de neiging hebben om spontane apoptose te ondergaan wanneer ze worden gekweekt in 2D-suspensiecultuur. Hoewel bekend is dat 3D-modellen de in vivo situatie van solide tumoren beter samenvatten, is hun toepassing nog steeds slecht onderzocht bij lymfomen. Het ontwikkelen van 3D-modellen die de in vivo omstandigheden van MCL in de lymfeklier repliceren, zou hun overleving kunnen verbeteren, de studie van de MCL-tumor micro-omgeving overspraak kunnen vergemakkelijken en de in vivo geneesmiddelrespons kunnen nabootsen. Hier werd een 3D-geprint model van MCL in de vorm van hydrogel-tumorschijfjes opgesteld, samen met een geoptimaliseerde kweekmethode. Er werd een gestandaardiseerd proces ontwikkeld met behulp van MCL-cellijnen of primaire MCL-cellen, waarbij de cellen worden ondergedompeld in een hydrogel die alginaat, type I collageen en basaalmembraanmatrix bevat door bioprinting in een gelatinesteunbad. De resulterende MCL-hydrogeltumorplakjes worden gekweekt op een filterdrager om hun stabiliteit gedurende de kweekperiode te behouden. Medicamenteuze behandelingen kunnen op het systeem worden toegepast. De respons van afzonderlijke cellen in de hydrogel-tumorschijf kan worden gevolgd door vierkleurige live 3D-fluorescentiebeeldvorming. Primaire MCL-cellen vertoonden een stabiele levensvatbaarheid wanneer ze werden gekweekt in de plakjes hydrogeltumor. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het genereren, kweken en analyseren van MCL-cellen in plakjes hydrogeltumor. Door de micro-omgeving van de tumor nauwkeurig na te bootsen en gebruik te maken van een lucht-vloeistof-interfacecultuur, verbetert het gepresenteerde model de fysiologische relevantie in vergelijking met de traditionele 2D-cultuur. Het biedt een aanzienlijk potentieel voor het bevorderen van zowel biologische als therapeutische studies van MCL.

Inleiding

Mantelcellymfoom (MCL) is een zeldzaam en agressief B-cel non-Hodgkin-lymfoom afkomstig uit de mantelzone van lymfeklieren1. De mantelzone bestaat uit een ring van kleine lymfocyten rond het kiemcentrum van de B-celfollikel. Doorgaans vertoont MCL een agressief klinisch verloop, met frequente recidieven na de initiële chemotherapie. Als gevolg van een beter begrip van ziektevorming1 en de ontwikkeling van nieuwe behandelingen, waaronder immunochemotherapie2, Bruton's tyrosinekinaseremmers3 of antilichaam-geneesmiddelconjugaten4, hebben behandelingsopties voor MCL-patiënten geleid tot verbeterde responspercentages en een verlengde progressievrije overleving. Resistentie tegen geneesmiddelen en recidieven maken de ziekte echter nog steeds ongeneeslijk5. Gedeeltelijk is dit een gevolg van de heterogeniteit en de invloed van de micro-omgeving van de tumor op de ontwikkeling van tumoren en resistentie tegen geneesmiddelen6. Een uitdaging bij het bestuderen van MCL is de moeilijkheid om primaire MCL-cellen te kweken in suspensiecultuur7, aangezien cellen ex vivo spontane apoptose ondergaan 4,5. Dit benadrukt de behoefte aan alternatieve benaderingen om MCL beter te modelleren in preklinische modellen.

In vivo zijn tumoren driedimensionale (3D) structuren die zijn samengesteld uit verschillende cellulaire componenten, waaronder tumorcellen, immuuncellen en stromale cellen, evenals niet-cellulaire componenten zoals de extracellulaire matrix (ECM). De ECM, die bestaat uit macromoleculen zoals collageen en laminine, vormt een complex vezelachtig netwerk van elastische vezels dat zeer hydrofiel is, waardoor een gelachtige omgeving ontstaat 2,8,9,10. Om deze in vivo aandoeningen van tumoren ex vivo beter na te bootsen, is een verscheidenheid aan 3D-modellen ontwikkeld. In de afgelopen jaren zijn deze modellen cruciaal geworden voor het bestuderen van kankerfarmacologie en biologie, voornamelijk gericht op solide tumoren11.

Tot op heden blijft dit veld slecht onderzocht bij lymfomen, aangezien hematologische kankercellen het vermogen hebben om zowel in suspensie als in stromale omgevingen zoals lymfeklieren, het beenmerg of secundaire lymfoïde weefsels te groeien12. In vivo verspreiden MCL-cellen zich vanuit de mantelzone van lymfeklieren in het bloed of het beenmerg, hoewel ze zich voornamelijk vermenigvuldigen in de lymfeklieren waaruit ze afkomstig zijn13,14. In de lymfeklieren worden MCL-cellen omgeven door T-cellen, macrofagen en mesenchymale stromale cellen, waarvan is aangetoond dat ze de overleving of geneesmiddelrespons van MCL-cellen beheersen 14,15,16,17,18. Bovendien zijn de overspraak tussen MCL en de micro-omgeving van de tumor, evenals de porositeit en mechanische eigenschappen, belangrijke factoren die de respons en resistentie tegen geneesmiddelen kunnen beïnvloeden 6,14. Er zijn dus gestandaardiseerde en reproduceerbare 3D-tumormodellen van MCL nodig die de natuurlijke micro-omgeving simuleren om primaire MCL te bestuderen. Tot nu toe zijn er voornamelijk celgebaseerde modellen zoals sferoïden of organoïden van primaire MCL-cellen vastgesteld 6,19. Ze verbeteren met succes de levensvatbaarheid en langetermijncultuur van primaire MCL-cellen. De extracellulaire matrix is echter ondervertegenwoordigd in deze modellen. In deze context biedt geavanceerd 3D-bioprinten een veelbelovende aanpak. Door levende cellen en hydrogels direct te assembleren, maakt deze technologie het mogelijk om fysiologisch relevante 3D-lymfekliermodellen op basis van hydrogel te genereren.

Hier werd een 3D bioprinted model van MCL in de vorm van hydrogel-tumorschijfjes opgesteld, samen met een geoptimaliseerde kweekmethode. Cellen worden ingebed in hydrogelschijfjes op basis van collageen type I-, alginaat en Matrigel door omkeerbare inbedding van gesuspendeerde hydrogels in vrije vorm (FRESH) bioprinting20. De hydrogel-tumorschijfjes worden gekweekt op een filterdrager, waardoor de MCL-cellen kunnen groeien in een omgeving die de in vivo omstandigheden van de lymfeklier nauwkeurig recapituleert.

Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van het genereren, kweken en analyseren van MCL-cellen in hydrogel-tumorplakjes. Door gebruik te maken van vierkleurige live 3D-fluorescentiebeeldvorming, kan de levensvatbaarheid of geneesmiddelrespons van afzonderlijke cellen in de hydrogeltumorschijf worden gevolgd. Primaire MCL-cellen vertoonden een verbeterde overleving wanneer ze werden gekweekt in de plakjes hydrogeltumor. Dit model biedt een hulpmiddel voor het bestuderen van MCL-biologie en behandelingsrespons, en maakt de weg vrij voor het begrijpen van micro-omgevingsinvloeden en MCL-patiëntvariabiliteit.

