Meting van cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP) in vaste weefsels met behulp van Competitive Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Samenvatting

Dit protocol meet cyclische guanosinemonofosfaat (cGMP)-concentraties in vaste weefsels met behulp van competitieve enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA). Het protocol beschrijft hoe vast weefsel moet worden verwerkt, competitieve ELISA moet worden uitgevoerd, extincties moeten worden omgezet in cGMP-concentraties in picomol per milliliter en de uiteindelijke concentraties moeten worden berekend als nanomol cGMP per gram weefsel.

Samenvatting

Een belangrijke route die cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP) produceert, is de stikstofmonoxide (NO)-cGMP-route. In deze route stimuleert NO de katalytische activiteit van oplosbaar guanylylcyclase (sGC), dat guanosinetrifosfaat omzet in cGMP. NO is van belang omdat het bij zoogdieren werkt als de belangrijkste vaatverwijder, een remmer van de aggregatie van bloedplaatjes, een bemiddelaar van de immuunfunctie, een neurotransmitter en om het uithoudingsvermogen tijdens fysieke activiteit te verbeteren, naast andere fysiologische rollen. Het meten van de overvloed van NO in verschillende weefsels kan helpen de functies ervan op te helderen. NO kan echter niet direct worden gemeten vanwege de halfwaardetijd van minder dan seconden. Doorgaans worden de metabolieten van NO, nitraat en nitriet, gemeten om de overvloed van NO te schatten. Dit komt omdat deze moleculen in vivo kunnen worden omgezet door middel van redoxreacties. Een minder gebruikelijke methode om de abundantie van NO te schatten, vereist het meten van de concentratie van cGMP, een signaalmolecuul stroomafwaarts van NO. Toch wordt het meten van cGMP in weefsels zelden gedaan, ondanks het feit dat het de mogelijkheid biedt om de functies van NO in organen beter te begrijpen. Daarom bestaat er behoefte aan een protocol om cGMP-concentraties in vaste organen en weefsels te meten. In dit protocol werden verzamelde varkensweefsels gehomogeniseerd, werd competitieve ELISA uitgevoerd op bewerkte monsters en werden extincties omgezet in nanomol cGMP per gram origineel weefsel. Kortom, dit protocol schetst een simplistische methode om cGMP-concentraties in vaste weefsels te meten met behulp van de cyclische GMP ELISA-kit.

Inleiding

Cyclisch guanosinemonofosfaat (cGMP) is een signaalmolecuul dat in staat is fysiologische veranderingen te induceren via de stikstofmonoxide (NO)-cGMP-route. In de NO-cGMP-route bindt NO zich aan oplosbaar guanylylcyclase, een cytosolisch enzym dat guanosinetrifosfaat omzet in cGMP, waardoor de katalytische activiteit met ^1,2 toeneemt. De daaropvolgende toename van de cGMP-concentraties activeert signaalroutes die vasodilatatie bevorderen³, wat leidt tot een verlaging van de bloeddruk ^4,5, de belangrijkste fysiologische respons die kenmerkend is voor de aanwezigheid van NO in vivo. Bovendien is bekend dat NO de immuunfunctie beïnvloedt⁶, het uithoudingsvermogen tijdens fysieke activiteit verbetert⁴ en bloedstolling voorkomt door de aggregatie van bloedplaatjes te remmen⁷.

Het direct meten van NO wordt bemoeilijkt door de minder dan seconden lange halfwaardetijd in vivo⁸ in de meeste biologische weefsels. Bijgevolg vereist het ophelderen van de fysiologische effecten van NO een methode om de overvloed ervan ex vivo te meten. Daarom vermijden bruikbare kwantitatieve methoden de directe meting van NO. Een veelgebruikte methode om NO-concentraties in weefsels te schatten, is het meten van de stabielere metabolieten van NO: nitriet en nitraat 4,5,9,10,11. De belangrijkste complicatie van het gebruik van nitriet- en nitraatconcentraties als maatstaven voor de overvloed van NO is dat beide metabolieten ook dienen als respectievelijk een NO-precursor en een opslagmolecuul. De metabolieten van NO, vooral nitraat, zijn overvloedig aanwezig in bepaalde voedingsmiddelen. Daarom zijn veranderingen in cGMP-concentraties, aangezien cGMP stroomafwaarts van NO is, nuttig voor het schatten van de hoeveelheden actief NO, en de abundantie van NO kan worden bepaald zonder de interferentie van eerder aanwezig nitriet en nitraat.

