Method Article

Live beeldvorming en karakterisering van microglia-dynamica en interacties met synapsen in een zieke muisnetvlies

DOI:

10.3791/68420

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University of California, San Francisco, 2Jules Stein Eye Institute, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel demonstreert een methode om microglia-motiliteit en contact met postsynaptische puncta in het netvlies te visualiseren en te kwantificeren met behulp van spinning disk confocale microscopie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia zijn de aanwezige macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CZS) die reageren op weefselinfectie en letsel. Naast hun rol in ontsteking spelen microglia een ontwikkelingsrol bij het verfijnen van circuits door synaptische snoei. De mechanismen van synaptische snoei bij neuro-inflammatie en neurodegeneratie blijven echter onbekend. In dit protocol gebruiken we een muisnetvlies-explantmodel om microglia-dynamica ex vivo te bestuderen. Om de motiliteit van microglia en hun interacties met postsynaptische eiwitten te onderzoeken, labelen we synapsen met AAV-PSD95-RFP en nemen we timelapse-video's op van beweeglijke microglia die gecolokaliseerd zijn met postsynaptische eiwitten met behulp van draaiende schijfconfocale microscopie. Vervolgens maken we oppervlakte- en plekreconstructies van microglia en PSD95 met behulp van beeldanalysesoftware. Gegevens zoals de lengte van microglia-verplaatsing, processnelheid en contact met postsynaptische puncta kunnen vervolgens van deze oppervlakken worden geëxtraheerd om het gedrag van microglia zowel in homeostatische toestanden als na neuronale schade te begrijpen. Dit protocol kan nuttig zijn bij het onderzoeken van de rol van microglia bij synaptische snoei bij retinale neurodegeneratieve ziekten.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Circuitfunctie en homeostase zijn afhankelijk van sterk gereguleerde synapsenactivering en andere unieke interacties tussen verschillende celtypen1. Microglia dienen als de residente macrofagen van het centrale zenuwstelsel (CZS) en zijn een niet-neuronale populatie in het netvlies die een unieke rol spelen bij synaptische snoei. Tijdens de ontwikkeling van het CZS snoeien microglia niet-functionele of zwakke synapsen om neurale circuitste verfijnen 2. Microglia in de zich ontwikkelende hersenen onderzoeken hun omgeving en zijn voorbereid op een neuroprotectieve rol tijdens kritieke periodes3. Bij de ontwikkeling van het visuele systeem zijn microglia belangrijke regulatoren in de ontwikkeling van corticale neuronen en interneuronen, naast het vertonen van morfologische veranderingen tijdens kritieke periodes van synaptische remodellering4. Evenzo verwijderen microglia in het zich ontwikkelende netvlies apoptotische cellen om plaats te maken voor nieuwe synaptische verbindingen, bevestigd met upregulatie van homeostatische marker P2Ry12 tijdens deze clearing-evenementen5. Recente bevindingen tonen echter aan dat microglia mogelijk geen definitieve rol speelt bij het verfijnen van de neurale circuits in het zich ontwikkelende visuele systeem6, wat benadrukt dat er controverse is over de rol die microglia spelen in de ontwikkeling van visuele circuits.

In blessurecontexten veranderen microglia van morfologie naar een actieve toestand en kunnen ze een neurodegeneratieve rol spelen. Zo toonden microglia in Alzheimer-modellen een verhoogde opname van amyloïde-bètaplaques7 en synaptische markers zoals SPH en PSD958. Bij retinale neurodegeneratie hebben veel onderzoeksgroepen microglia gevonden met overgenomen synaptisch materiaal, maar geen duidelijk bewijs van actieve opname van intacte synapsen 9,10,11,12,13. Zo ontdekten He et al. dat microglia in aantal toenemen en het volume van het opgeslokte synaptische materiaal hebben in een model van retinitis pigmentosa9, maar het is niet duidelijk of er sprake was van fagocytose van intacte synapsen versus het opruimen van puin. Bovendien zijn traditionele microgliale classificaties – zoals "rustend versus geactiveerd" of "M1 versus M2" – te simplistisch en steeds onnauwkeuriger gezien moderne inzichten. Microglia bestaan in een gradiënt van toestanden, niet in discrete categorieën12. Daarom pleitten Paolicelli et al. voor een verschuiving van verouderde binaire classificaties naar een meer genuanceerde, rigoureus gedefinieerde nomenclatuur voor microgliale toestanden om microglia-morfologie en -activiteit beter te begrijpen en te definiëren12. Daarom zullen strategieën om de microgliafunctie ex vivo en in vivo te evalueren het vermogen van het veld vergroten om microglia-toestanden en -activiteit in zowel ontwikkelings- als ziektecontexten te onderscheiden.