Protocol

Het werken met primaire MCL-cellen moet worden goedgekeurd door de lokale ethische commissie. In deze studie keurde de ethische commissie van de Medische Faculteit, de Eberhard-Karls-Universiteit en het Universitair Ziekenhuis Tübingen het verzamelen en bewerken van patiënt- en gezonde donormonsters goed (projectnummer 159/2011BO2), en werd geïnformeerde schriftelijke toestemming van de patiënten verkregen in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki. De primaire MCL-cellen die hier werden gebruikt, werden geïsoleerd uit hele lymfeklieren van MCL-patiënten en omvatten dus niet alleen MCL-cellen, maar ook andere cellen zoals immuuncellen en fibroblasten.

1. Bereiding van gelatinebrij voor het steunbad

OPMERKING: De gelatineslurry zal dienen als steunbad tijdens het 3D-bioprintproces. Het induceert verknoping van de bio-inkt, waardoor de vorming van een 3D-structuur mogelijk wordt. De bereiding van de gelatinebrij moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een celkweekkap.

  1. Bereid een gelatineoplossing van 4,5% (m/v) in 10 mM HEPES en 11 mM CaCl2 door 6,75 g gelatinepoeder op te lossen in 1,5 ml 1 M HEPES, 15 ml 110 mM CaCl2 en 133,5 ml steriel H2O in een steriele weckpot met deksel. Zorg ervoor dat de Mason-pot geschikt is om te mengen in een krachtige mixer.
  2. Incubeer de oplossing bij 37°C gedurende 4 uur of totdat er geen uitstrijkjes meer worden waargenomen bij het roeren van de oplossing, wat aangeeft dat de gelatine volledig is opgelost. Koel de gelatine een nacht of minstens 12 uur af op 4°C.
  3. Bereid een steriele wasbuffer voor die bestaat uit 10 mM HEPES en 14,4 mM CaCl2. Koel de wasbuffer voor tot 4°C.
  4. Breek de gestolde 4,5% gelatine met een steriele lepel in verschillende stukken.
  5. Vul de Mason-pot met de 4,5% gelatine volledig met de voorgekoelde wasbuffer en zorg ervoor dat de buffer koud blijft tijdens het bereiden van de gelatinebrij.
  6. Vries de gelatinehoudende Mason-pot 45-60 minuten in bij -20°C, totdat de gelatinesuspensie 0°C bereikt, maar nog niet is begonnen met het vormen van ijskristallen. Gebruik een thermometer om de temperatuur in de gaten te houden.
  7. Bevestig het deksel en het mes van de mixer aan de Mason-pot en monteer de Mason-pot vervolgens op de mixer. Mix de gelatinesuspensie gedurende 120 s met de pulsinstelling.
    NOTITIE: Het kan zijn dat de instellingen van de blender moeten worden aangepast bij gebruik van een ander type blender.
  8. Breng de gemengde suspensie over in voorgekoelde buizen van 50 ml. Centrifugeren bij 3.800 x g gedurende 2 minuten bij 4°C. Zorg ervoor dat de suspensie wordt gescheiden in een vaste gelatinesuspensie aan de onderkant en de vloeibare wasbuffer aan de bovenkant.
  9. Voer de volgende stap uit op ijs: Was de gelatinebrij. Zuig de bovenste vloeistoflaag op en probeer de luchtbellen te verwijderen die zichtbaar zijn bovenop de wasbuffer. Voeg 20 ml verse wasbuffer van 4°C toe aan de tube. Draai de buis om de gelatinebrij te mengen met de wasbuffer.
  10. Herhaal het centrifugeer- en wasproces minimaal 3x, of totdat er geen luchtbellen meer zichtbaar zijn aan de bovenkant van de wasbuffer. Verwijder na de laatste wasbeurt eventuele resterende wasbuffer door aspiratie. De gelatinebrij kan enkele weken bij 4°C worden bewaard.

2. Bereiding van met cellen beladen bio-inkt

  1. Bereid 1-2 dagen voor het afdrukken een steriele oplossing van 5% alginaat voor. Voeg 1 g Alginaat toe aan 20 ml steriel PBS in een tube van 50 ml. Om droge alginaatpoederresten te voorkomen, voegt u de PBS in kleine stappen toe, vortexing tussen toevoegingen. Incubeer de oplossing in een waterbad van 37 °C gedurende enkele uren of een nacht op een buisroller bij kamertemperatuur. Zodra het alginaat volledig is opgelost, bewaart u de oplossing bij 4 °C totdat u het nodig heeft.
  2. Als u met een MCL-cellijn werkt, kweek de cellen dan in suspensie in een T75-kolf. Zorg er op de dag van afdrukken voor dat er 1,4 x 107 cellen beschikbaar zijn voor de bereiding van 1 ml bioink, wat 9-10 plakjes hydrogeltumor oplevert.
  3. Als er met primaire MCL-cellen wordt gewerkt, hoeven cellen niet in suspensiecultuur te worden gekweekt voordat ze worden gebioprint. Ontdooi de gecryopreserveerde primaire MCL-cellen direct voor het bioprinten. Breng de primaire MCL-cellen over in een buis van 50 ml met kweekmedium. Om het resterende vriesmedium te verwijderen, centrifugeert u de buis onmiddellijk gedurende 5 minuten op 340 x g en verwijdert u vervolgens het supernatant. Resuspendeer de celkorrel in 20 ml vers medium voor het tellen van de cellen.
  4. Bereid op de dag van afdrukken de bioink voor die is aangepast aan de cellen van belang. Bereid voor Jeko-1-cellen een bioink voor die bestaat uit 0,5% (w/v) alginaat, 20% (v/v) type-I collageen, 1x RPMI en 2 mM HEPES. Meng 100 μL 5% alginaat, 200 μL type-I collageen, 100 μL 10x RPMI, 200 μL 10 mM HEPES en 350 μL PBS voor 1 ml bio-inkt. Cellen worden toegevoegd in stap 2.6.
  5. Bereid voor primaire MCL-cellen een bioink voor die bestaat uit 0,5% (w/v) alginaat, 20% (v/v) type-I collageen, 1x RPMI en 0,5 mM HEPES. Meng 100 μL 5% alginaat, 200 μL type-I collageen, 100 μL 10x RPMI, 50 μL 10 mM HEPES en 500 μL basaalmembraanmatrix voor 1 ml bioink. Cellen worden toegevoegd in stap 2.6. Als u met een MCL-cellijn werkt, breng dan de celsuspensie over van de kweekkolf in een buisje van 50 ml.
  6. Meng de cellen met 0,4% trypan blauw in een verhouding van 1:1. Tel de levensvatbare cellen (onbevlekt) met behulp van een cellenteller of een Neubauer-kamer. Bereken het volume celsuspensie voor 1 ml bioink, wat overeenkomt met 1,4x107 cellen. Breng het berekende volume over in een nieuwe buis van 50 ml. Centrifugeer 5 minuten op 340 x g en verwijder vervolgens het supernatant. Resuspendeer de celpellet in de voorbereide bioink om de uiteindelijke met cellen beladen bioink te genereren.
    OPMERKING: Er werd geschat dat de celpellet een volume heeft van 50 μL medium. Samen met de bioink die in stap 2.4 is voorbereid, levert dit 1 ml bioink op.

