Op lijm gebaseerde weefselmicroarray-constructie voor tumor- en ziekteonderzoek

Summary

Dit protocol beschrijft een goedkope productie en efficiënte validatiemethode voor op lijm gebaseerde TMA-constructie, en biedt een handig pathologisch diagnoseplatform voor tumor- en ziekteonderzoek.

Abstract

Tissue microarray-technologie (TMA) is een high-throughput platform voor de gelijktijdige detectie en analyse van meerdere weefselmonsters, waardoor efficiënt onderzoek naar tumor- en ziektebiomarkers mogelijk wordt. Conventionele TMA-constructiemethoden hebben echter vaak te maken met beperkingen zoals operationele complexiteit, tijdrovende procedures en variabele nauwkeurigheid. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, is een op lijm gebaseerde TMA-constructiemethode ontwikkeld, die een verbeterde fixatie van de weefselkern en een verbeterde structurele stabiliteit biedt. Systematische validatie omvatte histologische evaluatie (HE-kleuring), immunohistochemische profilering van doeleiwitten en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) analyse. De resultaten toonden aan dat de op lijm gebaseerde methode een uitstekende snij-integriteit behield, de signaal-ruisverhouding verbeterde en een consistente reproduceerbaarheid van batch tot batch garandeerde. Hoewel de aanpak beperkt is tot handmatige bediening, biedt het een betrouwbare en kosteneffectieve optie voor TMA-productie met matige doorvoer. Deze methode is met name geschikt voor onderzoeksomgevingen die flexibiliteit en steekproefdiversiteit waarderen boven grootschalige automatisering, waardoor het nut van TMA in academische en diagnostische omgevingen wordt uitgebreid.

Introduction

Tissue Microarray (TMA) is een high-throughput techniek voor het analyseren van weefselmonsters ^1,2,3. Er worden meerdere donorweefselkernen verkregen en donorparaffineblokken worden overgebracht naar ontvangende weefselblokken voor gelijktijdige differentiële en vergelijkende moleculaire analyse onder theoretisch dezelfde prestatieomstandigheden ^2,4. De klassieke manier om een weefselmicroarray (TMA) te construeren, is door een perforator te gebruiken om weefselkernen uit een donorweefselmonster te extraheren en deze achtereenvolgens in een ontvangend paraffineblok te rangschikken. Deze methode is geschikt voor donorparaffineblokken met een vergelijkbare diepte en maakt de efficiënte analyse van meerdere monsters op een enkele plak mogelijk, waardoor de efficiëntie van het onderzoek en de consistentie van de gegevens aanzienlijk worden verbeterd ^5,6,7. Desalniettemin heeft deze methode nog steeds bepaalde beperkingen, waaronder een ontoereikende behandeling van de weefselkern tijdens het inbeddingsproces, wat kan leiden tot inconsistente kleuring van monsters in latere analyses⁸.

De tweede methode van TMA-constructie is de tapemethode ^9,10. Deze methode keert het constructieproces om door het blok te gieten rond omgekeerde rechtopstaande kernen die na voltooiing gelijk liggen met de bovenkant van de TMA, ongeacht de kernlengte^11,12. Deze methode vereist echter dat de juiste plaatsing van de weefselkern en de effectiviteit van de tape worden gegarandeerd, en beperkt ook het aantal monsters dat kan worden verwerkt in vergelijking met traditionele technieken.

Deze studie stelt een innovatieve lijmmethode voor het construeren van TMA voor, met als doel problemen op te lossen zoals de onvoldoende stabiliteit van weefselkernen en complexe operaties die bestaan in traditionele technieken¹³. Deze methode maakt gebruik van lijm om meerdere weefselkernen nauwkeurig aan elkaar te bevestigen en heeft de voordelen van een eenvoudige bediening en een sterke stevigheid van het monster. Vergeleken met de traditionele sectie- of tapemethoden, kan de lijmmethode de retentiesnelheid van weefselkernen verhogen en de kosten verlagen. Deze methode is van toepassing op klinische studies met een gemiddelde steekproefomvang en is met name geschikt voor onderzoeksontwerpen die een flexibele aanpassing van het experimentele plan vereisen. Er moet echter worden opgemerkt dat de verwerkingscapaciteit van deze methode niet voldoet aan de eisen van ultrahoge doorvoer⁹. Ondertussen moet in het eigenlijke toepassingsproces een complete set gestandaardiseerde operationele normen en kwaliteitscontrolesystemen worden vastgesteld. Operators moeten systematische training krijgen en professionele beoordelingen doorstaan om de standaardisatie van technische bewerkingen en de herhaalbaarheid van de resultaten te garanderen. Uitgebreide analyse geeft aan dat deze technologie een goede balans bereikt tussen operationele flexibiliteit, kosteneffectiviteit en technische betrouwbaarheid, en met name geschikt is voor onderzoeksscenario's waarin de middelen beperkt zijn, maar de kwaliteitscontrole nog moet worden gegarandeerd.