Hoewel er strategieën bestaan om de functie van microglia zowel ex vivo als in vivo te bestuderen, heeft ex vivo live imaging verschillende voordelen. Ten eerste zal de helderheid van het hoornvlies of de ontwikkeling van staar de retinale beeldvorming niet belemmeren, waardoor een duidelijke visualisatie van kleine processen en synaptische puncta ontstaat. Bovendien vereist in vivo imaging meer technische vaardigheid om op te zetten, wat ex vivo-preparaten met een hogere doorvoersnelheid maakt, wat resulteert in meer dieren per experiment. Ondanks de theoretische voordelen die in vivo beeldvorming mogelijk biedt, is een hoge laserkracht (100-230 μW) vereist om de motiliteit van het microgliaproces vast te leggen voor longitudinale beeldvorming14,15. Ex vivo beeldvorming van microglia met een lager laservermogen en voldoende beeldvormingsmedia kan echter dezelfde beeldkwaliteit bieden als in vivo beeldvorming met de juiste voorbereiding, hoewel het weefsel niet langer in situ is.

We hebben aangetoond dat microglia toenemen in aantal, complexiteit en procesbeweging na een verhogingvan 10 van de transiente intraoculaire druk (IOP). In gefixeerd weefsel resulteert deze microgliose in verhoogde colokalisatie met synaptische eiwitten10. Eerder onderzoek heeft ook vroeg synapseverlies en dendrietendegeneratie van retinale ganglioncellen (RGC's) aangetoond in het muislaser-geïnduceerde oculaire hypertensiemodel (LIOH) en andere neurodegeneratieve modellen 10,16,17,18,19,20. Het is echter nog onbekend of ze een actieve rol spelen bij het snoeien van synapsen of een meer passieve rol bij het opruimen van cellulair afval, waaronder gedemonteerde synapsen. Aangezien synapsontmanteling een vroeg kenmerk is van neurodegeneratie, is het begrijpen van microglia-dynamiek en hun rol in synapsontmanteling cruciaal 8,10. Hier gebruiken we live imaging om microglia-dynamica en hun interactie met exciterende postsynaptische dichtheidseiwit-95 (PSD95) op de dendrieten van RGC's te begrijpen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dieren werden gehouden aan de University of California, San Francisco, onder lichtcycli van 12 uur licht en 12 uur donker en kregen water en standaard dieet ad libitum, tenzij anders vermeld. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van de University of California, San Francisco. Zie de Materiaaltabel voor materialen en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt. Een overzicht van de experimentele procedure, van intravitreale injectie tot beeldvorming en analyse, is weergegeven in Figuur 1.

1. AAV-PSD95-TagRFP virusproductie en efficiëntie

  1. Construeer AAV-PSD95-tagRFP door de PSD-95pTagRFP-sequentie te nemen (Addgene plasmide #52671; RRID:Addgene_52671) en het inbrengen daarvan stroomafwaarts van de CMV-promotor in AAV-CMV-GFP na het verwijderen van de GFP (Addgene plasmide #67634; RRID: Addgene_67634).
  2. Bereid het virus voor met drievoudig getransfecteerd HEK293T, gezuiverd met PEG/chloroform, en geconcentreerd tot een titer van 1012 ip/mL (zoals beschreven in Negrini et al.).21.
    OPMERKING: Deze virale productiemethode produceert doorgaans een lagere titer dan ultracentrifugatie, maar voor deze experimenten is het wenselijk om schaars geïnfecteerde cellen21 te hebben. De capside/serotype-versie die in deze experimenten werd gebruikt, was 7m8, (Addgene plasmide # 64839; RRID: Addgene_64839).
    1. Test de efficiëntie van de AAV voordat je doorgaat met het volledige beeldvormingsprotocol.
      OPMERKING: Lezers die dit protocol implementeren, moeten streven naar spaarzame etikettering van RGC's, aangezien het doel is om individuele RGC-dendrieten te identificeren en te isoleren.
  3. Controleer succesvolle transfectie en fix vervolgens het netvlies in 2% PFA in 1x ACSF. Voor synaptische eiwitten controleer het signaal onder een confocale microscoop op 63x om de duidelijke resolutie van de fluorescerende labeling te verifiëren.
    OPMERKING: De lichtere concentratie van fixatie helpt de etikettering van synaptische eiwitten te behouden. Als de gebruikte AAV niet voor synaptische componenten is, kunnen lezers ervoor kiezen om 4% PFA te gebruiken.