Eerder onderzoek was gebaseerd op het meten van cGMP-concentraties in plasma¹² en bloedplaatjes¹³, maar minder vaak gezien is de meting van cGMP-concentraties in vaste weefsels. Het vermogen om cGMP-concentraties in vaste weefsels te meten, zou de karakterisering van de activiteit van NO in specifieke organen mogelijk maken. Het doel was om een simplistische methode te identificeren voor het meten van cGMP in vaste weefsels met behulp van concurrerende ELISA. Een voordeel van het gebruik van concurrerende ELISA is dat er apparatuur voor nodig is die vaak te vinden is in de meeste laboratoria die geïnteresseerd zijn in NO, zoals een microplaatlezer die vaak voor andere doeleinden wordt gebruikt. Ter vergelijking: sommige andere meetmethoden vereisen apparatuur die niet vaak wordt gebruikt tijdens experimenten gericht op NO, zoals microscopen^14,15, een scintillatieteller¹⁶ of een laser¹⁷. Naast de toegankelijkheid is het meten van cGMP met concurrerende ELISA gevoelig; cGMP-concentraties kunnen worden gedetecteerd tot 0,1 picomol (pmol) cGMP/ml¹⁸. Met kleine aanpassingen aan het cGMP ELISA-kit (Table of Materials) protocol¹⁸ werd een methode ontwikkeld voor het meten van cGMP in vaste weefsels met behulp van competitieve ELISA.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het Molecular Medicine Branch Animal Study-protocol dat is goedgekeurd door de NIDDK Animal Care and Use Committee (ASP K049-MMB-23). Weefselafname volgde de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee van MedStar Health Research Institute (protocolnummer: 2006001373 2020-017). Jongvolwassen Yorkshire-kruisvarkens (twee mannetjes en twee vrouwtjes), 3 maanden oud en met een gewicht tussen 30-35 kg, werden in het onderzoek gebruikt. Figuur 1 illustreert een schema met de stappen van het cGMP ELISA-kitprotocol. De reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

Figuur 1: Schema van het protocol. Een schema dat de stappen van het cGMP ELISA-kitprotocol illustreert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding van weefselmonsters

OPMERKING: Weefsels werden vóór verzameling geperfundeerd met een heparine-natriumoplossing en vervolgens vóór gebruik bewaard bij -80 °C. Zie Park et ^al.19 voor details over het verzamelen van de weefselmonsters.