Protocol

Alle donorblokken zijn verkregen uit archiefpathologische monsters die tussen 2016 en 2018 zijn verzameld in het Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital van de Nanjing Medical University. De monsters werden vóór gebruik geanonimiseerd en verwerkt in overeenstemming met goedgekeurde protocollen (de ethische commissie van het Affiliated Huai'an No.1 People's Hospital van Nanjing Medical University, KY-2024-250-01).

1. Beoordeling en labelen van donorweefsel

1. Selecteer weefselblokken met een dikte van ≥5 mm en een oppervlakte van ≥15 mm × 15 mm. Zorg voor een veiligheidsmarge van 2 mm aan de randen en sluit gebieden met necrose, bloeding of verkalking uit om de weefselintegriteit te behouden.
2. Identificatie en markering van het doelgebied
   1. Evalueer de H&E-gekleurde secties met behulp van een optische microscoop. Lokaliseer het doelgebied door middel van scannen met laag vermogen en schakel vervolgens over naar krachtig om de cellulaire morfologische kenmerken te bevestigen. Markeer de grenzen van het doelgebied op de dia's.
   2. Wijs de coördinaten van het geselecteerde gebied toe aan het oppervlak van het paraffineblok om de markeringsconversie te voltooien.

2. Extractie van weefselkern

1. Voorbereiding van de punctie en voorbehandeling van monsters
   1. Kies een handperforator met een diameter van 2 mm en bevestig de soepelheid van de snijkant en het bedieningsgemak.
   2. Plaats het donorparaffineblok gedurende 15 minuten op een koud platform bij 4 °C.
2. Lijn de naald verticaal uit met het gemarkeerde punt en oefen een constante rotatiedruk uit om de beperkende diepte te bereiken. Vermijd kantelen of trillen tijdens het proces⁷ (Figuur 1A).
3. Draai de naald voorzichtig tegen de klok in (≤2 omwentelingen/s) om hem terug te trekken. Werp de weefselkern voorzichtig uit de naald en breng deze over in een individueel putje van een voorgekoelde plaat met 96 putjes. Noteer de kernlocatie in elke put (Figuur 1B).
   OPMERKING: Als de onderkant van de weefselkern ongelijk is, egaliseer deze dan met een mes. Controleer na het trimmen de integriteit opnieuw.
4. Noteer vooraf alle donornummers en de bijbehorende ELISA-posities (A1-H12) in het registratieformulier. Controleer tijdens de operatie opnieuw om er zeker van te zijn dat de donornummers en de putposities strikt overeenstemmen.
5. Inspecteer de kernen onmiddellijk op integriteit. Gooi kernen weg die gebroken of verbogen zijn of een diameter vertonen >0,1 mm.
   OPMERKING: Zorg voor consistentie van de kernlengte (variatiecoëfficiënt, CV ≤5%) en vermijd krassen op het oppervlak of compressieartefacten.

3. Fixatie van de weefselkern

1. Gebruik een waterdichte stift om een raster direct op het oppervlak van de mal te tekenen, wat zorgt voor duidelijke en gelijkmatig verdeelde lijnen.
   1. Gebruik een standaard mal met een effectief bodemoppervlak van 3,0 cm × 2,5 cm en reserveer aan elke kant een blanco afbakening van 1,5 mm.
   2. Gebruik een watervaste marker met een fijne punt van 0,5 mm om negen gelijke parallelle lijnen horizontaal en verticaal te tekenen, waardoor een positioneringsraster van 9 × 9 wordt gevormd (in totaal 81 snijpunten).
      NOTITIE: Voordat u begint, reinigt u de binnenkant van de vorm met een in xyleen gedrenkt wattenstaafje om achtergebleven paraffine te verwijderen, die delaminatie kan veroorzaken. Gebruik tijdens het tekenen een stalen liniaal om te zorgen voor een uniforme lijndikte en duidelijk te onderscheiden snijpunten.
2. Gebruik een pipet om 5 μL lijm op te trekken en plaats deze voorzichtig in het midden van het voorgelabelde objectglaasje om een enkele druppel te vormen. Gebruik onmiddellijk een fijn pincet om de weefselkern verticaal op te pakken in een hoek van 90° en druk deze langzaam verticaal in de lijmdruppel (Figuur 1C).
3. Steek de kernen met een pincet in de overeenkomstige roosterkruispunten op de mal. Oefen gedurende 5 s lichte druk uit om een veilige hechting te garanderen (Figuur 1D).
4. Als de weefselkern wordt verplaatst, verfijn deze dan en reset deze onmiddellijk met een fijn pincet voordat de lijm stolt (binnen 30 s). Gooi gestold, verkeerd uitgelijnde kernen weg om de bereidingskwaliteit te behouden en kostbare monsters zoveel mogelijk te bewaren.