2. Muizenverzorging en AAV-PSD95-TagRFP intravitreale injecties

  1. Kruis mannelijke en vrouwelijke CD-1 albinomuizen (stam 022) met B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J (stam 005582) om CD-1 albinomuizen te produceren met EGFP-expressieve microglia. Wacht minimaal vier generaties backcrossing voordat je de mannelijke en vrouwelijke Cx3cr1 heterozygote muizen in experimenten kunt gebruiken. Onderhoud en vernieuw de stam na 10 generaties weer op de CD-1 achtergrond om genetische drift te voorkomen.
  2. Verdoof dieren (P30-P60) met isoflurananesthesie via een inductiekamer met 3-5% anestheticum in zuurstof en een debiet van 1 L/min zuurstof. Plaats het dier onder een stereomicroscoop, terwijl er wordt gezorgd dat isofluraan continu via een neuskegel wordt toegediend. Om te bevestigen dat het dier verdoofd is, knijp je minstens drie keer in de teen om het zeker te weten.
  3. Voeg een druppel 0,5% proparacaïne toe voordat je de AAV injecteert. Injecteer langzaam 2 μL AAV-PSD95-RFP intravitries in beide ogen bij de superotemporale limbus met een 26s G 10 μL spuit. Verwijder de naald langzaam om terugstroming van de AAV via de injectieplaats te voorkomen. Breng na de injectie een antibioticazalf aan op de ogen.
  4. OPMERKING: De naald mag niet meer dan halverwege de omtrek van de glasvochtkamer gaan. Hierdoor kunnen het netvlies en de lens beschadigd raken door de naaldpunt, wat leidt tot een vlekkerige of zelfs mislukte transfectie. Staarontwikkeling of bloeding wijst op een gebrekkige injectietechniek.
  5. Controleer na de injectie of de dieren alert zijn voordat je ze terugbrengt naar hun oorspronkelijke kooien en woonruimtes. Als een dier pijn na de injectie vertoont, dien dan buprenorfine toe via intraperitoneale injectie. Wacht 3 weken op AAV-expressie. Als een induceerbaar model wordt gebruikt om de intraoculaire druk te verhogen (of andere manipulaties uit te voeren), wacht dan 3 weken voordat de intraoculaire druk in één oog wordt geïnduceerd, waarbij het contralaterale oog of de ogen van een naïef dier als controlegroep wordt gebruikt.

3. Euthanasie en retinale flatmount

  1. Bereid een verse 1x oplossing van kunstmatig hersenvocht (ACSF, pH 7,4) voor in 1x PBS met de volgende componenten in mM: 119 NaCl, 2,5 KCl, 1,3 MgCl2,6H 2O, 2,5 CaCl 2,2H2O, 1 NaHPO4, 11 glucose en 20 HEPES).
  2. Oxygeneer de oplossing minstens 15 minuten voordat je het gebruikt voor een acute dissectie. Sluit de slanging aan op een zuurstoftank en plaats een dop met een gat in het midden om te voorkomen dat het gas ontsnapt.
  3. Euthanaseer de muis met ten minste 1 ml isoflurane anesthesie in een kleine inductiekamer, gevolgd door cervicale dislocatie. Markeer de neuszijde van het hoornvlies met een marker voordat je enucleeert, zodat de locatie van het netvlies gedurende het hele experiment gevolgd kan worden.
    1. Om microkralen-geïnjecteerde of gelaserde ogen te enucleeren, voer je een beperkte conjunctivale peritomie uit en plaats je de schaar achter het oog om het oog aan de basis van de oogzenuw te ontleden. Dit zorgt ervoor dat het gevoelige oog intact blijft.
  4. Met een dissectiemicroscoop steek je met een 23 G of 25 G naald een klein gaatje in het hoornvlies, waardoor zuurstofrijke ACSF het oog kan doorboren. Steek een schaar in dit gat om een fiduciaire snede aan het neusuiteinde te maken.
  5. Snijd de rest van het hoornvlies en de iris af bij de limbus.
  6. Verwijder de iris en lens. Als het netvlies aan de lens plakt, scheid het dan met een tang.
  7. Scheid het netvlies van de sclera door met een tang voorzichtig te snijden tussen het RPE en het neurale netvlies.
  8. Plaats het netvlies op de niet-gerasterde kant van een Mixed Cellulose Esters (MCE) membraanfilterpapier voor duidelijke visualisatie en beeldvorming.
  9. Maak kleine, ontspannende sneden in het netvlies bij de andere drie kwadranten, met de langste snede in het neusnetvlies om de locatie van het netvlies te volgen.
    OPMERKING: Het netvlies moet eruitzien als een klavertje met vier bladeren.
  10. Breng het netvlies van het filterpapier over op een laboratoriumdoekje. Gebruik één druppel ACSF om het netvlies te bevochtigen en droog het filterpapier vervolgens met het doekje. Herhaal dit voor minstens 8-10 druppels om het netvlies aan het filterpapier te laten hechten.
  11. Plaats het netvlies in een zuurstofgevende kamer terwijl je het contralaterale oog ontleedt.
  12. Als het klaar is om te fotograferen, droog je het filterpapier zoals vermeld in stap 3.10 en draai je het netvlies om op een Matek Petrischaal. Verzwaar het netvlies met metalen kralen of een ring. Voeg 3-5 druppels ACSF toe.
    OPMERKING: Kleine metalen kralen, zoals die van een metalen kralenbad of een ring, zijn van voldoende grootte en gewicht om drift te voorkomen zonder de netvliesintegriteit te verstoren.
  13. Maak een ring door een stalen draad en gespannen nylon snaren te nemen, te lijmen en een gewicht toe te voegen om een ring te krijgen met vaste, strakke parallelle snaren.
    1. Wikkel de draad om een cilinder van 1/2 inch diameter en trek strak met een tang. Snijd elke ring uit de cilinder en plat tussen een bankschroef.
    2. Schuur de ring op één zijde zodat hij een ruwe, platte kant heeft. Span nylon touwtjes over de opening van een fles met een diameter van 2-5 cm en houd ze vast met elastiekjes.
    3. Plaats de ring bovenop de nylon snaren en lijm deze voorzichtig aan de nylon snaren door kleine hoeveelheden lijm aan te brengen langs de binnenrand van de ring. Plaats daarna een licht gewicht bovenop de ring, bijvoorbeeld een munt of dun metalen draadje, om de ring op zijn plaats te houden.
    4. Na het drogen knip je de nylon snaren van de buitenrand van de ring met een precisieschaar. Het resultaat is vaste parallelle touwtjes die strak de diameter van de ring verlengen.
    5. Als de dichtheid van nylon snaars te hoog is in de ring, knip dan individuele snaren met microdissectieveer-schaar om aan de behoeften van het experiment te voldoen.
      OPMERKING: Het dissectie- en montageproces zou slechts ~5 minuten moeten duren. Hoe sneller het duurt voordat het weefsel ex vivo in evenwichtige fysiologische omstandigheden wordt geplaatst, hoe gezonder het weefsel is.