3. Bioprinten in bad

OPMERKING: Voer het 3D-printproces indien mogelijk uit in een steriele omgeving, zoals onder een celkweekkap. De gebruikte 3D-printer is aangepast voor FRESH-printen door een spuitpompverlenger toe te voegen, zoals beschreven in Hinton et al.20.

  1. Zet de bioprinter aan en sluit deze aan op de 3D-printer software. Open het .stl-bestand met de blauwdruk voor de plakjes hydrogeltumor. Er kunnen maximaal 5 plakjes tegelijk worden geprint. Zorg ervoor dat elk schijfje hydrogeltumor een diameter heeft van 8 mm en een hoogte van 1,5 mm. Stel de vuldichtheid in op 85%. Thuis de printerkop.
    OPMERKING: Het STL-bestand is ontworpen met Fusion 360 en is te vinden in het aanvullende coderingsbestand 1. Voor het 3D-printen werd de software Cura versie 15.04.5 gebruikt.
  2. Breng de eerder bereide gelatinebrij over in een petrischaaltje met een diameter van 35 mm tot deze halfvol is. Zorg ervoor dat er geen luchtspleten in de gelatinebrij achterblijven. Trek overtollig water uit de slurry met behulp van wegwerpbare precisiedoekjes om een gelatinesteunbad te genereren, dat pasteus is en zijn vorm behoudt totdat er voldoende kracht wordt uitgeoefend.
  3. Breng de met cellen beladen bioink over in een glazen spuit van 2.5 ml en sluit deze aan op een stomp mondstuk van 0.8 mm. Keer de spuit om en verwijder voorzichtig overtollige lucht en luchtbellen. Zodra de spuit is voorbereid, plaatst u deze in de bioprinter. Gebruik de 3D-printersoftware om bioink te extruderen totdat deze uit het mondstuk begint te worden geworpen. Veeg de uitgestoten bioinkdruppel weg met een wegwerpbare wetenschappelijke precisieveeg om verstopping van het mondstuk te voorkomen.
  4. Plaats het gelatinesteunbad direct onder het mondstuk van de spuit. Laat de printerkop zakken totdat het mondstuk zich in de gelatineslurry bevindt, 2 mm boven de bodem van het steunbad.
  5. Start het printproces via de 3D-printer software.
  6. Zodra het printproces is voltooid, verwijdert u overtollige gelatineslurry uit het mondstuk om verstopping te voorkomen. Haal het steunbad met de hydrogel-tumorschijfjes eruit en dek het af met een deksel om de steriliteit te behouden.
  7. Incubeer het steunbad met de bedrukte hydrogel-tumorschijfjes bij 37 °C om de gelatine te laten smelten. Deze stap maakt de geprinte hydrogel-tumorplakjes los van het steunbad.
  8. Verwarm de wasbuffer en het celkweekmedium voor op 37 °C. Terwijl de gelatine smelt, maak je een bord met 6 putjes klaar voor het wassen van de plakjes hydrogeltumor. Vul twee putjes met 10 mM HEPES, 14,4 mM CaCl2 wasbuffer (dezelfde buffer die wordt gebruikt voor het wassen van de gelatineslurry) en twee putjes met celkweekmedium.
  9. Zodra de gelatine is gesmolten, gebruikt u een steriele spatel om de plakjes hydrogeltumor in de wasbuffer over te brengen. Was de plakjes elk 1 minuut, eerst in de twee wasbufferhoudende putjes en vervolgens in de twee mediumhoudende putjes. De met cellen beladen hydrogel-tumorschijfjes zijn nu klaar voor kweek.
  10. Bewaar de resterende bioink om het afdrukproces te herhalen.

4. Hydrogel tumor plak cultuur en behandeling

  1. Om de hydrogelplakken te kweken, brengt u ze over op een filterdrager (poriegrootte van 0,4 μm) die in een plaat met 6 putjes is geplaatst. Kweek tot 5 hydrogelplakken op een enkele filterdrager. Voeg 1,5 ml celkweekmedium toe onder de filtersteun. Leg een druppel medium op de plakjes hydrogeltumor om te voorkomen dat ze uitdrogen.
  2. Voor de medicamenteuze behandeling van hydrogel-tumorschijfjes voegt u de gewenste hoeveelheid van het medicijn toe aan het celkweekmedium. Hier werden hydrogeltumorschijfjes behandeld met 0,33 μM-27 μM doxorubicine gedurende 48 uur of 72 uur. Kweek altijd een set plakjes zonder behandeling als controle.
  3. Plaats de 6-wells plaat met de hydrogel tumorschijfjes in een celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 voor de gewenste kweekperiode.

5. Analyse van de levensvatbaarheid van cellen door middel van trypanblauw-uitsluitingstest

  1. Om de levensvatbaarheid van de cellen na kweek of behandeling te beoordelen, lost u de plakjes hydrogeltumor op. Breng een schijfje hydrogeltumor over in een tube van 1,5 ml. Voeg 500 μL per plak van een oplosbuffer toe die 30 mM EDTA, 55 mM natriumcitraat en 150 mM natriumchloride (pH 6,8) bevat. Pipetteer op en neer totdat de hydrogel volledig is opgelost.
  2. Centrifugeer de oplossing op 340 x g gedurende 5 min. Aspiratie van het bovenlevende. Resuspendeer de cellen in 500 μL medium per opgeloste hydrogelschijf.
  3. Meng de celsuspensie in een verhouding van 1:1 met 0,4% trypanblauw. Tel de levensvatbare (niet-bevlekte) en dode cellen (gekleurd) met een cellenteller of een Neubauer-kamer. Noteer het aantal levende en dode cellen voor verdere analyse.

6. Vierkleuren live 3D-fluorescentiebeeldvorming

OPMERKING: De vierkleurenkleuring die hier wordt gebruikt, maakt differentiatie mogelijk tussen levende cellen (TMRM-positief), apoptotische cellen (fluorogene Caspase-3 substraat-positief) en dode cellen (PicoGreen-positief)21,22,23. Kernen worden gedetecteerd met DRAQ5. Dit protocol kan echter worden aangepast aan andere fotostabiele, specifieke fluorescentiekleurstoffen om de biomarkers, cellulaire structuren of celtypen van uw keuze te detecteren. Zorg er vóór het kleuren voor dat de microscoop de golflengten van de fluoroforen die voor de kleuring worden gebruikt, kan detecteren.

