Flowcytometrie en eencellige analyse voor het karakteriseren van microglia-activering bij vroege postnatale hersenontwikkeling bij muizen

Summary

Dit protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing om microgliale celtoestanden in het cerebellum van vroege postnatale muizenhersenen te isoleren en te karakteriseren. Het maakt gebruik van enzymatische dissociatie, Percoll-centrifugatie en immunokleuring om de heterogeniteit van microglia's te onthullen en het begrip van hun rol in de ontwikkeling en ziekte van cerebellaire patiënten te verbeteren.

Abstract

Microglia, de immuuncellen van de hersenen, vertonen regio- en contextspecifieke transcriptieprofielen tijdens ontwikkeling en ziekte. Dit protocol presenteert twee complementaire methoden voor het bestuderen van microgliale populaties in cerebellair weefsel van muizen: flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing.

Als eerste methode die wordt gebruikt, is het op flowcytometrie gebaseerde protocol geoptimaliseerd voor vroege postnatale hersenen, wat zorgt voor robuuste celisolatie en consistentie onder experimentele omstandigheden. Het begint met weefseldissociatie met behulp van enzymatische digestie, gevolgd door myelineverwijdering via Percoll-dichtheidsgradiëntcentrifugatie om een hoogwaardige neurale celsuspensie te verkrijgen, en een gating-strategie op basis van CD45- en CD11b-expressie. Levende/dode kleuring zorgt voor de levensvatbaarheid van de cel, en fluorchroom-geconjugeerde antilichamen worden gebruikt om de expressie van geselecteerde oppervlaktemarkers op microglia te profileren. Compenserende controles worden uitgevoerd met behulp van latexkralen met gevalideerde poortstrategieën met behulp van fluorescentie minus één (FMO) controle.

De tweede methode omvat single-cell RNA-sequencing met behulp van 10X Genomics, volgens dezelfde stroomopwaartse isolatiestappen, die transcriptomische profilering van microglia onder verschillende omstandigheden mogelijk maken. Microgliale clusters worden geïdentificeerd met behulp van genexpressieanalyse en differentiële expressieanalyse wordt uitgevoerd tussen experimentele groepen. Een willekeurige bosclassificatie wordt uitsluitend toegepast om mannelijke en vrouwelijke monsters te onderscheiden wanneer deze wordt gemultiplext.

Samen bieden deze reproduceerbare en aanpasbare protocollen een robuust kader voor het onderzoeken van de microgliale diversiteit in het cerebellum tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen en de mogelijke verandering ervan na experimentele verstoringen.

Introduction

De vroege postnatale periode is een kritieke fase voor de ontwikkeling van de hersenen, gekenmerkt door complexe cellulaire en moleculaire processen die de basis leggen voor cognitieve, emotionele en gedragsfuncties¹. Deze periode wordt echter ook gekenmerkt door kwetsbaarheid, aangezien verstoringen de neurologische ontwikkelingstrajecten kunnen veranderen en kunnen leiden tot langdurige neurologische of psychiatrische stoornissen. Microglia, de immuuncellen van de hersenen, spelen een centrale rol bij het vormgeven van de zich ontwikkelende hersenen door middel van synaptisch snoeien, fagocytose, immuunbewaking en reacties op beledigingen uit de omgeving ^2,3. Deze cellen vertonen een opmerkelijke plasticiteit en nemen transcriptieprofielen aan die variëren afhankelijk van het hersengebied, de ontwikkelingsfase en de pathologische context ^4,5.

Nauwkeurige analyse van microglia-activering in de zich ontwikkelende hersenen vereist robuuste en herhaalbare methodologieën die in staat zijn om hun dynamische fenotypes te analyseren in de context van onrijpe hersenweefsels. Flowcytometrie biedt een betrouwbare oplossing, die de high-throughput karakterisering van cellulaire populaties en markerexpressie mogelijk maakt⁶. De toepassing ervan bij het bestuderen van microglia uit vroege postnatale hersenen is echter technisch uitdagend vanwege de delicate aard van het weefsel en de noodzaak van efficiënte celisolatie- en verrijkingsprotocollen ^7,8.

Het hier gepresenteerde protocol combineert flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq) om microglia te isoleren en te karakteriseren uit vroege postnatale muizenhersenen, met een bijzondere focus op het cerebellum van postnatale dag 3 (P3) tot postnatale dag 30 (P30)⁹, een regio en ontwikkelingsfase waarvoor gedetailleerde methodologische referenties beperkt blijven.

Deze workflow omvat enzymatische dissociatie, dichtheidsgradiëntcentrifugatie voor het verwijderen van puin en celverrijking, en immunokleuring met behulp van een panel van extracellulaire en intracellulaire markers. Om de diversiteit van microglia te karakteriseren, wordt een reeks oppervlakte- en intracellulaire markers gebruikt^10,11. In plaats van vaste labels toe te kennen (inflammatoir of herstellend), definieert het protocol subpopulaties op basis van discrete markerexpressieprofielen. Microglia die CD80, CD86 en iNOS, CD206 en Arg1, CD86 en CD64, of CD163 en CD206 tot expressie brengen, worden bijvoorbeeld geïdentificeerd en geanalyseerd als moleculair verschillende subsets. Deze markers weerspiegelen verschillende geactiveerde microglia-toestanden^10,11 en worden gepresenteerd als expressieprofielen.

Deze multiparametrische poortstrategie maakt nauwkeurige identificatie van microgliale subsets mogelijk op basis van expressie van oppervlaktemarkers, en biedt een gestroomlijnd kader voor het analyseren van immuunheterogeniteit tijdens postnatale hersenontwikkeling. Om fenotypische profilering uit te breiden en transcriptionele diversiteit bloot te leggen, wordt eencellige RNA-sequencing uitgevoerd na celisolatie. Deze studie stelt een consistente en schaalbare workflow vast om het begrip van neurologische ontwikkelingsprocessen en de langetermijnimpact van microgliale activering te vergroten. Door geoptimaliseerde flowcytometrie en scRNA-seq te integreren binnen een ontwikkelings- en regionaal geïnformeerd kader, dient dit protocol als een krachtig hulpmiddel voor het onderzoeken van microgliale biologie in het vroege leven en de relevantie ervan voor neurologische ontwikkelingsresultaten.

Protocol

Alle dierprocedures zijn beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het CHU Sainte-Justine Research Centre en voldoen aan de richtlijnen en het beleid van het Ste-Justine Research Center en de Universiteit van Montreal (Montreal, Quebec, Canada).