4. Confocale acquisitie van draaiende schijf

OPMERKING: Zet de bevochtigingskamer aan op 5%CO-2 en laat deze minstens 1 uur draaien voordat je beeldvorming neemt. Het systeem en het monster in thermisch evenwicht laten bereiken helpt om drift te verminderen.

  1. Begin met het scannen door het oculair op 10x om je op de microglia te concentreren. Bij het scannen van het weefsel op gebieden om te fotograferen, gebruik dan het microgliakanaal als referentie en focus je alleen op microglia met heldere synaptische puncta die gecolokaliseerd zijn (binnen 10-20 μm). Omdat AAV-labeling niet homogeen is in het hele weefsel, scannen we gebieden waar zowel microglia als puncta binnen hetzelfde vlak gelokaliseerd zijn. Zodra een gebied dat aan deze criteria voldoet is gevonden, schakel je over naar 60x om scherp te stellen en schakel je over naar cameramodus door op de cameraknop te klikken.
    1. Gebruik de beeldvormingssoftware en klik met de rechtermuisknop op het scherm om xy-navigatie te vinden. Er verschijnt een previewscherm dat het weefsel kan scannen door een 3 x 3, 5 x 5 frame te maken, of een aangepaste grootte om optimale gebieden te screenen. Gebruik het frame van 3 x 3 of 5 x 5 en scherm met één referentiekanaal om continu fotobleaching te voorkomen.
      OPMERKING: Voor dit protocol gebruikten we het microglia-kanaal.
  2. Maak direct beeld van het gemonteerde netvlies met een draaiende schijf confocale microscoop met een 60x objectief (NA 1.49).
  3. Om het voorbeeld te bekijken, klik met de rechtermuisknop op het scherm, selecteer Live en klik op de auto-adjust-knop zodat het systeem de weergave kan aanpassen op basis van de huidige LUT's. Om de laserinstellingen aan te passen, selecteer je eerst elk kanaal afzonderlijk en pas je het laservermogen en de belichting indien nodig aan. Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de fluorofoor om instellingen aan de microscoop toe te wijzen en de aangepaste instellingen op te slaan, want de software zal deze niet opslaan bij het wisselen naar een ander kanaal.
    1. Schakel over naar het volgende kanaal en pas het aan waar nodig. Klik met de rechtermuisknop op de fluorofoor om instellingen op te slaan. Als je meerdere kanalen in hetzelfde frame verkrijgt, voer dan dezelfde waarden in als na het afzonderlijk bekijken van elk kanaal. Klik met de rechtermuisknop op de fluorofoor om de instellingen op te slaan.
    2. Voor multi-channel acquisitie, selecteer de kanalen van interesse onder het tabblad Lambda . Voor live beeldvorming combineert u alle kanalen tot één kanaal voor snelle vastlegging van fijne beweging uit de betreffende cel, zodat elk kanaal gelijktijdig kan worden opgenomen, in plaats van apart, wat een vertraging in de timelapse kan veroorzaken afhankelijk van de snelheid van de cel.
  4. Ga verder met het aanschaffen van een timelapse voor de gewenste tijd.
    1. In het tijdtabblad linksonder voer je een tijdsverloop van 5-10 minuten in voor tijd met een interval van 20 seconden.
    2. Onder het tabblad verkrijgensinstellingen rechts stel je de beeldresolutie in op 608 x 832 met een pixelgrootte van 0,12 μm.
    3. Verzamel beelden in 10 - 20 μm met een stapgrootte van 0,3 μm om een acceptabele resolutie van fijne microgliaprocessen en synaptische punten langs de z-as te garanderen. Om succesvolle celtracking te garanderen, houd het tijdsinterval tussen frames op 20 - 30 seconden.
      OPMERKING: Vanwege de kwetsbaarheid van het weefsel ex vivo wordt aanbevolen om eerst het experimentele netvlies te fotograferen en niet langer dan een uur. Dit is om de toestand van het contralaterale controleoog te normaliseren, dat zich in een geoxygeneerde kamer moet bevinden tijdens het afbeelden van het eerste netvlies.
  5. Gebruik dit protocol om de oppervlakkigere lagen van het netvlies in beeld te brengen. Door tijdsverloops groter dan 20 μm te verkrijgen, wordt het moeilijker om fijne procesbeweging tijdens de intervallen van 20 seconden vast te leggen. Daarom kun je microglia afbeelden die binnen de 20 μm-stack passen.