4. Cassette-installatie en paraffine-inbedding

1. Plaats de tissuecassette verticaal over de stalen mal en zorg ervoor dat deze contact maakt met de kernpunten zonder compressie toe te passen. Zet de cassette vast met magnetische klemmen op alle vier de hoeken en dicht de naden af met gesmolten paraffine.
2. Laat gesmolten paraffine trekken in een hoek van 45° in een zigzagpatroon, met behoud van een debiet van 1 ml/s. Zorg ervoor dat het paraffinegehalte 2 mm hoger is dan de kernpunten (Figuur 1E).
3. Koel het blok snel af op een koude plaat van 4 °C gedurende 5 minuten om een stijve steunlaag te vormen. Breng het blok gedurende 20 minuten over naar een omgeving van 22 °C om interne stress te verminderen. Gebruik ten slotte een heteluchtpistool van 40 °C om het oppervlak voorzichtig glad te strijken en krimpplekken te verwijderen.
4. Verwarm de paraffine lichtjes om deze zachter te maken en snijd vervolgens voorzichtig langs de randen van de cassette om het blok los te maken. Til de cassette voorzichtig op en verwijder eventuele resterende paraffine om de integriteit van de weefselkernen te waarborgen (Figuur 1F).

Results

In de huidige studie werden hoogwaardige weefselmicroarrays geconstrueerd met behulp van de lijmmethode. Om de effectiviteit van de methode te verifiëren, werd een reeks experimenten uitgevoerd, waaronder H&E-kleuring, immunohistochemische detectie van specifieke eiwitten en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) -analyse. Een cruciaal onderdeel van het constructieproces is de aanwezigheid van weefselkernpunten op de verwachte posities en afstanden van elkaar, die wordt beoor...

Discussion

Als innovatieve methode voor het construeren van weefselmicroarrays (TMA) heeft de lijmmethode aanzienlijke voordelen opgeleverd vanwege het gemak van constructieprocedures en kosteneffectiviteit. Vergeleken met de traditionele naaldarray-methode, die berust op geavanceerde instrumenten^14,15, maakt de lijmmethode monsterfixatie mogelijk door te lijmen, wat kan worden gedaan met alleen basisgereedschap, waardoor de technische drem...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Borstkanker HER2 Detectie kit	Anbiping	2502001	Borstkanker HER2 Detectie kit
CDHR4 antilichaam	Abcam	ab166914	CDHR4 antilichaam
CDK1 antilichaam	Abcam	ab265590	CDK1 antilichaam
CRTAC1 antilichaam	Abcam	ab254691	CRTAC1 antilichaam
DNASE1L3 antilichaam	Abcam	ab203669	DNASE1L3 antilichaam
Inbeddingsmachine	P.S.J MEDICAL	BM450A	Inbeddingsmachine
Volautomatische weefseldehydrator	Leica Biosystems	ASP3005	Volautomatische weefseldehydrator
Glazen microscoopglazen	Citotest	250124A1	Glazen microscoopglazen
Lijm	TIZO	200	Lijm
GPR146 antilichaam	Abcam	ab117104	GPR146 antilichaam
IGSF10 antilichaam	Abcam	ab197671	IGSF10 antilichaam
ITIH1 antilichaam	Abcam	ab233032	ITIH1 antilichaam
Microtoommessen met laag profiel	Thermo Fisher	3052835	Microtoommessen met laag profiel
Markerstift	Deli	SK109	Markerstift
Microtoom	Leica Biosystems	HistoCore BIOCUT	Microtoom
Paraffinewas	Solarbio	YA0012	Paraffinewas
SMAD9 antilichaam	Abcam	ab262940	SMAD9 antilichaam
TARBP1 antilichaam	Abcam	ab115896	TARBP1 antilichaam
ZCCHC24 antilichaam	Abcam	ab88756	ZCCHC24 antilichaam