1. Celisolatie van de hersenen

1. Verwijder na anesthesie-/euthanasieprocedures snel de hele hersenen uit de schedelholte en plaats deze in een buis van 15 ml met microgliale celkweekmedium (zie materiaaltabel). Houd de tube op ijs. Herhaal dezelfde procedure voor extra muizen indien nodig.
   Alle muizen die in deze studie werden gebruikt, waren afkomstig van eigen fokkolonies in het laboratorium van Dr. Tremblay. De experimentele muizen werden gegenereerd door B6.129-Cx3Cr1^{CreERT2-EYFP/WT-muizen} te kruisen met B6-Rosa26^{iDTR/WT-muizen} , beide oorspronkelijk afkomstig van Jackson Laboratories. Deze kweekstrategie produceerde nakomelingen die heterozygoot waren voor het IDTR-allel , waardoor voorwaardelijke depletie van cellen die Cx3Cr1 tot expressie brengen (voornamelijk microglia) mogelijk maakte via een tamoxifen-induceerbaar Cre-loxP-systeem . Voorafgaand aan de weefselafname werden muizen verdoofd via intraperitoneale injectie van ketamine (150 μg/g) en xylazine (10 μg/g). Euthanasie werd uitgevoerd door onthoofding onder diepe anesthesie, in overeenstemming met de richtlijnen voor dierenverzorging en -gebruik van dieren.
2. Behoud het hele brein of ga desgewenst verder met de ontleding van specifieke regio's. Voer de dissectie uit in een klein petrischaaltje met microgliaal celkweekmedium (zie materiaaltabel) op ijs om de levensvatbaarheid van de cellen te behouden.
   OPMERKING: Dit protocol is gevalideerd voor de hele hersenen en het cerebellum van P1 tot P30.
3. Verwijder het microgliale celkweekmedium en snijd het hersenweefsel fijn met behulp van een scalpel in een petrischaaltje.
4. Breng voor de enzymatische vertering het gehomogeniseerde weefsel over in buisjes van 5 ml. Voeg 2 ml HBSS (1x) aangevuld met 2 mg/ml collagenase D en 14 μg/ml DNase I toe (zie Tabel 1). Sluit de doppen van de buis af met parafilm. Incubeer de buisjes gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C en schud de buisje elke 5 minuten. Om de spijsvertering te stoppen, plaatst u de buisjes op ijs.
5. Leid het homogenaat door een metalen gaasfilter van 140 μm (zie materiaaltabel) om groot vuil te verwijderen. Gebruik een glazen stamper om de cellen te dissociëren.
6. Was het filter meerdere keren met microgliaal celkweekmedium (3 ml per wasbeurt).
7. Verzamel het filtraat met behulp van een pipet van 10 ml en breng het over in een buisje van 15 ml. Centrifugeer de oplossing gedurende 7 minuten bij 500 g bij 4 °C.
8. Gooi het bovenstaande weg door de buis voorzichtig om te keren. Resuspendeer de pellet door voorzichtig op een rek te schrapen.
9. Voeg 10 ml colloïdaal mediumoplossing op basis van 37% silica toe (zie tabel 1) om myeline en vuil te verwijderen. Centrifugeer de oplossing bij 500 g gedurende 10 minuten bij 4 °C met minimale remkracht.
10. Zuig de myelinelaag aan de bovenkant van de oplossing op met behulp van een pipet van 10 ml.
    OPMERKING: Continue aspiratie voorkomt dat de myeline zich weer vermengt met de oplossing.
11. Was de cellen door 10 ml HBSS (1x) toe te voegen en centrifugeer bij 500 × g gedurende 7 minuten bij 4 °C.
12. Gooi het bovenstaande weg. Resuspendeer de pellet door voorzichtig met een rek te schrapen en voeg vervolgens 10 ml buffer voor fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) toe (zie tabel 1). Centrifugeer de oplossing gedurende 10 minuten bij 500 g bij 4 °C.
13. Gooi de supernatant weg, suspendeer de uiteindelijke pellet opnieuw en behoud de cellen. De geïsoleerde cellen zijn nu klaar voor flowcytometriekleuring of eencellige RNA-sequencing.
14. Voor isolatie van eencellige RNA-sequencing telt u de cellen onder een microscoop met behulp van benchtop-stabiele fluorescerende reagentia (zie Materiaaltabel) om levende en dode cellen met kern te onderscheiden, samen met Trypan Blue (zie Materiaaltabel). Zorg ervoor dat de cellen in uitstekende staat verkeren, met een levensvatbaarheid tot 90%, en een concentratie van 1000 cellen/μL bereiken). De volgende stappen worden beschreven in paragraaf 9.1.
    OPMERKING: Houd de buizen gedurende het hele protocol op ijs. Alle centrifugatiestappen moeten worden uitgevoerd bij 4 °C met een maximale rem, behalve voor de Percoll-stap, waarvoor een minimale rem is voorgeschreven. Voor het beste resultaat voert u het hele protocol op dezelfde dag uit. Voor het single-cell RNA seq-protocolfilter alle oplossingen die voor isolatie worden gebruikt, gebruikt u in stap 1.11 HBSS (1x) voor de tweede wasbeurt en behoudt u in stap 1.12 70-100 μl van de celoplossing.

2. Protocol voor extracellulaire kleuring van flowcytometrie

1. Breng alle cellen over in een plaat met 96 putjes met een conische bodem (zie materiaaltabel). Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 g bij 4 °C.
2. Keer de plaat snel om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen.
3. Resuspendeer de celpellet in 25 μl blokkeeroplossing (zie tabel 1). Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
4. Om de extracellulaire antilichaamkleuringsmix te bereiden (zie tabel 2), centrifugeert u antilichaamvoorraden van 10.000 × g om potentiële aggregaten te verwijderen. Zuig zonder de pellet te verstoren voorzichtig het gewenste volume uit het bovenstaande op om het kleuringsmengsel te bereiden en stel het volume in op 25 μL met FACS-buffer.
5. Voeg 25 μL van de extracellulaire antilichaammix toe aan elk putje. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT.
   OPMERKING: Voorafgaand aan experimenteel gebruik werden alle antilichamen getitreerd op cerebellaire (of hersenen) eencellige suspensies om de optimale werkconcentratie te bepalen. Titratie werd uitgevoerd door middel van seriële verdunningen om een verzadigingscurve te genereren, en de verdunning die overeenkomt met een signaalplateau met minimale achtergrond werd geselecteerd voor de signaalstadiëring.
6. Voeg zonder te mengen 150 μL FACS-buffer toe aan de putjes. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Keer de plaat om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen.
7. Resuspendeer de celpellet in 200 μl FACS-buffer. Centrifugeer de plaat 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Keer de plaat om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen. Herhaal de wasbeurt nog een keer met 200 μL FACS-buffer onder dezelfde omstandigheden.