5. Tracking analyse en data-export

  1. Oppervlakterendering voor microglia
    1. Converteer het timelapse-bestand naar IMS-formaat met behulp van de bestandsconvertersoftware. Voer de volgende voxelgroottes in op basis van de beeldeigenschappen verkregen in stap 4.2: x = 0,1272423 micron, y = 0,1272423 micron, z = 0,3 micron.
    2. Zodra deze is gelanceerd, start de analysesoftware in Arena. Klik op de Observatiemap om het eerder geconverteerde bestand te openen. Zorg ervoor dat de afbeelding in 3D-weergave is.
    3. Om hele individuele microglia te detecteren, klik je op het blauwe oppervlak icoon in de Objectenbalk . Selecteer de laatste drie opties onder Algoritme-instellingen : Spooroppervlakken (over tijd), Classificeer Oppervlakken en Object-Object Statistieken. Klik op de blauwe afspeelknop om naar de volgende stap te gaan.
      1. In het geval van meerdere microglia selecteer je Segment alleen een Region van Belang (ROI) om te garanderen dat individuele microglia binnen één oppervlakteobject bestaan. Stel de x-, y- en z-parameters dienovereenkomstig in om alleen een oppervlak van de individuele microglia van belang te maken.
    4. Selecteer het kanaal waarvoor een surface rendering wordt gemaakt. Indien gewenst, selecteer Glad om het oppervlak glad te maken en gebruik een verhouding van 1:1 - 1,25 tot de voxelgrootte van de afbeelding. Als het beeld bijvoorbeeld een voxelformaat van 0,12 x 0,12 x 0,3 μm heeft, stel je het oppervlak detail in op 0,15 - 0,16 μm. Selecteer onder drempel Machine Learning Segmentation om de software te trainen in het detecteren van de cellen van belang.
      OPMERKING: Deze volgende stap bestaat uit het invoeren van trainingsgegevens aan Imaris AI via Machine Learning Segmentatie.
    5. Onder Trainingsgegevens observeer je de twee penseeltools: Achtergrond (voor het detecteren van achtergrond) en Voorgrond (voor het detecteren van het ware signaal van het monster). Teken penseelstreken door de gewenste penseel te selecteren en de Shift + Linksmuisklik te gebruiken. Zorg ervoor dat Interpolate Display is geselecteerd onder Instellingen. Selecteer Trainen en Voorspellen om trainingsgegevens van de gemaakte penseelstreken in te voeren.
      OPMERKING: Meer dan zes lijnen invoeren resulteert in een langere verwerkingstijd voor de AI en onnauwkeurige opname van de cel.
      1. Gebruik de gele aanwijzer in het midden om over de z-stack te bewegen. Teken meerdere penseelstreken over de x-, y- en z-vlakken, evenals in een paar (niet alle) tijdsbesteken van de timelapse. Maak 3-5 korte penseelstreken per invoer, want de AI leert het beste met kleine stukjes informatie tegelijk. Pas deze stap iteratief aan bij elke invoer totdat er een nauwkeurig oppervlak van de cel is gemaakt.
      2. Selecteer de gele rechthoek om te schakelen tussen het trainingsdisplay en het daadwerkelijke oppervlak dat als laatste controle wordt aangemaakt. Controleer ook tijdens de timelapse of het oppervlak de cel nauwkeurig weergeeft.
    6. Zodra de nauwkeurige oppervlakteweergave is bereikt, ga je door naar de volgende stap. Deselecteer gesplitste objecten.
    7. Pas het aantal voxels in het histogram aan. Verplaats de drempel zodat kleine objecten die niet met het hoofdoppervlak verbonden zijn verwijderd worden.
      OPMERKING: Deze stap wordt gebruikt om kleine ongewenste oppervlakken te verwijderen die door achtergrondgeluid zijn ontstaan. Het doel is om alle oppervlakken te verwijderen die niet verbonden zijn met het hoofdcellichaam van interesse.
    8. Bewerk vervolgens het oppervlak indien nodig. Maak handmatig alle objecten die geen deel uitmaken van het hoofdoppervlak of snijd randen weg met het schaargereedschap indien nodig.
    9. Indien gewenst, stel een drempel in van toegestane gaten die nog steeds aan het object kunnen worden gekoppeld. Selecteer het tracking-algoritme voor de bewegende cel.
      OPMERKING: Autoregressieve beweging is het meest gebruikte hulpmiddel voor celtracking, omdat het continue beweging gedurende de timelapse volgt.
      1. De maximale afstand en maximale gap-grootte zijn door de gebruiker gedefinieerde getallen die significante punten bepalen van waaruit het oppervlak kan afwijken. Stel een maximale afstand van de afstand in van 0,96 μm en een maximale afstand van 3 (standaardinstellingen).