  1. Voor een vierkleurige kleuring van een hydrogeltumorschijf, bereidt u een kleuringsoplossing voor door TMRM-, DRAQ5- en fluorogeen Caspase-3-substraat toe te voegen aan 1 ml celkweekmedium met een uiteindelijke concentratie van respectievelijk 0,5 μM, 5 μM en 2 μM.
  2. Breng met een steriele spatel een schijfje hydrogeltumor over op een glazen dekglaasje met kamer. Voeg de bereide kleuroplossing toe aan de hydrogelschijf totdat deze volledig bedekt is. Incubeer het monster gedurende 20 minuten bij 37 °C in het donker.
  3. Verzamel na de eerste incubatie de kleuringsoplossing die de hydrogeltumorschijf bedekt en voeg 0,7 μl/ml PicoGreen toe. Pipetteer de kleuroplossing terug naar de hydrogelschijf en incubeer nog 10 minuten bij 37 °C in het donker.
  4. Verwijder na de incubatie voorzichtig het overtollige medium en laat voldoende kleuroplossing over om het hydrogelschijfje vochtig te houden.
  5. Analyseer de plak onmiddellijk met behulp van een confocale microscoop. Om fototoxiciteit en fotobleken te voorkomen, minimaliseert u de toegepaste fotondosis door de laserintensiteit en excitatietijd te verminderen. De excitatie-/emissiespectra van de hierboven beschreven vlekken zijn te vinden in Tabel 1.
  6. Om een overzicht te krijgen van de cellulaire verdeling van de cel in de hydrogel, legt u z-secties vast. Als er tijdens de beeldvorming z-secties zijn genomen, genereer dan 3D-reconstructies van de hydrogel-tumorplakjes met behulp van de juiste software. Deze reconstructies zullen een grondige analyse mogelijk maken van de ruimtelijke verdeling en cellulaire status van cellen in de hydrogel-tumorschijfjes.
  7. Volg de instructies en het script in Aanvullend Bestand 1 en Aanvullend Bestand 2 om celsegmentatie en reconstructie uit te voeren.

Resultaten

De hydrogel-tumorplakjes met MCL-cellen werden gegenereerd met het hierboven beschreven protocol. De stappen van de workflow voor het 3D-printen en kweken van de hydrogel tumorschijfjes worden weergegeven in Figuur 1A. De gebruikte 3D-printer werd aangepast voor FRESH-printen door de toevoeging van een spuitpompverlenger zoals beschreven in Hinton et al.20 (Figuur 1B). Er werden maximaal vijf plakjes tegelijk geprint (Afbeelding 1C) en gekweekt op één filterdrager (Afbeelding 1D). Onder de filterdrager werd medium toegevoegd om de hydrogel-tumorschijfjes van voedingsstoffen te voorzien. Bovenop elk schijfje hydrogeltumor werd een druppel medium toegevoegd om te voorkomen dat ze uitdrogen. Een overzicht van vijf hydrogeltumorschijfjes gekweekt op één filterdrager wordt getoond in figuur 1E, samen met close-upbeelden van een hydrogelschijf. Gedurende een kweekperiode van 3 dagen waren de hydrogel tumorschijfjes stabiel en behielden ze hun structuur (Figuur 2A). Direct na het printen waren er luchtbellen aanwezig in de hydrogel tumorschijfjes, maar deze verdwenen tijdens de kweek (Figuur 2A).

De levensvatbaarheid van de MCL-cellijn Jeko-1 gekweekt in hydrogeltumorschijfjes (3D) in vergelijking met Jeko-1-cellen gekweekt in suspensiecultuur (2D) werd beoordeeld door middel van trypanblauwe uitsluitingstest (Figuur 2B). Na 3 dagen kweek was 80% van de cellen levensvatbaar, vergeleken met een initiële levensvatbaarheid van 88% van de Jeko-1-cellen vóór het printen. Jeko-1-cellen gekweekt in 2D behielden de initiële levensvatbaarheid van 88%. Er was geen significant verschil tussen Jeko-1-cellen gekweekt in 2D en 3D. Om te beoordelen of Jeko-1-cellen zich vermenigvuldigen in de hydrolingschijfjes, werd het gemiddelde aantal Jeko-1-cellen per hydrogelschijf bepaald (Figuur 2C). Terwijl 5x105 Jeko-1-cellen direct na het printen in elke plak zaten (d0), verdubbelde dit aantal bijna tot 9,3x105 cellen na 3 dagen kweken.

De verdeling en status van Jeko-1-cellen gekweekt in hydrogelschijfjes werden beoordeeld door middel van vierkleuren live fluorescentiebeeldvorming (Figuur 2D) direct na het printen of na 3 dagen kweken. Na het printen toonden 3D-reconstructies van de Jeko-1 hydrogelplakken een homogene verdeling van cellen. De meerderheid van de cellen was positief voor TMRM, een marker voor mitochondriaal membraanpotentiaal22. Een minderheid van de cellen was positief voor Caspase-3-activiteit, een marker voor apoptose-inductie23, evenals voor de dode celmarker PicoGreen21. Na 3 dagen kweek werd een toename van het aantal cellen waargenomen naast de vorming van celclusters. De meeste cellen bleven TMRM-positief, terwijl slechts een paar cellen positief kleurden voor Caspase-3-activiteit of PicoGreen (Figuur 2C).

Om te analyseren of MCL-cellen in hydrogelschijfjes reageren op chemotherapeutica, werden Jeko-1-cellen gekweekt in suspensiecultuur (2D) of in hydrogelschijfjes (3D) behandeld met het chemotherapeutische geneesmiddel Doxorubicine, dat deel uitmaakt van de standaardbehandeling voor MCL-patiënten24. De algehele structuur van de hydrogelschijfjes bleef behouden tijdens de behandeling met doxorubicine (Figuur 3A). De levensvatbaarheid van Jeko-1-cellen gekweekt in hydrogelschijfjes nam dosisafhankelijk af als reactie op behandeling met doxorubicine. De IC50 van doxorubicine in Jeko-1-cellen was verhoogd wanneer cellen werden gekweekt in hydrogelschijfjes (IC50=5,8 μM) in vergelijking met Jeko-1-cellen gekweekt in 2D-suspensiecultuur (IC50=2,0 μM; Figuur 3B). Vierkleurige live fluorescentiebeeldvorming toonde een verminderd TMRM- en een verhoogd PicoGreen-signaal in Jeko-1-cellen gekweekt in hydrogelschijfjes als reactie op behandeling met doxorubicine, wat een door de behandeling geïnduceerde vermindering van de levensvatbaarheid bevestigde. Beelden verkregen uit vierkleuren live fluorescentiebeeldvorming werden 3D-gereconstrueerd, gesegmenteerd op basis van het DRAQ5-kernsignaal en geanalyseerd met behulp van het Python-script beschreven in aanvullend bestand 1. Een voorbeeldig segmentatiemasker wordt getoond in aanvullende figuur 1. Het celnummer dat uit het DRAQ5-signaal werd geïdentificeerd, werd gebruikt om het totale aantal cellen te bepalen. Het celaantal dat positief is voor TMRM-, PicoGreen- en Caspase-3-activiteit werd gebruikt om respectievelijk het percentage levensvatbare, dode of apoptotische cellen te identificeren. Kwantificeringen van de vierkleurige live fluorescentiekleuring van Jeko-1-cellen gekweekt in hydrogelschijfjes gedurende 3 dagen met of zonder 9 μM doxorubicine toonden een vergelijkbare levensvatbaarheid als de trypanblauwe uitsluitingstest (tabel 2).