3. Intracellulaire kleuring

1. Resuspendeer de cellen in 100 μl saponine-paraformaldehyde (PFA)-buffer (zie tabel 1) om de cellen te fixeren en te permeabiliseren. Incubeer gedurende 10 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
2. Voeg zonder te mengen 100 μL saponinebuffer toe (zie tabel 1). Centrifugeer de plaat 6 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Keer de plaat om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen.
3. Resuspendeer de celpellet in 200 μl saponinebuffer. Bereid compensatiecontroles voor door 20 μL kralen (zie Materiaaltabel) toe te voegen aan 11 lege putjes. Centrifugeer de plaat gedurende 6 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Keer de plaat om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen.
4. Om de intracellulaire antilichaamkleuringsmix te bereiden (zie tabel 3), centrifugeert u antilichaamvoorraden van 10.000 × g om potentiële aggregaten te verwijderen. Zuig zonder de pellet te verstoren voorzichtig het gewenste volume uit het bovenstaande op om het kleuringsmengsel te bereiden en stel het volume in op 50 μL met saponinebuffer.
5. Resuspendeer de pellet in 50 μl intracellulaire antilichaammix (zie tabel 3). Voeg 1 μL van elk antilichaam toe aan de kralenputjes. Incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
6. Voeg zonder te mengen 150 μL saponinebuffer toe aan elk cellenmonsterputje en voeg 100 μL FACS-buffer toe aan elk putje met de compensatieregelaars om de kralen te wassen. Centrifugeer de plaat bij 500 × g gedurende 6 minuten bij 4 °C. Keer de plaat om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen.
7. Resuspendeer de celpellet in 200 μl saponinebuffer en suspendeer de compenserende controles in 200 μl FACS-buffer. Centrifugeer de plaat gedurende 6 minuten bij 500 × g bij 4 °C. Keer de plaat om om het bovenstaande in één beweging te verwijderen. Herhaal de wasbeurt nog een keer met 200 μL saponinebuffer onder dezelfde omstandigheden.
8. Resuspendeer de cellen en de compenserende regelaars in 200 μl FACS-buffer. Breng de suspensie over in een FACS-buisje en bewaar bij 4 °C totdat de flowcytometrie is verkregen.
   NOTITIE: Zorg ervoor dat alle stappen met lichtgevoelige reagentia worden uitgevoerd bij minimale lichtomstandigheden. Eén kralenpotje bevat geen antilichaam, wat overeenkomt met de ongekleurde kralenbuis.

4. Acquisitie van flowcytometrie

1. Zet de flowcytometer aan en vervolgens de computer.
2. Open de flowcytometersoftware en start het opstarten van de fluïdica door Uitvoeren te selecteren onder het tabblad cytometer.
3. Maak een nieuwe experimentmap door op Nieuwe map te klikken en een naam toe te wijzen. Klik vervolgens op Nieuw experiment om het experiment een naam te geven en selecteer Nieuwe buis om een monster en voorbeeldbuis toe te voegen.

5. Stel compensatiecontroles in

1. Bereid enkelvoudig gekleurde compensatieparels voor voor elk fluorchroom dat in het paneel wordt gebruikt, samen met een niet-gekleurde controle.
2. Laad de compensatiebuisjes op de cytometer. Stel de voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijverstrooiing (SSC) voltages in op ongeveer 250.
3. Pas de spanningen voor elk fluorescerend kanaal aan, zodat de negatieve populatie zich in het eerste decennium van de as bevindt.
4. Verwerf ten minste 5.000 evenementen per tube.
5. Gebruik de compensatiematrix om te corrigeren voor spectrale overlap totdat alle positieve pieken duidelijk gescheiden zijn van de negatieve populatie en gecentreerd zijn boven 10:⁴ op de respectievelijke as.
   OPMERKING: Compensatiecontroles moeten voor elk experiment worden uitgevoerd, aangezien cytometerinstellingen of fluorochroomprestaties de spectrale overlap aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Hoewel celgebaseerde compensatiecontroles worden aanbevolen in sommige toepassingen van hersenweefsel, werden in dit protocol antilichaam-afvangkralen gebruikt vanwege het lagere aantal microglia dat kan worden verkregen uit het cerebellum van P3-muizen, wat de haalbaarheid van celgebaseerde compensatie beperkt. Antilichaamfluorescentie werd aanvankelijk gevalideerd op cellen van de hersenen en bleek vergelijkbaar te zijn met op kralen gebaseerde signalen. Voeg een ongekleurde hersensuspensie toe tijdens de initiële paneloptimalisatie om weefselautofluorescentie te beoordelen en basissignaalniveaus vast te stellen. Deze controle is essentieel om negatieve populaties in elk fluorescerend kanaal goed in te stellen.

6. FMO-besturingen voorbereiden en aanschaffen

1. Bereid voor elke sleutelmarker een fluorescentie minus één (FMO) -controle voor die alle antilichamen omvat, behalve degene die wordt getest.
2. Voer de FMO-bedieningselementen uit met dezelfde acquisitie-instellingen als de volledig gekleurde samples.
3. Gebruik FMO-plots om poortdrempels te definiëren voor lage of overlappende populaties en om echte positieven te onderscheiden van achtergrondgeluid.
   OPMERKING: FMO-controles moeten worden uitgevoerd tijdens de eerste paneeloptimalisatie om nauwkeurige en betrouwbare poortgrenzen te definiëren, vooral in weefsels met een hoge autofluorescentie, zoals de hersenen. Als het kleurpaneel, de instrumentinstellingen of de experimentele omstandigheden worden gewijzigd, moeten de FMO-regelaars worden herhaald. Voor volgende experimenten met dezelfde gevalideerde paneel- en cytometerinstellingen kunnen eerder gedefinieerde poortdrempels opnieuw worden gebruikt om consistentie tussen biologische replicaten te garanderen.