    10. Vergelijkbaar met hoe oppervlakteobjecten werden gefilterd in stap 5.1.7, filtersporen die niet aan het hoofdoppervlak zijn gekoppeld. Dit wordt ook aangepast met een histogram. Definieer waar je de drempel moet instellen door te kijken wanneer kleine spottracks die niet langer dan vijf tijdsframes duren uit de filteraanpassingen worden verwijderd.
    11. Vervolgens stel je classificaties in indien gewenst. Categoriseer bijvoorbeeld de verplaatsingslengte tussen 0 - 1 μm en 1+ μm om kleine procesbewegingen of aanzienlijk grote proces- of celverplaatsingen te bepalen.
    12. Plaats tenslotte de juiste labels op bepaalde gebeurtenissen met behulp van de classificaties van de vorige stap.
      OPMERKING: Deze stap wordt het beste gebruikt zodra spots zijn gegenereerd voor het postsynaptische signaal.
  2. Spotclassificatie voor PSD95
    1. Om hele individuele microglia te detecteren, klik je op het blauwe oppervlak icoon in de Objectenbalk . Selecteer de laatste drie opties onder Algoritme-instellingen : Spooroppervlakken (over tijd), Classificeer Oppervlakken en Object-Object Statistieken. Klik op de blauwe afspeelknop om naar de volgende stap te gaan.
    2. Selecteer het bronkanaal voor de synaptische marker. Zet de slicer en andere kanalen uit om alleen PSD95 te visualiseren. Gebruik de ctrl-knop en het pointerselectiegereedschap om de xy-diameter van de puncta te schatten.
      1. Kies een paar heldere puncta die de hele timelapse doorgaan (grootte variërend van 0,6 μm tot 1,2 μm).
      2. Zet achtergrondaftrekking uit. Als de afbeelding achtergrondaftrekking vereist, gebruik dan de achtergrond-aftrektool onder Beeldverwerking voordat je de timelapse verwerkt.
    3. Voeg vervolgens een filter toe op basis van spotkwaliteit. Sleep het histogram zodat alle PSD95-puncta nauwkeurig worden vastgelegd gedurende de timelapse.
      OPMERKING: Kwaliteit is gebaseerd op de intensiteit van het midden van spot9. Dit filter vangt het daadwerkelijke signaal van PSD95 het meest nauwkeurig op, vergeleken met het aantal voxelfilters of diameterfilters.
    4. Verwijder vervolgens alle plekken die door ruis zijn gegenereerd met de bewerkingsstap. Wissel tussen de kubuscursor of de cirkelcursor om respectievelijk enkele of meerdere plekken te verwijderen die slechts 1-2 tijdsperioden voorkomen door ruis.
    5. Indien gewenst, stel een drempel in van toegestane gaten die nog steeds aan het object kunnen worden gekoppeld. Selecteer het juiste tracking-algoritme voor de synaptische marker.
      1. De maximale afstand en maximale gap-grootte zijn door de gebruiker gedefinieerde getallen die significante punten bepalen van waaruit de vlekken kunnen afwijken. Stel een maximale afstand van de afstand in van 14,6 μm en een maximale afstand van 3 (standaardinstellingen).
    6. Vergelijkbaar met hoe spotobjecten werden gefilterd in stap 5.2.3, filteren sporen die niet gekoppeld zijn aan verschillende punten. Dit wordt ook aangepast met een histogram. Om te bepalen waar de drempel moet worden ingesteld, let op wanneer kleine objectsporen worden verwijderd.
    7. Stel classificaties in indien gewenst. Onderscheid bijvoorbeeld tussen opgeslokte, gecontacteerde of niet-gecontacteerde puncta door gebruik te maken van de classificatie van de kortste afstand tot het oppervlak. Ingesloten als elke puncta < 0 μm binnen het oppervlak, contact tussen 0 en 0,5 μm van het oppervlak, of ongecontacteerd als 0,5+ μm van het oppervlak.
    8. Plaats tenslotte de juiste labels op bepaalde gebeurtenissen met behulp van de classificaties van de vorige stap.
  3. Zodra oppervlakken en vlekken de microglia en puncta van belang nauwkeurig weergeven, exporteer je alle statistieken van elk object onder het statistiekentabblad . Zorg ervoor dat de gedetailleerde statistieken worden verzameld, waaronder de verplaatsingslengte, snelheid en contactgebeurtenissen als geclassificeerd.
    1. Veel statistieken, zoals gebied, volume, verplaatsingslengte en snelheid, zijn outputs van Imaris. Exporteer de lengte en snelheid van de oppervlakteverplaatsing om de microglia-dynamica in het experiment te definiëren.