1. Verwerking van weefselmonsters
   1. Koel een weefselvergruizer, pincet en lepel 10 minuten op droogijs voordat u met de procedure begint.
   2. Weeg een teveel aan weefsel af, aangezien er tijdens het verpulveren wat verloren kan gaan (opbrengst ongeveer 90%).
      OPMERKING: Voorheen leverde een overmaat van 170 mg succesvolle resultaten op. De massa kan desgewenst worden vergroot of verkleind. Zorg ervoor dat de weefselmassa resulteert in een voldoende monstervolume voor de acetylering van het weefselmonster en de verdunningsstappen van het weefselmonster.
   3. Voeg de tissue toe aan de vergruizer op droogijs.
   4. Vries het weefsel snel in met vloeibare stikstof en laat de vloeibare stikstof volledig verdampen.
   5. Plaats het deksel van de vergruizer terug en sla er 15 keer op met een hamer.
      OPMERKING: Als de opstelling van de vergruizer niet beschikbaar is of niet kan worden gebruikt, moet het monster met een schaar of een scalpel in zo klein mogelijke stukjes worden gesneden terwijl het ingevroren of op zijn minst gekoeld op ijs wordt bewaard. Deze stap zorgt voor een goede homogenisatie en is cruciaal, vooral voor hardere weefsels.
   6. Tarra een homogenisatorbuis en breng het verpulverde weefsel over naar de buis met behulp van de gekoelde lepel en het pincet.
   7. Noteer de massa van het weefsel dat aan de rupshomogenisatorbuis is toegevoegd om later de concentraties van molariteit om te zetten in mol per massa. Bewaar het monster op ijs.
   8. Voeg aan de homogenisatiebuis een volume in microliters van 0,1 N zoutzuur toe, gelijk aan een veelvoud van de weefselmassa in milligrammen.
      OPMERKING: Geschikte verdunningen zorgen ervoor dat gemeten monsters op de standaardcurve vallen. Deze verdunningen worden gevonden voor verschillende weefseltypes door middel van vallen en opstaan. In eerdere experimenten leverde een verdunningsverhouding van 1:10 voor skeletspierweefsel en een verdunningsverhouding van 1:5 voor leverweefsel succesvolle resultaten op. Ter referentie: bij het verdunnen van 100 mg weefsel zou voor een verdunningsverhouding van 1:10 1.000 μl 0,1 N zoutzuur nodig zijn en voor een verdunningsverhouding van 1:5 zou 500 μl nodig zijn.
   9. Homogeniseer de weefselmonsters met behulp van een homogenisator van een kralenmolen of een vergelijkbare techniek.
      OPMERKING: Koel het monster af en toe af tijdens het homogeniseren met ijs. Als er geen homogenisator voor kralenmolen beschikbaar is, kunnen andere homogenisatiemethoden worden vervangen die cellen effectief verstoren en weefselhomogenaat creëren, waaronder het gebruik van een roterende homogenisator of een ultrasone homogenisator.
   10. Centrifugeer homogenieten gedurende 30 minuten bij een snelheid van 17.000 x g met behoud van een monstertemperatuur van 4 °C.
       OPMERKING: Onvoldoende verdunde homogenaten van skeletspierweefsel worden te stroperig en gelachtig. Dit is het beste te zien na centrifugeren.
   11. Breng het bovenstaande over in een microcentrifugebuisje en centrifugeer het supernatans gedurende 10 minuten bij 17.000 x g met behoud van een temperatuur van 4 °C.
   12. Breng een hoeveelheid supernatans over in een microcentrifugebuis en bewaar het monster op ijs.
       OPMERKING: Acetylering van 250 μL supernatans leverde succesvolle resultaten op. Om het protocol te pauzeren, vriest u deze monsters in bij -80 °C en bewaart u ze maximaal 48 uur. Het wordt aanbevolen om het volume van het bovenstaande voor het acetyleringsproces op de dag van acetylering te meten.

2. Standaard bereiding

OPMERKING: Bereid normen voor op de dag van de ELISA-microplaatvoorbereiding.

1. Voorbereiding van de ELISA-buffer
   1. Voeg ontdooid 10x ELISA-bufferconcentraat toe aan een glazen fles met 90 ml ultrapuur water.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de resterende 10x ELISA-bufferconcentraat afspoelt met de voorbereide ELISA-buffer en doe de buffer terug in de glazen fles. Bewaren bij 4 °C gedurende maximaal 2 maanden.
2. Standaard voorraadvoorbereiding
   1. Voeg 1 ml ELISA-buffer toe aan de standaardinjectieflacon en schud om op te lossen.
      LET OP: Bewaren bij 4 °C tot 6 weken.
3. Standaard seriële verdunning
   1. Label een buis standaard B en negen buizen standaard 0 tot en met standaard 8.
   2. Voeg 9,9 ml ELISA-buffer toe aan de buis met het label standaard B.
   3. Breng 100 μL van de standaard voorraad (300 pmol/ml cGMP) over in de standaard B-buis en draai grondig.
   4. Breng 1.000 μL van de oplossing in de standaard B-buis over in de standaard 1-buis.
   5. Voeg 500 μL ELISA-buffer toe aan de buis met het label standaard 0 en de buizen met het label standaard 2 met standaard 8.
   6. Vortex standaard 1 en breng vervolgens 500 μL oplossing over van standaard 1 naar standaard 2.
   7. Vortex standaard 2 en breng vervolgens 500 μL oplossing over van standaard 2 naar standaard 3.
   8. Ga door met het overbrengen van 500 μL van standaard n-1 naar standaard n, en zorg ervoor dat u de standaarden na elke toevoeging grondig vortext.
   9. Gooi 500 μL oplossing uit standaard 8 weg.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de vortex-standaarden gebruikt waar gespecificeerd voor een optimale standaardcurve. Standaarden 0 tot 8 hebben een volume van 500 μL. Bewaar de standaarden tot gebruik bij 4 °C. Gebruik de normen op de dag van hun verdunning.