7. Isotype-besturingselementen voorbereiden en aanschaffen

1. Kleur het controlemonster met isotypecontrole-antilichamen die qua fluorochroom en concentratie overeenkomen met de testantilichamen.
2. Verkrijg gegevens met dezelfde cytometerinstellingen.
3. Gebruik isotypecontroles alleen om mogelijke niet-specifieke binding te beoordelen, vooral in het geval van intracellulaire markers of slecht gekarakteriseerde antilichamen. Gebruik geen isotype-regelaars voor gating, omdat deze niet dezelfde bindingskinetiek weerspiegelen als specifieke antilichamen.
   OPMERKING: Isotype-besturingselementen zijn niet geschikt voor gating en mogen niet worden gebruikt om populaties te definiëren. Het gebruik ervan is facultatief en moet worden gereserveerd voor het valideren van de antilichaamspecificiteit in geselecteerde gevallen.

8. Strategie voor flowcytometrie

1. Maak de volgende puntdiagrammen voor sequentiële poorten:
   FSC-A vs. SSC-A om vuil uit te sluiten
   FSC-A vs. FSC-H om singlets te selecteren.
   FSC-A vs. Amcyaan (levensvatbare kleurstof) om levende cellen te poorten.
2. Identificeer microglia als CD11b⁺CD45⁺ met behulp van CD11b (FITC) versus CD45 (AF700).
   OPMERKING: Vanwege het ontwikkelingsstadium (P3-P15), de inflammatoire context en de enzymatische spijsvertering waren TMEM119 en P2RY12 niet betrouwbaar voor het duidelijk scheiden van microglia van andere myeloïde populaties door middel van flowcytometrie. De CD11b⁺CD45⁺ gating-strategie, eerder gevalideerd in de postnatale hersenen, werd daarom gebruikt om microglia-populaties te identificeren en tegelijkertijd de besmetting te minimaliseren. In controleomstandigheden varieert de typische opbrengst van 30.000 tot 200.000 microgliacellen per hele hersenen van P3 tot P15. Voor experimenten die specifiek gericht zijn op het cerebellum, is de gemiddelde opbrengst ongeveer 5.000 microgliacellen per brein.
3. Gebruik FMO-besturingselementen om poortdrempels voor activeringsmarkeringen te definiëren.
4. Identificeer microglia-subpopulaties op basis van de expressie van immuungerelateerde markers:
   CD80⁺ (Super Helder 436)
   CD86⁺ (PE)
   iNOS⁺ (PE-eFluor 610)
5. Karakteriseer microglia-subsets verder door combinaties van markerexpressie:
   CD206⁺ (APC)^{dan Arg1+} (PE-Cy7)
   CD86⁺ (PE)^{vervolgens CD64+} (PerCP-eFluor 710)
   CD163⁺ (Super Bright 600) ^{en vervolgens CD206+} (APC)
   OPMERKING: Markercombinaties worden gebruikt om moleculaire heterogeniteit binnen de microgliale populatie te beschrijven. Deze subsets worden alleen gerapporteerd op basis van markerexpressie en krijgen geen specifieke functionele rollen toegewezen, in overeenstemming met de huidige normen die microgliale plasticiteit en contextafhankelijke fenotypes erkennen.
6. Laad experimenteel monster. Stel FSC in op 300 en SSC op 200. Gebruik een laag debiet en registreer het gewenste aantal gebeurtenissen.
7. Was na acquisitie de cytometer en exporteer gegevens als . FSC-bestanden voor analyse.
8. Analyseer de gegevens met behulp van flowcytometersoftware.

9. Monster van RNA-sequencing met één cel

1. Gebruik hetzelfde celisolatieprotocol dat is beschreven voor flowcytometrie (zie stap 1.14) om de gedissocieerde cellen opnieuw in FACS-buffer te suspenderen. Gebruik de FACS-buffer in verzamelbuizen en alle daaropvolgende verwerkingsstappen om de celstabiliteit te behouden.
2. Voer geen fluorescerend geactiveerde celsortering (FACS) uit als het doel is om alle celtypen uit een hersengebied vast te leggen. Als het experiment echter verrijking voor microglia vereist, neem dan een FACS-sorteerstap op voorafgaand aan de sequencing.
3. Beoordeel onmiddellijk de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van benchtop-stabiele, fluorescerende levensvatbaarheidskleurstoffen en Trypan Blue (zie Materiaaltabel). Tel de cellen onder een microscoop met behulp van een hemocytometer (zie Tabel met materialen).
4. Controleer of de celsuspensie een levensvatbaarheid van ten minste 90% vertoont en pas aan tot een eindconcentratie van ongeveer 1.000 cellen/μl voordat u doorgaat met eencellige RNA-sequencing.
5. Bewaar alle monsters op ijs en verwerk ze onmiddellijk na dissociatie om cellulaire stress en transcriptieveranderingen te minimaliseren.
6. Multiplex de monsters in paren volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: Een man en een vrouw uit dezelfde experimentele groep werden samengevoegd om de experimentele kosten te verlagen.
7. Bereid de scRNAseq-bibliotheken voor (zie materiaaltabel) en volg de aanbevolen richtlijnen van de fabrikant.
   OPMERKING: De voorbereiding van de bibliotheek werd uitgevoerd door het Genomics Platform van het Institute for Research in Immunology and Cancer (IRIC) van de Universiteit van Montreal.
8. Sequentie van de scRNA-seq-bibliotheken met behulp van een sequencingsysteem tot een gemiddelde diepte van 3200 miljoen lezingen per baan.
   OPMERKING: Sequencing werd uitgevoerd in Genome Quebec in Montreal.

10. Analyse van eencellige RNA-sequencing

1. Voer een analyse uit van het aantal unieke moleculaire identificatiemiddelen (UMI) met behulp van de Cell Ranger-software van 10X Genomics (v8.0.0) met het Mouse GRCm39 2024-A-referentiegenoom. Gebruik het Seurat R-pakket (v5.1) voor downstreamanalyse.
2. Voer kwaliteitscontrole uit door cellen uit te sluiten met mitochondriaal RNA dat bijvoorbeeld 30% van het totale RNA overschrijdt (Figuur 1A), of een strengere drempel die is gekozen om cellen met mogelijke stress te verwijderen. Filter cellen van lage kwaliteit uit met log10GenesPerUMI groter dan 0,75 (Figuur 1B), aantal unieke kenmerken ("nUMI") lager dan 500 en aantal gedetecteerde genen per cel ("nGene") groter dan 300 (Figuur 1C). Verwijder vervolgens druppels met het "scDblFinder"-pakket in R. Met een correlatiegrafiek van de nUMI en nGene die de drempels aangeeft, zou het filtereffect nu zichtbaar moeten zijn (Figuur 1D).
3. Verminder batcheffecten door 2.000 zeer variabele genen per monster te identificeren met behulp van de SelectIntegrationFeatures-functie van Seurat.
4. Integreer datasets met behulp van canonieke correlatieanalyse (CCA) en voer hoofdcomponentenanalyse (PCA) uit voor dimensionaliteitsreductie. Gebruik de RunPCA-functie met 50 hoofdcomponenten (pc's), schaal de gegevens en verwijder ongewenste bronnen van variatie (bijv. mitochondriale inhoud). Evalueer het aantal behouden pc's op basis van de elleboogplot en JackStraw-analyse.
5. Visualiseer clusters met behulp van het UMAP-algoritme (Uniform Manifold Approximation and Project) via de Seurat RunUMAP-functie . Identificeer clusterspecifieke genexpressieprofielen met de functie FindAllMarkers . Annoteer clusters op basis van transcriptionele handtekeningen door geïdentificeerde markergenen te vergelijken met gecureerde eencellige bronnen zoals PanglaoDB en CellMarker (Figuur 2). Celtypen, waaronder microglia, worden afgeleid uit deze transcriptomische profielen in plaats van uit een vooraf gedefinieerde oppervlaktemarker.