      1. Definieer verplaatsingslengte als de afstand tussen de beginpositie van het oppervlak en de eindpositie, gemeten in μm22.
      2. Definieer snelheid als de onmiddellijke snelheid van het oppervlak van het ene tijdsinterval naar het volgende, gemeten in μm/s22.
        OPMERKING: Contactgebeurtenissen zijn een fenomeen dat door de auteurs wordt beschreven als intacte postsynaptische punta die een afstand van 0 μm delen tussen individuele microglia gedurende minstens vijf consistente tijdsperioden binnen de timelapse.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia van de muziene retina's van CX3CR1-GFP werden gefotografeerd met het beschreven protocol. Muizen varieerden van P30 tot P60 ten tijde van de AAV-PSD95-RFP-injectie, en er waren minstens 21 dagen verstreken om AAV-expressie mogelijk te maken. Representatieve beelden van microglia en hun interacties met PSD95 puncta vóór en na analyse zijn weergegeven in Figuur 2. Om microglia-activatie te induceren, gebruikten we het...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt het mogelijk om individuele microglia-interactie met postsynaptische sites langs de dendrieten van RGC's te visualiseren en te volgen. Bij een neurodegeneratieve ziekte zoals glaucoom colokaliseren microglia synapsen in de binnenste plexiforme laag (IPL) van het netvlies. De rol van microglia bij synapsontbinding is niet goed begrepen. Microglia kunnen echter mogelijk bijdragen via verschillende mogelijke mechanismen, waaronder het aberrant opslokken van synapsen, pass...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PSD-95pTagRFP was een gift van Johannes Hell (Addgene plasmide #52671; RRID: Addgene_52671), terwijl de capside-versie, 7m8, een geschenk was van John Flannery en David Schaffer (Addgene plasmide # 64839; RRID: Addgene_64839). We willen Aparna Lakkaraju bedanken dat we de draaiende schijfmicroscoop van hun laboratorium mochten gebruiken en Nilsa La Cunza voor begeleiding bij live imaging. We willen ook Felice Dunn, Annika Balraj en Luca Della Santina bedanken voor nuttige discussies en opmerkingen over dit manuscript. Wij danken Suling Wang voor de hulp bij de data-analyse van Imaris. Dit werk werd gefinancierd door NIH-NEI EY028148 en EY034973 aan Y.O., de ARVO David L. Epstein Award aan Y.O., en NIH-NEI EY034973-S1 aan C.F. Dit onderzoek werd ook deels ondersteund door de UCSF Vision Core gedeelde bron van de NIH-NEI P30 EY002162/EY037668, en door een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, New York, NY. Figuur 1 werd gemaakt op biorender.com.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
25 Gauge NeedleAlcon8065420920
26s Gauge 10 µL SyringeHamilton701RNWG
7m8Addgene64839http://n2t.net/addgene:64839
Bend-and-Stay Multipurpose 304 Stainless Steel WireStanford Advanced MaterialsSS3368Staaldraad om ringen te maken
Calcium Chloride HexahydrateSigma-AldrichC5080-500G
Dissection MicroscopeAmscopeOm retina's te dissecteren en te monteren
Dissection ScissorsFST15024-10
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG7528-250G
ForcepsDumont11252-21
HEPESSigma-AldrichH3375-500G
Imaris 10.0.2Oxford InstrumentsAnalysesoftware
Imaris File ConverterOxford Instruments
Loctite Super Glue Ultra Gel ControlLoctite1363589Lijm voor het maken van ringen
Magnesium Chloride HexahydrateSigma-AldrichM9272-100G
MCE Membrane filter paper (13 mm)MilliporeHABG013000.45 μm Poriegrootte
Microenvironmental ChamberTokai HitSTXG-TIZBX-SET
Nikon Eclipse Ti2-E inverted microscopeNikon
NIS ElementsNikon
Neomycin and Polymyxin B Sulfaes and Bacitracin Zinc Opthalamic Solution Ointment, USPBausch + Lomb24208-780-55
Paintbrush Size 00Amazon
Prism 8.0GraphPad
Proparacaine Hydrochloride Opthalmic Solution USP, 0.5%Sandoz61314-0016-01
PDL-coated petri dish (35 mm)MatekP35GC-1.5-14-CGeen 1.5 Coverslip
PSD95_pTagRFPAddgene52671http://n2t.net/addgene:52671
Potassium ChlorideSigma-AldrichP9333-500G
Sodium ChlorideSigma-AldrichS7653-1KG
Sodium Phosphate Monobasic MonohydrateSigma-AldrichS9638-25G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wu, Y. K., Hengen, K. B., Turrigiano, G. G., Gjorgjieva, J. Homeostatic mechanisms regulate distinct aspects of cortical circuit dynamics. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (39), 24514-24525 (2020).