Naast de gevestigde MCL-cellijnen werden primaire MCL-cellen van drie verschillende MCL-patiënten gekweekt in 2D-suspensiecultuur of in 3D-hydrogelplakjes (Figuur 4, aanvullende figuur 2). Zoals geverifieerd door een patholoog, hadden alle drie de MCL's (patiënt 1-3) een klassieke/veel voorkomende morfologie met Ki67-indices van 20%-50%. De primaire MCL-cellen omvatten alle celtypen geïsoleerd uit de lymfeklieren van MCL-patiënten en bevatten dus niet alleen MCL-cellen, maar ook andere soorten immuuncellen of stromale cellen. De levensvatbaarheid van de primaire MCL-hydrogelschijfjes werd beoordeeld door middel van de trypanblauwe uitsluitingstest. Na 4 dagen kweek behielden primaire MCL-cellen in hydrogelschijfjes een levensvatbaarheid van 43,6% (45,7% op dag 3) vergeleken met een basislevensvatbaarheid van 71,0% vóór het printen (Figuur 4A). Dit vertegenwoordigt een verhoogde levensvatbaarheid in vergelijking met cellen die in suspensie (2D) waren gekweekt, die een overleving hadden van 19,6% na vier dagen kweken (28,4% op dag 3). Deze levensvatbaarheid werd gevisualiseerd door vierkleuren-live fluorescentiebeeldvorming, waarbij de meeste cellen TMRM-positief en levensvatbaar waren, terwijl een subpopulatie positief was voor Caspase-3-activiteit en PicoGreen, wat wijst op respectievelijk apoptose en celdood (Figuur 4B). De kwantificeringsgegevens van figuur 4B zijn weergegeven in tabel 2. Primaire cellen van twee andere MCL-patiënten vertoonden een verhoogde overleving van cellen wanneer ze werden gekweekt in de hydrogelschijfjes (3D) in vergelijking met de respectievelijke 2D-suspensiecultuur (aanvullende figuur 1).

figure-results-1
Figuur 1: Workflow van het 3D-printen van hydrogel tumorplakjes. (A) Workflow van 3D-printen en kweken van cellen in hydrogel tumorplakjes. (B) Printeropstelling die wordt gebruikt voor het 3D-bioprinten van hydrogelschijfjes in een gelatinesteunbad. (C) Het printen van een blauwdruk in de 3D-printer software. Er werden maximaal vijf hydrogelplakken tegelijk geprint. (D) Schematische weergave van de hydrogel plakcultuur. Hydrogelplakken werden gekweekt op een filterdrager in een plaat met 6 putjes. Bovenop elke hydrogelschijf werd een druppel medium toegevoegd om het vocht op peil te houden. Er kunnen maximaal vijf hydrogelschijven worden gekweekt op één filterdrager. (E) 3D-geprinte hydrogelplakken gekweekt op een filterdrager, zoals weergegeven door een overzichtsafbeelding of door close-upafbeeldingen. De schaalbalken vertegenwoordigen 5 mm, 1 mm of 200 μm zoals aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Kweek van een mantelcellymfoom (MCL) cellijn in 3D-geprinte hydrogelplakjes. (A) Close-up van een representatieve hydrogelschijf met de MCL-cellijn Jeko-1 na het printen (d0) of na 3 dagen kweken (d3). De schaalbalk vertegenwoordigt 1 mm. (B) Levensvatbaarheid van Jeko-1-cellen gekweekt in suspensie (2D) of in hydrogelschijfjes (3D) gedurende 2 dagen, zoals beoordeeld door trypanblauwe uitsluitingstest. Het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke bioprintexperimenten wordt weergegeven. (C) Jeko-1-celnummer in elke hydrogelschijf direct na het printen (d0) of na maximaal 3 dagen kweken (d1-d3). Het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke bioprintexperimenten wordt weergegeven. Er werd geen statistisch significant verschil waargenomen (n.s., p > 0,05, Mann-Whitney-test). (D) Driedimensionale reconstructie van Jeko-1 hydrogelplakken op de dag van drukken (d0) of na 3 dagen kweken (d3). Het model werd gegenereerd uit z-stacks van een vierkleurige live 3D-fluorescentiebeeldvorming. Levende cellen worden weergegeven in rood (TMRM), apoptotische cellen in geel (Caspase-3 enzymatische activiteit), dode cellen in groen (PicoGreen) en kernen in blauw (DRAQ5). De schaalbalk staat voor 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Medicamenteuze behandeling van een mantelcellymfoom (MCL) cellijn in hydrogelplakjes. (A) Close-up van een representatief hydrogelplakje met de MCL-cellijn Jeko-1 behandeld met 3 μM doxorubicine gedurende 3 dagen (d3). De schaalbalk staat voor 1 mm. (B) Jeko-1-cellen gekweekt in suspensie (2D) of in hydrogelschijfjes (3D) werden gedurende 2 dagen behandeld met toenemende concentraties van het chemotherapeutische middel doxorubicine. De levensvatbaarheid van cellen werd beoordeeld met behulp van de trypanblauw-uitsluitingstest. Het gemiddelde ± SD van vier onafhankelijke bioprintexperimenten wordt weergegeven. (C) Driedimensionale reconstructie van Jeko-1 hydrogelschijfjes behandeld met 9 μM Doxorubicine (Doxo) gedurende 3 dagen (d3). Het model werd gegenereerd uit z-stacks van een vierkleurige live 3D-fluorescentiebeeldvorming. Levende cellen worden weergegeven in rood (TMRM), apoptotische cellen in geel (Caspase-3 enzymatische activiteit), dode cellen in groen (PicoGreen) en kernen in blauw (DRAQ5). De schaalbalk staat voor 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kweek van primaire MCL-cellen in 3D-geprinte hydrogelplakjes. (A) Levensvatbaarheid van primaire MCL-cellen gekweekt in suspensie (2D) of in hydrogelschijfjes (3D) gedurende maximaal 4 dagen, zoals beoordeeld door middel van trypanblauwe uitsluitingstest. De gemiddelde levensvatbaarheid van één experiment wordt getoond. (B) Driedimensionale reconstructie van primaire MCL-cellen gekweekt in hydrogelschijfjes (3D) gedurende 3 dagen. Z-stacks werden gegenereerd uit hydrogelschijfjes gekleurd met een vierkleurige levende kleuring en geanalyseerd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop (CLSM). Levende cellen worden weergegeven in rood (TMRM), apoptotische cellen in geel (Caspase-3 enzymatische activiteit), dode cellen in groen (PicoGreen) en kernen in blauw (DRAQ5). De schaalbalk staat voor 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

VlekTMRMDRAQ5NucView405 Caspase-3 substraatPicoGroen
Excitatie/emissie548 nm/574 nm647 nm/681 nm429 nm/ 469 nm488 nm/ 520 nm

Tabel 1: Excitatie/emissiemaxima van de vlekken die worden gebruikt voor vierkleuren live 3D-fluorescentiebeeldvorming.