11. Celscheiding op basis van geslacht

1. Identificeer mannelijke en vrouwelijke cellen op basis van de expressie van geslachtsspecifieke genen: vier vrouwspecifieke (Xist, Tsix, Usp9x, Eif2s3x) en drie mannelijkespecifieke (Eif2s3y, Uty, Ddx3y).
2. Classificeer mannelijke en vrouwelijke populaties door cellen te filteren die genormaliseerde UMI-tellingen > 1 tot expressie brengen voor elk van deze genen met behulp van de subsetfunctie van Seurat.
3. Genereer Seurat-objecten door mannelijke en vrouwelijke cellen afzonderlijk te subsetten. Bewaar en analyseer deze objecten onafhankelijk van elkaar voor downstream-vergelijkingen.
4. Valideer classificatie door geslachtsspecifieke genexpressie te visualiseren met behulp van de FeaturePlot - en VlnPlot-functies , waardoor een duidelijke scheiding tussen mannelijke en vrouwelijke celpopulaties wordt gegarandeerd.
   OPMERKING: Stappen 12.1 en 12.2 mogen alleen worden uitgevoerd wanneer het monster is gemultiplext door een mannelijke en een vrouwelijke te mengen.

12. Statistische modelgebaseerde microglia-classificatie

1. Bouw vijf statistische modellen in R (random forest, logistische regressie, naïeve Bayes, support vector machine, beslissingsboom) met behulp van een trainingsset van ~1.000 cellen met bekende groepslabels.
2. Evalueer de modelprestaties met behulp van 10-voudige kruisvalidatie en ROC-curves (Operating Characteristics) van de ontvanger (Afbeelding 3). Identificeer sleutelgenen die bijdragen aan classificatie met behulp van de FindAllMarkers-functie in Seurat.
3. Selecteer het model met het hoogste gebied onder de ROC-curve (AUC). Het random forest-model werd geselecteerd op basis van de superieure AUC-score.
4. Pas het geselecteerde model toe op niet-geclassificeerde cellen met behulp van de voorspellingsfunctie van het RandomForest R-pakket. Voeg de voorspelde classificaties samen met eerder geannoteerde datasets in Seurat met behulp van samenvoegen.
5. Valideer classificaties door markergenexpressie te visualiseren met FeaturePlot en VlnPlot. Om de consistentie van voorspelde celidentiteiten te garanderen, evalueert u de verrijkingen van de markergenenset die overlapt voor en na het toevoegen van de geclassificeerde cellen met een geschikte statistische test (bijv. Fisher's exact-test).

13. Microglia differentiële genexpressie analyse

1. Voer differentiële genexpressie (DEG)-analyse uit tussen twee specifieke interessegroepen met behulp van de Seurat-functie "FindMarkers", waarbij ident.1 de interessegroep vertegenwoordigt en ident.2 de referentiegroep.
   OPMERKING: De uitvoer geeft een overzicht van genen die differentieel tot expressie komen in ident.1 ten opzichte van ident.2. In deze context zijn geupreguleerde genen die met een hogere expressie in ident.1 in vergelijking met ident.2, terwijl gedownreguleerde genen een lagere expressie vertonen in ident.1. Hun vergelijkingen worden gebruikt om vulkaandiagrammen te genereren en conditiespecifieke transcriptieverandering te interpreteren.
2. Identificeer differentieel tot expressie gebrachte genen (DEG's) met een aangepaste P-waarde≤ 0,05. Gebruik voor vergelijkingen tussen twee specifieke groepen de FindAllMarkers-functie met de volgende criteria: genen die tot expressie komen in ten minste 10% van de cellen (min.pct = 0,1) en een log2-vouwveranderingsdrempel van 0,25 (logfc.threshold=0,25). Gebruik voor vergelijkingen van meerdere groepen in alle microglia de functie FindAllMarkers met dezelfde parameters. Genen met een aangepaste P-waarde ≤ 0,05 worden beschouwd als significant differentieel tot expressie gebracht. Om DEG-expressiepatronen te visualiseren, genereert u een vulkaanplot met behulp van de ingebouwde functie in het EnhancedVolcano-pakket (Figuur 4).
3. Vergelijk de resultaten van de flowcytometrie door eerst de cytometriemarkers te onderzoeken die worden gebruikt om microglia te vinden, met name CD45⁺ en CD11b⁺, die overeenkomen met de genen PtprcenItgam. Bevestig genexpressie met behulp van de FeaturePlot-functies in Seurat.
4. Beoordeel de markers die gewoonlijk worden geassocieerd met verschillende microgliale toestanden, waaronder CD80enNOS2, evenals Mrc1, Arg1, Fcgr1 en CD163. Gebruik de Seurat-functies FeaturePlot en DotPlot om hun expressie in celclusters te visualiseren.
5. Genereer een puntdiagram met behulp van de DotPlot-functie in Seurat om markeringsexpressies samen te vatten en de populatieclassificatie te valideren.

Results

Dit protocol maakt effectief gebruik van flowcytometrie om microgliale celpopulaties in hersenmonsters van muizen te karakteriseren, op basis van de expressie van geselecteerde oppervlakte- en intracellulaire markers. In de volgende paragrafen worden de resultaten beschreven die zijn verkregen uit de belangrijkste stappen van de workflow, waarbij de verdeling en heterogeniteit van microglia-subsets worden benadrukt als reactie op experimentele omstandigheden.