3. Acetylering

OPMERKING: Tijdens de acetyleringsreactie wordt een acetylgroep toegevoegd aan de 2'-hydroxylgroep van het cGMP-molecuul, wat de structuur van cGMP wijzigt en leidt tot een toename van de bindingsaffiniteit van de antilichamen, waardoor de testgevoeligheid ~10-voudig wordt verbeterd. In monsters die meer dan 1,0 pmol/ml cGMP bevatten, kunnen metingen worden uitgevoerd zonder acetylering en kan deze stap worden overgeslagen. De noodzaak van acetylering moet experimenteel worden vastgesteld, van geval tot geval.

1. Preparaat van kaliumhydroxide
   1. Voeg 10 ml ultrapuur water toe aan de kaliumhydroxidefles om een oplossing van 4 M te maken.
      OPMERKING: Sluit de fles niet af omdat de kaliumhydroxide oplost. Maandenlang bewaren bij kamertemperatuur.
2. Acetylering van weefselmonsters
   1. Voeg aan een hoeveelheid van 250 μl van het monster 50 μl (5:1) 4 M kaliumhydroxide toe en volg de toevoeging snel met 12,5 μl (20:1) azijnzuuranhydride.
   2. Vortex voor 15 s.
   3. Voeg 12,5 μL 4 M kaliumhydroxide toe aan het monster en draai kort.
   4. Optioneel: Als skeletspiermonsters stollen na de acetyleringsstappen, centrifugeer de monsters dan gedurende 10 minuten op 17.000 x g .
3. Acetylering van standaarden
   1. Voeg aan de buis met het label standaard 0 100 μL 4 M kaliumhydroxide toe, onmiddellijk gevolgd door 25 μL azijnzuuranhydride.
   2. Vortex de standaard voor 15 s.
   3. Voeg 25 μL 4 M kaliumhydroxide toe aan de standaard en vortex kort.
   4. Herhaal deze stappen voor de overige genummerde standaarden.
      OPMERKING: Vortex alle monsters en standaarden voor dezelfde duur om consistente resultaten te garanderen.

4. Verdunning van weefselmonsters

1. Voeg vooraf bepaalde verhoudingen ELISA-buffer en een hoeveelheid geacetyleerd monster toe aan een microcentrifugebuis.
   OPMERKING: Voor elk monster zijn twee verschillende verdunningen vereist. Verdunningsverhoudingen die ervoor zorgen dat de gemeten cGMP-concentraties op de standaardcurve vallen, worden met vallen en opstaan gevonden. Verdunningen moeten experimenteel worden bepaald voor elk type weefsel om ervoor te zorgen dat het percentage tussen 20% en 80% ligt. In eerdere experimenten met het meten van leverweefsel leverden verdunningsverhoudingen van 1:2 en 1:3 succesvolle resultaten op met de juiste percentagewaarden . Deze verhoudingen hebben ook succesvolle resultaten opgeleverd voor skeletspieren. Variaties in het skeletspierweefsel kunnen echter meer verdunde monsters vereisen.
2. Optioneel: Als er een neerslag ontstaat wanneer het weefselmonster aan de ELISA-buffer wordt toegevoegd, centrifugeer het monster dan gedurende 10 minuten op 17.000 x g.