  2. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  3. Rosin, J. M., et al. Embryonic microglia interact with hypothalamic radial glia during development and upregulate the TAM receptors MERTK and AXL following an insult. Cell Rep. 34 (1), 108587(2021).
  4. Wang, X., Li, K., Guo, L., Liu, X., Guo, Y., Zhang, W. The influence of changes in microglia development on the plasticity of the developing visual cortex circuit in juvenile mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 66 (4), 45(2025).
  5. Blume, Z. I., Lambert, J. M., Lovel, A. G., Mitchell, D. M. Microglia in the developing retina couple phagocytosis with the progression of apoptosis via P2RY12 signaling. Dev Dyn. 249 (6), 723-740 (2020).
  6. Brown, T. C., et al. Microglia are dispensable for experience-dependent refinement of mouse visual circuitry. Nat Neurosci. 27 (8), 1462-1467 (2024).
  7. Huang, Y., et al. Microglia use TAM receptors to detect and engulf amyloid β plaques. Nat Immunol. 22 (5), 586-594 (2021).
  8. Ding, X., et al. Loss of microglial SIRPα promotes synaptic pruning in preclinical models of neurodegeneration. Nat Commun. 12 (1), 2030(2021).
  9. He, J., et al. Microglia mediate synaptic material clearance at the early stage of rats with retinitis pigmentosa. Front Immunol. 10, 912(2019).
  10. Yu, A., Fang, C., Tan, L. X., Lakkaraju, A., Della Santina, L., Ou, Y. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).
  11. Xu, S., et al. Synaptic changes and the response of microglia in a light-induced photoreceptor degeneration model. Mol Vis. 27, 206-220 (2021).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Microglia states and nomenclature: a field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
  13. Yu, Z., Gutu, A., Kim, N., O'Shea, E. K. Synapse weakening-induced caspase-3 activity confers specificity to microglia-mediated synapse elimination. bioRxiv. , (2024).
  14. Miller, E. B., Zhang, P., Ching, K., Pugh, E. N., Burns, M. E. In vivo imaging reveals transient microglia recruitment and functional recovery of photoreceptor signaling after injury. Proc Natl Acad Sci USA. 116 (33), 16603-16612 (2019).
  15. Wahl, D. J., Ng, R., Ju, M. J., Jian, Y., Sarunic, M. V. Sensorless adaptive optics multimodal en-face small animal retinal imaging. Biomed Opt Express. 10 (1), 252(2019).
  16. Ou, Y., Jo, R. E., Ullian, E. M., Wong, R. O. L., Della Santina, L. Selective vulnerability of specific retinal ganglion cell types and synapses after transient ocular hypertension. J Neurosci. 36 (35), 9240-9252 (2016).
  17. Della Santina, L., et al. Disassembly and rewiring of a mature converging excitatory circuit following injury. Cell Rep. 36 (5), 109463(2021).
  18. Ramírez, A. I., et al. Microglial changes in the early aging stage in a healthy retina and an experimental glaucoma model. Prog Brain Res. 256, 125-149 (2020).
  19. de Hoz, R., et al. Bilateral early activation of retinal microglial cells in a mouse model of unilateral laser-induced experimental ocular hypertension. Exp Eye Res. 171, 12-29 (2018).
  20. Soliño, M., Yu, A., Della Santina, L., Ou, Y. Large-scale survey of excitatory synapses reveals sublamina-specific and asymmetric synapse disassembly in a neurodegenerative circuit. iScience. 26 (8), 107262(2023).
  21. Negrini, M., Wang, G., Heuer, A., Björklund, T., Davidsson, M. AAV production everywhere: a simple, fast, and reliable protocol for in-house AAV vector production based on chloroform extraction. Curr Protoc Neurosci. 93 (1), e103(2020).
  22. Imaris reference manual. , https://lims.gzzoc.com/files/instrument/20240722/2024072212391299299_ImarisManual.pdf (2024).
  23. Joseph, A., Power, D., Schallek, J. Imaging the dynamics of individual processes of microglia in the living retina in vivo. Biomed Opt Express. 12 (10), 6157(2021).
  24. Wu, W., et al. In vivo imaging in mouse spinal cord reveals that microglia prevent degeneration of injured axons. Nat Commun. 15 (1), 8837(2024).
  25. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microglia DynamicsSynaptic PruningRetinal ExplantSpinning Disk MicroscopyMicroglia MotilityPSD95 LabelingTime Lapse ImagingSynapse InteractionNeuroinflammationSurface Rendering

Related Articles