Validatie van compensatie en poortstrategie
Compensatiekralen werden gebruikt om fluorescentiesignalen te kalibreren en te corrigeren voor spectrale overlap tussen fluorochromen. Positieve en negatieve populaties voor elk fluorochroom werden duidelijk gescheiden, waardoor een nauwkeurige compensatiematrix kon worden gegenereerd. Poortdrempels werden aanvankelijk gevalideerd met behulp van Fluorescence Minus One (FMO)-regeling tijdens paneeloptimalisatie om het echte signaal van de achtergrond te onderscheiden, met name voor slechte of overlappende markeringen. Deze drempels werden vervolgens hergebruikt in experimenten met dezelfde kleuringspaneel en cytometerinstellingen om consistentie te garanderen. Isotypecontroles werden opgenomen om mogelijke niet-specifieke binding te monitoren, met name voor intracellulaire markers, maar werden niet gebruikt voor poortbeslissingen.

Identificatie van microgliale cellen
De levende/dode (Amcyaan) celpoortstrategie sloot met succes dode cellen uit. De gating-strategie isoleerde effectief microgliale celpopulaties op basis van CD45 (AF700) en CD11b (FITC) expressie. De parameters forward scatter (FSC) en side scatter (SSC) werden geoptimaliseerd (FSC = 300, SSC = 200) om de microgliapopulatie binnen de dot plot te centreren (Figuur 5).

Fenotypering van microgliale cellen
Dot-plot-analyse maakte de identificatie van microglia-subpopulaties mogelijk op basis van differentiële expressie van oppervlakte- en intracellulaire markers. Met behulp van specifieke poortstrategieën in de FlowJo-software werd een subset van microgliacellen geïdentificeerd die CD80 (Super Bright 436), CD86 (PE) en iNOS (PE-eFluor 610) tot expressie brengen (Figuur 6A). Dubbele gating werd ook gebruikt om subsets te definiëren die CD206 (APC) en Arg1 (PE-Cy7) tot expressie brengen (zie figuur 6B). Aanvullende populaties werden gekenmerkt door co-expressie van CD86 (PE) en CD64 (PerCP-eFluor 710), evenals CD163 (Super Bright 600) en CD206 (APC) (Figuur 6C,D). Deze fenotypische profielen weerspiegelen door markers gedefinieerde heterogeniteit binnen de microglia-populatie en tonen het vermogen van dit protocol aan om meerdere transcriptioneel en immunologisch verschillende subsets te onderscheiden zonder vaste functionele toestanden af te leiden.

Microglia analyse van één cel
Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) werd gebruikt om cellulaire heterogeniteit te visualiseren en de microgliale celclusters tussen andere hersenceltypen te identificeren. Elke stip vertegenwoordigt een enkele cel en het cluster heeft een kleurcode op basis van transcriptionele gelijkenis (Figuur 2).

Differentiële expressieanalyse werd uitgevoerd binnen de microgliacluster om genen te identificeren die onder experimentele omstandigheden zijn gemoduleerd. Genen met een aangepaste P-waarde ≤ 0,05 werden als differentieel tot expressie gebracht.

Er werd een vulkaandiagram gegenereerd om deze differentieel tot expressie gebrachte genen van microgliacellen te visualiseren, waarbij de genen met zowel een hoge vouwverandering als statistische significantie werden benadrukt (Figuur 4).

Om deze afzonderlijke cellen te vergelijken met flowcytometriegegevens, werd de expressie van microglia-markers CD45 en CD11b (Ptprc en Itgam) onderzocht. Een UMAP toont hun expressie binnen verschillende celpopulaties (Figuur 7).

Ten slotte werd de expressie van geselecteerde immuungerelateerde markers beoordeeld om de transcriptionele heterogeniteit tussen microgliale cellen te karakteriseren. Een Violin-plot toont de expressie van genen zoals CD80 en NOS-, evenals Mrc1, Arg1, Fcgr1 en CD163 op het niveau van één cel (Figuur 8). Deze markerexpressiepatronen maken vergelijking mogelijk met op flowcytometrie gebaseerde profilering en benadrukken de moleculaire diversiteit van microgliale subsets onder experimentele omstandigheden.