Monster% van de cellen
TMRM (levensvatbare cellen)PicoGreen (Dode cellen)Caspase-3 (apoptotische cellen)
Jeko-1 Ctrl8323.618.3
Jeko-1 Doxo 9 μM27.681.386.6
Primaire MCL-patiënt 175.231.133.1

Tabel 2: Kwantificering van 3D-reconstructies van vierkleurige live kleuring van gekweekte hydrogel tumorschijfjes. Hydrogel-tumorschijfjes werden gedurende 3 dagen gekweekt en bevatten Jeko-1-cellen gekweekt met of zonder behandeling met 9 μM doxorubicine of primaire MCL-cellen (patiënt 1).

Aanvullende figuur 1: Celidentificatie uit 3D-reconstructies van vierkleurige live kleuring. 3D-reconstructies van confocaal beeld gelabeld met DRAQ5 verkregen uit (A) vierkleurende live kleuring en (B) een gesegmenteerd beeld op dit kanaal gegenereerd met behulp van de Python-beeldvormingsanalysepijplijn. De schaalbalk staat voor 200 μm. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullend figuur 2: Kweek van primaire MCL-cellen van patiënten 2 en 3 in plakjes hydrogeltumor .Levensvatbaarheid van primaire MCL-cellen van (A) patiënt 2 of (B) patiënt 3 gekweekt in suspensie (2D) of in hydrogelschijfjes (3D) gedurende maximaal 4 dagen, zoals beoordeeld door middel van trypanblauwe uitsluitingstest. De gemiddelde levensvatbaarheid van één experiment wordt getoond. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Instructies voor de analyse van 3D-reconstructies verkregen uit vierkleurende live-kleuring. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Python-script voor analyse van 3D-reconstructies verkregen uit vierkleurende kleuring. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: Stl. bestand met de blauwdruk voor de hydrogel tumorschijfjes. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De hydrogel-tumorplakjes die in dit protocol worden beschreven, bieden een MCL-model dat de lymfeklierstructuur nabootst, waardoor de overleving van MCL-cellen en de geneesmiddelrespons kunnen worden bestudeerd in een 3D-tumormicro-omgeving die wordt gegenereerd door bioprinting.

De meest gebruikte bioprintmethoden zijn gebaseerd op extrusie, waarbij bioink wordt uitgeworpen via een doseersysteem. Bij inkjetprinten bijvoorbeeld worden bio-inkten na afzetting snel verknoopt om 3D-structuren te vormen25. Deze aanpak heeft echter beperkingen, met name wat betreft de viscositeit van de gebruikte materialen en het vermogen om lagen te stapelen. Daarentegen past 3D-bioprinting op basis van extrusie op basis van ingebedde spuiten, zoals het FRESH-bioprinting dat in dit protocol wordt gebruikt, een gel-in-gel-benadering toe. Dit maakt het mogelijk om bio-inkten met een lage viscositeit, zoals collageen, in stabiele constructies te printen, waardoor het mogelijk wordt om de complexe micro-omgeving van de tumor na te bootsen20,26. Hoewel 3D-printers die speciaal zijn ontwikkeld voor bioprinting duur kunnen zijn, biedt de hier gepresenteerde methode een toegankelijker instappunt. Het kan met relatief eenvoudige aanpassingen worden aangepast aan standaard extrusieprinters. Deze aanpassingen kunnen 3D-geprint worden met betaalbare filamenten, en de ontwerpen zijn beschikbaar als open-source bronnen, bijvoorbeeld door Hinton et al.20. Het is echter belangrijk op te merken dat de voorbereiding van het hydrogel-steunbad voor FRESH bioprinting zeer temperatuurgevoelig is en zorgvuldige aandacht vereist bij de bereiding van de slurry.

Vaak worden 3D-geprinte tumormodellen gekweekt in zwevende systemen, zonder de in vivo zuurstofgradiënt25, of in microfluïdische chipculturen27, die een hoge mate van complexiteit vastleggen, maar een lage doorvoer hebben en veel onderhoud vergen. Deze hindernissen kunnen worden overwonnen met de hier beschreven hydrogel-tumorplakjes. De opzet van het kweken van maximaal vijf hydrogel-tumorschijfjes op een lucht-vloeistofinterface is afgeleid van de cultuur van nauwkeurig gesneden tumorschijfjes van solide tumoren28. Het membraan van de filterdrager die in dit protocol wordt gebruikt, bestaat uit een polytetrafluorethyleen (PFTE) membraan met een poriegrootte van 0,4 μm, dat de uitwisseling van voedingsstoffen mogelijk maakt, maar cellulaire aanhechting of celmigratie voorkomt29. De cultuur op het PTFE-membraan biedt fysieke ondersteuning voor de plakjes om hun stabiliteit te behouden en te voorkomen dat ze scheuren of uiteenvallen. Bovendien bieden ze een lucht-vloeistofinterface, die zuurstof voornamelijk uit de lucht erboven levert en voedingsstoffen uit het medium onder het filter30. Het systeem houdt dus rekening met spatiotemporele variaties in de toevoer van voedingsstoffen, celproliferatie en oxygenatie, zoals ze in vivo kunnen optreden 25. Gekweekt in de hydrogel-tumorplakjes op een filterdrager, behielden primaire MCL-cellen gedurende 4 dagen een levensvatbaarheid van meer dan 40%, wat superieur was aan de levensvatbaarheid die werd waargenomen in 2D-suspensiecultuur (Figuur 3A, Aanvullende Figuur 2). Verder onderzoek moet uitwijzen of een langdurige levensvatbaarheid kan worden bereikt door de toevoeging van cytokines of co-cultivatie met fibroblasten die CD40L tot expressie brengen, zoals beschreven in sferoïden en organoïden van primaire B-cel lymfoomtumor 6,19,30 of co-culturen van primaire MCL-cellen met fibroblast-L-cellen die CD40L tot expressie brengen 14. Het opnemen van dergelijke benaderingen in de hydrogel-tumorplakjes moet worden overwogen om de cultuur van primaire MCL-cellen te verbeteren, evenals de gelijkenis met de natuurlijke micro-omgeving.