Figuur 1: Kwaliteitscontrole van single-cell transcriptomische gegevens. (A) Verdeling van mitochondriale RNA-inhoud over cellen. Cellen met >30% mitochondriaal RNA werden uitgesloten om mogelijk gestreste of stervende cellen te verwijderen. (B) Cellen met een log10GenesPerUMI > 0,75 werden uitgefilterd om een consistente gen-tot-UMI-verhouding te garanderen en ruis uit bibliotheken met een lage complexiteit te verminderen. (C) Cellen met minder dan 500 gedetecteerde transcripten (nUMI) of meer dan 300 gedetecteerde genen (nGENE) werden ook uitgesloten om cellen van slechte kwaliteit of meerdere cellen te elimineren. (D) Correlatiegrafiek van NUMI versus nGene die de impact van filterdrempels illustreert. Gedetecteerde doubletten werden verwijderd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: UMAP-visualisatie van single-cell transcriptomen. UMAP-plot die de verdeling van afzonderlijke cellen toont op basis van transcriptomische profielen verkregen van twee individuele dieren. Elke stip vertegenwoordigt één cel, kleurgecodeerd op clusteridentiteit. De microgliale celcluster wordt geïdentificeerd tussen andere celpopulaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: ROC-curve van Random Forest-classificatie geëvalueerd door kruisvalidatie. Receiver Operating Characteristic (ROC)-curve die de prestaties illustreert van het Random Forest-model dat wordt gebruikt om microglia te onderscheiden van andere hersenceltypen op basis van genexpressieprofielen. Het model werd getraind op een set van ~1000 cellen met bekende labels en geëvalueerd met behulp van 10-voudige kruisvalidatie. Van de vijf geteste statistische modellen (Random Forest, logistische regressie, naïeve Bayes, support vector machine en beslissingsboom) behaalde het Random Forest-model de hoogste classificatieprestaties. Het gebied onder de curve (AUC) geeft de nauwkeurigheid van het model weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Differentiële genexpressieanalyse in microgliale cellen. Vulkaangrafiek die de log2-vouwverandering weergeeft versus de aangepaste P-waarde voor genen die differentieel tot expressie worden gebracht in microglia tussen de twee experimentele groepen (controle versus cerebellair hersenletsel). Opgereguleerd gen komt sterker tot expressie in de interessegroep (ident.1), en gedownreguleerde genen vertonen verminderde expressie in vergelijking met de referentiegroep (ident.2). Belangrijke significant differentieel tot expressie gebrachte genen worden gelabeld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Poortstrategie voor microglia-identificatie door middel van flowcytometrie. (A) Poortstrategie toegepast op cerebellaire cellen van een controlemuis na dag 3 (P3). (B) Singlets werden geselecteerd om doubletten uit te sluiten. (C) Levensvatbare cellen werden geïdentificeerd met behulp van een levensvatbare kleurstof; gebeurtenissen met een lage FSC-A werden uitgesloten om puin te verwijderen en analyse van intacte cellen te garanderen. (D) Microglia werden geïdentificeerd als CD45⁺ en CD11b⁺ met twee verschillende populaties: CD45 laag-CD11b^int voor rustende microglia en CD45^int -CD11b^hoog voor geactiveerde microglia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Karakterisering van expressieprofielen van microglia-markers door middel van flowcytometrie. (A) Sequentiële gating van CD45⁺ CD11b⁺ cellen op basis van CD80-, CD86- en iNOS-expressie. (B) Identificatie van een subset die CD206 tot expressie brengt, gevolgd door gating op basis van Arg1-expressie. (C) Identificatie van een subset die CD86 tot expressie brengt, gevolgd door gating op basis van CD64-expressie. (D) Identificatie van een subset die CD163 tot expressie brengt, gevolgd door gating op basis van CD206-expressie. Deze poortstrategieën illustreren de fenotypische heterogeniteit van microglia-populaties op basis van oppervlakte- en intracellulaire markerexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Bevestiging van de identiteit van microglia met behulp van Itgam - en Ptprc-expressie in eencellige RNA-sequencinggegevens. UMAP toont het transcriptielandschap van cerebellaire cellen op P15, met genexpressie van Itgam en Ptprc over clusters heen. Co-expressie van deze canonieke myeloïde markers ondersteunt de identificatie van microglia-populaties en sluit aan bij markers die worden gebruikt in flowcytometrie, waardoor kruisvalidatie wordt geboden tussen transcriptomische en eiwitniveau-analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Expressieprofielen van geselecteerde immuungerelateerde genen in microgliacellen geïdentificeerd door single-cell RNA sequencing. Vioolgrafieken tonen de verdeling van genexpressie voor CD80, NOS2, Mrc1, Arg1, Fcgr1 en CD163 over individuele microgliale cellen. Deze markers worden vaak geassocieerd met immuungerelateerde processen en illustreren de transcriptionele heterogeniteit die wordt waargenomen binnen de microgliale populatie. Er worden gegevens getoond voor zowel controle- als cerebellaire hersenletsel (CBI) aandoeningen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van oplossingen die worden gebruikt voor isolatie en kleuring van neurale cellen. Deze tabel geeft een gedetailleerde samenstelling van de oplossingen die nodig zijn voor celisolatie en kleuring, inclusief hun respectieve concentraties en componenten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Concentraties van antilichaammengsels voor extracellulaire kleuring. Deze tabel geeft een overzicht van de concentraties van antilichamen en levend/dood oplossing die worden gebruikt voor extracellulaire kleuring, met vermelding van de vereiste volumes en verdunningen voor elk antilichaam in het kleuringsmengsel voor één monster. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Concentraties van antilichaammengsels voor intracellulaire kleuring. Deze tabel geeft een overzicht van de concentraties van antilichamen die worden gebruikt voor intracellulaire kleuring, met vermelding van de vereiste volumes en verdunningen voor elk antilichaam in het kleuringsmengsel voor één monster. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussion

Deze studie presenteert een gedetailleerd en geoptimaliseerd protocol dat flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq) combineert voor de isolatie en karakterisering van microgliacellen tijdens de vroege postnatale hersenontwikkeling. Hoewel flowcytometrie een kosteneffectieve en toegankelijke techniek blijft, biedt de integratie ervan met single-cell transcriptomics aanvullende inzichten door markerexpressie op eiwitniveau te koppelen aan transcriptieprofielen op genniveau. Het protocol behandelt de technische uitdagingen die specifiek zijn voor onrijp hersenweefsel, waaronder efficiënte dissociatie, verwijdering van puin en myeline, en geoptimaliseerde immunokleuringsstrategieën, om reproduceerbaarheid en betrouwbaarheid te garanderen bij de analyse van microgliale populaties op belangrijke ontwikkelingstijdstippen.

Flowcytometrie werd gebruikt om microgliale subsets te identificeren op basis van de expressie van geselecteerde oppervlakte- en intracellulaire markers. In plaats van functionele toestanden af te leiden, werden subsets onderscheiden door hun markerexpressieprofielen, zoals CD80⁺/CD86⁺/iNOS⁺ ; CD206⁺/arg1⁺ ; CD86⁺/CD64⁺ of CD163⁺/CD206⁺ fenotypes. Deze door markers gedefinieerde populaties weerspiegelen de moleculaire heterogeniteit binnen het microgliacompartiment en bieden een praktische benadering voor karakterisering met hoge doorvoer. Hoewel deze op oppervlaktemarkeringen gebaseerde classificaties mogelijk niet de volledige complexiteit van de diversiteit van microglia weergeven, blijven ze informatief, vooral in contexten waar hoogdimensionale moleculaire hulpmiddelen mogelijk niet beschikbaar zijn. Binaire classificaties zoals het M1/M2-paradigma zijn bewust vermeden, als erkenning van de spectrumachtige, contextafhankelijke aard van microgliale fenotypes, zoals beschreven in recente literatuur¹².

Deze waarnemingen komen overeen met eerdere studies die de rol van microglia benadrukken bij zowel de normale rijping van de hersenen als als reactie op omgevings- of pathologische stimuli^13,14. Het vermogen om microglia-heterogeniteit te differentiëren biedt waardevolle inzichten in hoe polarisatie van microgliale cellen kan bijdragen aan neurologische ontwikkelingsstoornissen^15,16.

Hoewel single-cell RNA-sequencing een hogere resolutie biedt en de identificatie van transcriptioneel verschillende subpopulaties van microgliale cellen mogelijk maakt, beperken de kosten en analytische complexiteit de toegankelijkheid ervan. In de huidige dataset die op postnatale dag 15 na perinataal letsel is verzameld, is de piek van de ontstekingsreactie grotendeels opgelost, wat resulteert in een laag aantal geactiveerde microglia. Bijgevolg hebben dimensionaliteitsreductietechnieken zoals UMAP geen goed gescheiden microgliale subclusters teruggevonden en is transcriptieanalyse op clusterniveau niet opgenomen in dit protocolmanuscript.

Een belangrijke innovatie van dit protocol is de optimalisatie voor het isoleren en karakteriseren van microgliacellen uit het cerebellum tijdens vroege postnatale stadia (P3 tot P30). Deze regio en leeftijdsspecifieke context brengen verschillende uitdagingen met zich mee, waaronder een lage celopbrengst, myelinegehalte en verhoogde weefselkwetsbaarheid. Om deze beperkingen aan te pakken, integreert het protocol een aangepaste dissociatieworkflow, efficiënte verwijdering van puin en myeline, en zorgvuldig afgestemde immunokleuringsomstandigheden die geschikt zijn voor cerebellair weefsel met een klein volume. Ondanks de toenemende erkenning van cerebellaire microglia als functioneel en transcriptioneel verschillend van die in andere hersengebieden, blijven gedetailleerde protocollen voor hun isolatie en analyse beperkt. De huidige methode biedt een betrouwbare en toegankelijke workflow, met name op maat gemaakt voor ontwikkelingsstudies van cerebellaire microglia.

Het belangrijkste doel van dit manuscript is om een reproduceerbaar en aanpasbaar methodologisch kader te bieden in plaats van om specifieke biologische ontdekkingen te rapporteren. De workflow is geschikt voor aanpassing aan andere ontwikkelingsstadia of experimentele modellen waarin transcriptioneel verschillende microgliale toestanden prominenter kunnen zijn. In dergelijke contexten blijft flowcytometrie een waardevol hulpmiddel, vooral wanneer het wordt geïntegreerd met complementaire testen.

Een van de belangrijkste sterke punten van dit protocol is het aanpassingsvermogen in verschillende ontwikkelingsstadia, variërend van postnatale dag 3 (P3) tot postnatale dag 30 (P30). Dit maakt longitudinale analyse van het fenotype van microglia mogelijk naarmate de rijping van de hersenen vordert. Het gecombineerde gebruik van flowcytometrie en scRNA-seq maakt het mogelijk om niet alleen oppervlaktemarkers te bestuderen, maar ook intracellulaire signaalroutes en transcriptiefactoren die betrokken zijn bij microgliacellen.

Desalniettemin kan enzymatische vertering de expressie van sommige oppervlaktemarkers beïnvloeden, waardoor een zorgvuldige optimalisatie van de spijsverteringsomstandigheden voor specifieke experimentele doelen nodig is^17,18. Bovendien levert noch flowcytometrie noch single-cell sequencing gegevens op populatieniveau, die mogelijk niet volledig de ruimtelijke en functionele nuances van microgliale celinteracties in hun oorspronkelijke omgeving vastleggen. Het integreren van ruimtelijke technieken met één cel kan helpen deze beperking aan te pakken door de ruimtelijke context van microgliale cellen te behouden. Toekomstige studies die dit protocol combineren met beeldvormingstechnieken, zoals immunohistochemie, in vivo beeldvorming, western blot of single-cell spatial transcriptomics, zouden aanvullende inzichten kunnen bieden in de dynamiek van microgliale cellen.

Deze methode opent nieuwe wegen om te onderzoeken hoe beledigingen in het vroege leven, zoals ontsteking, hypoxie of omgevingsstressoren, de fenotypes van microgliale cellen beïnvloeden en bijdragen aan neurologische ontwikkelingsresultaten op de lange termijn. Door een nauwkeurige en betrouwbare karakterisering van de activeringstoestanden van microgliale cellen mogelijk te maken, vergemakkelijkt het de identificatie van therapeutische doelen om microgliale reacties in het vroege leven te moduleren, met als doel neurologische ontwikkelingsstoornissen te voorkomen of te verminderen.

Concluderend biedt dit protocol een robuust en toegankelijk kader voor het bestuderen van de diversiteit van microgliale cellen tijdens de vroege ontwikkeling van de hersenen. De combinatie van flowcytometrie en eencellige RNA-sequencing maakt een flexibele toepassing mogelijk in verschillende ontwikkelingsstadia en experimentele modellen, waardoor een diepere verkenning van de biologie van microglia's in zowel fysiologische als pathologische contexten mogelijk wordt.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 µm metal mesh filter	Sigma-Aldrich	S3895
15 mL tube	Sarstedt	62.554.205
5 mL tube	Sarstedt	55.526.006
96 well plate with conical bottom	Sarstedt	82.1583.001
Arginase 1 - Conjugate Pecy7 - Clone : A1exF5	Thermo Fisher Scientific	25-3697-82
Benchtop-stable fluorescent reagents	Invitrogen	A49905
CD11b - Conjugate Fitc - Clone : M1/70	BD Pharmingen	553310
CD163 - Conjugate SB600 - Clone : TNKUPJ	Thermo Fisher Scientific	63-1631-82
CD206 - Conjugate APC - Clone : C068C2	BioLegend	141708
CD45 - Conjugate A700 - Clone : 30-F11	BD Pharmingen	560510
CD64 - Conjugate  PerCP-eF710 - Clone : X54-5/7.1	Thermo Fisher Scientific	46-0641-82
CD80 - Conjugate SB436 - Clone : 16-10A1	Thermo Fisher Scientific	62-0801-82
CD86 - Conjugate Pe - Clone : GL-1	BioLegend	105008
Collagenase D	Sigma–Aldrich	11088866001
DNase I	Sigma–Aldrich	10104159001
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma–Aldrich	F1051
HBSS (Hank's balanced salt solution) 10x	Wisent Bioproducts	311506CL
Hemocytometer	vwr international	82030-470
HEPES	Wisent Bioproducts	330.050.EL
iNOS - Conjugate PE- eF610 - Clone : CXNFT	Thermo Fisher Scientific	61-5920-82
KCl	Thermo Fisher Scientific	BP366-500
KH2PO4	Thermo Fisher Scientific	BP362-500
Live/Dead Amcyan	Thermo Fisher Scientific	L34957
Microglial cell culture media	Life Technologies	A12475-01
Na2HPO4	Thermo Fisher Scientific	BP332-500
NaCl	Thermo Fisher Scientific	BP358-212
Paraformaldehyde	Sigma–Aldrich	P6148
Rat anti mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142
Saponin	Sigma–Aldrich	S7900
scRNAseq libraries	10X Genomics	1000121
Silica-based colloidal medium	Thermo Fisher Scientific	45001747
Sodium azide	Thermo Fisher Scientific	BP922I-500
Trypan Blue	Gibco	1525006