Lymfeklieren bevatten een goed ontwikkeld netwerk van extracellulaire matrixvezels. Vanwege hun patroon staan ze bekend als reticulaire vezels. Deze vezels zijn voornamelijk samengesteld uit collageen en basaalmembraanspecifieke componenten 31,32,33. Om een matrix te genereren die lijkt op de in vivo situatie in lymfeklieren, is de bioink die wordt gebruikt om de hydrogel-tumorplakjes te genereren, samengesteld uit collageen type I en Matrigel, dat bestaat uit de vier belangrijkste basaalmembraan-ECM-eiwitten laminine, collageen IV, entactine en perlecan34. Verder wordt alginaat aan de bioink toegevoegd om de plakjes hydrogeltumor te stabiliseren, waardoor een langdurige kweek en het transport van het ene vat naar het andere met behulp van een spatel mogelijk is. Het testen van verschillende hydrogels die collageen en alginaat bevatten, toonde de hoogste cellulaire levensvatbaarheid in combinatie met een stabiele en duurzame hydrogelschijf bij gebruik van een bioink met 0,5% alginaat en 20% collageen (gegevens niet getoond). Naast de componenten lijkt de hydrogel tumorschijfdiameter van 0,8 cm verder op de gemiddelde lymfeklierdiameter van 1 cm35. Live 3D-beeldvorming van de hydrogel-tumorplakjes toonde verder een gelijkmatige verdeling van cellen (Figuur 2C).

Hier werd het vermogen om de hydrogelschijfjes met medicijnen te behandelen aangetoond door behandeling met doxorubicine, dat deel uitmaakt van de R-CHOP-therapie (rituximab, cyclofosfamide, doxorubicine, vincristine, prednison), een standaardbehandeling voor oudere MCL-patiëntensubgroepen24. In vergelijking met 2D-culturen kunnen de invloeden van de micro-omgeving van de tumor op de behandelingseffecten worden bestudeerd in de hydrogel tumorplakjes. Zoals te zien is in figuur 3, waren Jeko-1-cellen gekweekt in hydrogelschijfjes resistenter tegen behandeling met doxorubicine dan 2D-gekweekte cellen. Dit is in lijn met observaties dat de extracellulaire matrix de respons op geneesmiddelen kan beïnvloeden en de resistentie tegen geneesmiddelen vaak kan verbeteren door de tumorstijfheid te moduleren36, cel-celcommunicatie37 en medicijnafgifte38. Bovendien kunnen flowcytometrische analyse, evenals immunohistochemische of multiplex immunofluorescentiekleuring, diepere inzichten geven in de behandelingsrespons van afzonderlijke cellen in de hydrogel-tumorplakjes.

Concluderend beschrijft dit protocol het genereren en kweken van hydrogel-tumorplakjes, die een 3D-lymfekliermodel vertegenwoordigen dat de oorspronkelijke driedimensionale lymfeklierstructuur nabootst. Het heeft het potentieel om de toepassing uit te breiden van MCL-cellen naar andere primaire lymfoomindicaties.

Openbaarmakingen

Deze studie werd ondersteund door de Robert-Bosch Stiftung en het Ministerie van Wetenschap, Onderzoek en Kunsten Baden-Württemberg (3R-Netwerk BW).

Dankbetuigingen

We danken Kerstin Willecke voor haar uitstekende technische assistentie en Yang Zhang voor zijn waardevolle hulp bij de 3D-beeldanalyse.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
µ-slide 8 Well Glass Bottomibidi GmbH80827Glass bottom slides used for live imaging of hydrogel slices
10x PBSCarl Roth GmbH + Co.KG9150.1Bioink component
10X RPMI-1640 MediumSigma-AldrichR1145Bioink component
2.5 ml Gastight Syringe Model 1002 TLLHamilton81420Syringe for bioprinting
3D Extrusion printer, PrintrBot SimplePrintrbotSelf-modified to allow for printing of bioinks
6-well plateTh. Geyer GmbH & Co.KG7696790Culture of the hydrogel slices
Bottle top vacuum filtration systems, PES membrane, 500 ml, 0.22 µm pore size, 70 mm diameter membraneCorning Inc.513-3355Sterile filtration of buffers
Calcium chloride dehydrateCarl Roth GmbH + Co.KGT885.2Component of wash buffer and gelatin slurry
Collagen I from ratCorning Inc.CLS354249Bioink component
Cura Version 15.04.5 software for 3D printingUltimakerSoftware used for 3D printing
DRAQ5Biostatus Ltd.DR50050Stain for live imaging of hydrogel slices
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateSigma-AldrichE5134Component of alginate dissolving buffer
EVE Automatic Cell CounterNano EnTek Inc.10027-452Cell Counter
Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid, 35 mm diameterFalcon351008Filled with gelatin slurry to form the support bath for bioprinting
Falcon Tubes, 50 mLSarstedt AG & Co.KG62.547.254
Fetal calf serumSigma-AldrichS0615Cell culture medium supplement
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890Main component of the gelatin slurry
HEPES, Free Acid, Molecular Biology GradeMerck KGaACAS 7365-45-9Component of wash buffer and gelatin slurry
Jeko-1 MCL cell lineATCCCRL-3006MCL cell line
KIMTECH Science Precision wipesKimberly Clark Corporation7551Used to draw excess water from the gelatin slurry and to remove droplets from the 3D-printer nozzle
LAS X software Version 3.5.7.23225LeicaSoftware used for 3D reconstructions
Leica TCS SP8 Confocal laser scanning microscopeLeicaTCS SP8Confocal microscope for live imaging
Mason Jar Regular Pint 16 ozBall CorporationG001Jar in which the gelatin slurry is prepared
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane MatrixCorning Inc.356231Bioink component
Millicell cell culture insert, 0.4 µm pore sizeMerck KGaAPICMORG 50Filter support for hydrogel slices
NucView 405 Caspase-3 Substrate, 1 mM in 1x PBSBiotium10405Stain for live imaging of hydrogel slices
Oster Professional Series BlenderOsterBPST02-B00Blender to generate gelatin slurry
Penicillin/StreptamycinGibco15140163Supplement for MCL cell culture medium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay-Kits und dsDNA-ReagenzienInvitrogenP7589Stain for live imaging of hydrogel slices
Rotina 35 RHettich24573Centrifugation of cells
ROTINA 38/38R centrifugeHettichZ720109Centrifugtion of gelatin slurry
RPMI-1640+GlutaMAXGibco61870036Base of culture medium for MCL cells
Sodium alginateFMC CooperationGQ9109901Bioink component
Sodium chlorideMerck KGaA1.06404Component of alginate dissolving buffer
Sodium citrateCarl Roth GmbH + Co.KG3580.1Component of alginate dissolving buffer
Sterican blunt application cannulas 21G 0.8x22 mmB.Braun9180109Nozzle for 3D-printing
Tetramethylrhodamin-methylester-perchlorat (TMRM)Sigma-AldrichT5428Stain for live imaging of hydrogel slices
Trypan blue, 0.4%Sigma-AldrichT8154Stain for viability analysis
Waterproof thermometerVWR620-2099Thermometer to monitor the temperature of the gelatin slurry
```

Referenties

  1. Jain, P., Wang, M. L. Mantle cell lymphoma in 2022-a comprehensive update on molecular pathogenesis, risk stratification, clinical approach, and current and novel treatments. Am J Hematol. 97 (5), 638-656 (2022).
  2. Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: State of the art. Tissue Eng Part B Rev. 14 (1), 61-86 (2008).
  3. Wen, T., Wang, J., Shi, Y., Qian, H., Liu, P. Inhibitors targeting Bruton's tyrosine kinase in cancers: Drug development advances. Leukemia. 35 (2), 312-332 (2021).
  4. Lee, H. J., et al. Phase 1/2 study of zilovertamab and ibrutinib in mantle cell lymphoma (mcl) or chronic lymphocytic leukemia (cll). J Clin Oncol. 40 (16_suppl), 7520(2022).
  5. Roué, G., Sola, B. Management of drug resistance in mantle cell lymphoma. Cancers. 12 (6), 1565(2020).
  6. Araujo-Ayala, F., et al. A novel patient-derived 3d model recapitulates mantle cell lymphoma lymph node signaling, immune profile, and in vivo ibrutinib responses. Leukemia. 37 (6), 1311-1323 (2023).
  7. Bryant, J., et al. Development of intermediate-grade (mantle cell) and low-grade (small lymphocytic and marginal zone) human non-Hodgkin's lymphomas xenotransplanted in severe combined immunodeficiency mouse models. Lab Invest. 80 (4), 557-573 (2000).
  8. Andersen, T., Auk-Emblem, P., Dornish, M. 3d cell culture in alginate hydrogels. Microarrays. 4 (2), 133-161 (2015).
  9. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  10. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12 (1), 155(2022).
  11. Hickman, J. A., et al. Three-dimensional models of cancer for pharmacology and cancer cell biology: Capturing tumor complexity in vitro/ex vivo. Biotechnol J. 9 (9), 1115-1128 (2014).
  12. Rossi, M., Alviano, F., Righi, S., Sabattini, E., Agostinelli, C. Three-dimensional models: A novel approach for lymphoma research. J Cancer Res Clin Oncol. 148 (4), 753-765 (2022).
  13. Saba, N. S., et al. Pathogenic role of B-cell receptor signaling and canonical nf-κb activation in mantle cell lymphoma. Blood. 128 (1), 82-92 (2016).
  14. Chiron, D., et al. Rational targeted therapies to overcome microenvironment-dependent expansion of mantle cell lymphoma. Blood. 128 (24), 2808-2818 (2016).
  15. Nylund, P., Nikkarinen, A., Ek, S., Glimelius, I. Empowering macrophages: The cancer fighters within the tumour microenvironment in mantle cell lymphoma. Front Immunol. 15, 1373269(2024).
  16. Nygren, L., et al. T-cell levels are prognostic in mantle cell lymphoma. Clin Cancer Res. 20 (23), 6096-6104 (2014).
  17. Medina, D. J., et al. Mesenchymal stromal cells protect mantle cell lymphoma cells from spontaneous and drug-induced apoptosis through secretion of b-cell activating factor and activation of the canonical and non-canonical nuclear factor κb pathways. Haematologica. 97 (8), 1255-1263 (2012).
  18. Jindal, U., et al. Targeting cers6-as1/fgfr1 axis as synthetic vulnerability to constrain stromal cells supported proliferation in mantle cell lymphoma. Leukemia. 38 (10), 2196-2209 (2024).
  19. Nie, L., et al. Establishment of a patient-derived organoid culture platform for mantle cell lymphoma drug sensitivity and car t cell anti-tumor activity assay. Blood. 140 (Supplement 1), 9219-9220 (2022).
  20. Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Sci Adv. 1 (9), e1500758(2015).
  21. Van Der Kuip, H., et al. Short-term culture of breast cancer tissues to study the activity of the anticancer drug Taxol in an intact tumor environment. BMC Cancer. 6 (1), 86(2006).
  22. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76 (1), 469-477 (1999).
  23. Porter, A. G., Jänicke, R. U. Emerging roles of caspase-3 in apoptosis. Cell Death Differentiat. 6 (2), 99-104 (1999).
  24. Huseynov, V. Treatment of mantle cell lymphoma in transplant non-eligible patients. Hematol Transfus Cell Ther. 44, S2-S3 (2022).
  25. Augustine, R., et al. 3d bioprinted cancer models: Revolutionizing personalized cancer therapy. Transl Oncol. 14 (4), 101015(2021).
  26. Budharaju, H., Sundaramurthi, D., Sethuraman, S. Embedded 3d bioprinting – an emerging strategy to fabricate biomimetic & large vascularized tissue constructs. Bioact Mater. 32, 356-384 (2024).
  27. Seaman, K., Sun, Y., You, L. Recent advances in cancer-on-a-chip tissue models to dissect the tumour microenvironment. Med-X. 1 (1), 11(2023).
  28. Davies, E. J., et al. Capturing complex tumour biology in vitro: Histological and molecular characterisation of precision cut slices. Sci Rep. 5 (1), 17187(2015).
  29. Millipore PICM03050: Millicell Standing Cell Culture Inserts Data Sheet. , Merck KGaA. Darmstadt, Germany. (2025).
  30. Lamaison, C., et al. A novel 3d culture model recapitulates primary fl b-cell features and promotes their survival. Blood Adv. 5 (23), 5372-5386 (2021).
  31. Kramer, R. H., Rosen, S. D., McDonald, K. A. Basement-membrane components associated with the extracellular matrix of the lymph node. Cell Tissue Res. 252 (2), 367-375 (1988).
  32. Kaldjian, E. P., Gretz, J. E., Anderson, A. O., Shi, Y., Shaw, S. Spatial and molecular organization of lymph node T cell cortex: A labyrinthine cavity bounded by an epithelium-like monolayer of fibroblastic reticular cells anchored to basement membrane-like extracellular matrix. Int Immunol. 13 (10), 1243-1253 (2001).
  33. German, S. V., et al. Plug-and-play lymph node-on-chip: Secondary tumor modeling by the combination of cell spheroid, collagen sponge, and T-cells. Int J Mol Sci. 24 (4), 3183(2023).
  34. Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: From discovery and ecm mimicry to assays and models for cancer research. Adv Drug Deliver Rev. 79-80, 3-18 (2014).
  35. Ogassavara, B., Tucunduva Neto, R. R., De Souza, R. R., Tucunduva, M. J. Ultrasound evaluation of the morphometric patterns of lymph nodes of the head and neck in young and middle-aged individuals. Radiol Brasileira. 49 (4), 225-228 (2016).
  36. Huang, J., et al. Extracellular matrix and its therapeutic potential for cancer treatment. Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  37. Subrahmanyam, N., Ghandehari, H. Harnessing extracellular matrix biology for tumor drug delivery. J Personalized Med. 11 (2), 88(2021).
  38. Ahmad, V. Prospective of extracellular matrix and drug correlations in disease management. Asian J Pharma Sci. 16 (2), 147-160 (2021).

Herprints en machtigingen

Tags

3D bioprintentumormicro omgevingprimaire MCL cellencollageen bio inktgelatine ondersteuningsbadanalyse van medicumresponsenlive fluorescentiebeeldvorminglucht vloeistofinterface cultuur
Bioprinting van hydrogeltumorplakjes als 3D-model voor mantelcellymfoom
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.