5. ELISA-bereiding van microplaten

1. Acetylcholinesterase (AChE) tracer preparaat
   1. Voeg 6 ml ELISA-buffer toe aan de AChE-tracerflacon en schud voorzichtig om op te lossen.
      OPMERKING: Bewaar het monster maximaal 2 weken bij 4 °C. Niet draaikolken.
2. Antiserum preparaat
   1. Voeg 6 ml ELISA-buffer toe aan de injectieflacon met antiserum en schud voorzichtig om op te lossen.
      LET OP: Minimaal 4 weken bewaren bij 4 °C. Niet draaikolken.
3. Steekproef en standaard incubatie
   1. Vortex standaard 0.
   2. Voeg aan de ELISA-microtiterplaat 50 μL aliquots van standaard 0 tot 5 putjes toe (NSB en B₀; Figuur 2).
   3. Naar twee van de putten (NSB; Figuur 2) voeg bij standaard 0 50 μL ELISA-buffer toe.
   4. Gebruik één pipetpunt om 50 μL aliquots van standaarden 1 tot en met 8 in tweevoud aan de ELISA-microplaat toe te voegen. Begin met de meest verdunde standaard (standaard 8) en ga dan verder met de volgende meest verdunde totdat alle standaarden zijn toegevoegd.
      NOTITIE: Zuig elke standaard op en doseer deze meerdere keren voordat u deze in een putje doet. Vortex-standaarden voordat ze aan putten worden toegevoegd.
   5. Vortex elk monster voordat u 50 μL aliquots in duplicaat of drievoud aan de putjes toevoegt.
   6. Voeg 50 μL AChE-tracer toe aan elke NSB, B₀, standaard en bemonsteringsput (Figuur 2).
   7. Voeg 50 μL antiserum toe aan elke B₀, standaard, en monster goed (Figuur 2).
   8. Dek de ELISA-microtiterplaat af en incubeer gedurende 18 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u een vortex uitvoert wanneer u wordt geïnstrueerd om consistente resultaten te produceren.
4. Voorbereiding wasbuffer
   1. Voeg aan een glazen fles 200 ml ultrapuur water en 500 μL 400x wasbufferconcentraat toe.
   2. Voeg met behulp van een spuit 100 μL polysorbaat 20 toe aan de glazen fles.
   3. Schud de fles voorzichtig om te mengen.
      LET OP: Bewaar de wasbuffer maximaal 2 maanden bij 4 °C. Verdubbel de volumes ultrapuur water, 400x wasbufferconcentraat en polysorbaat 20 voor een volledige microplaat van 96 putjes aan monsters.
   4. Breng de wasbuffer voor gebruik over in een wasfles.
5. Preparaat van Ellman's reagens
   OPMERKING: Bereid de dag van de ontwikkeling van ELISA-microplaten voor.
   1. Voeg aan een tegen licht beschermde container 20 ml ultrapuur water toe.
   2. Gebruik een hoeveelheid van het ultrazuivere water om het reagens van Ellman op te lossen.
   3. Breng het Ellman-reagens over in de tegen licht beschermde container.
   4. Gebruik het reagens van Ellman om de fles waarin het kwam te spoelen.
   5. Breng alle oplossing met behulp van een pipet terug in de tegen licht beschermde container.
6. ELISA microplate wash
   1. Gooi de inhoud van de ELISA-microplaat weg door deze om te keren. Zorg ervoor dat de putjes worden geleegd door met de omgekeerde ELISA-microplaat op keukenpapier te tikken.
   2. Vul de putjes met wasbuffer met behulp van de wasfles.
   3. Schud de ELISA-microplaat voorzichtig gedurende 5 s en gooi dan de wasbuffer weg en tik de resterende vloeistof eruit op een papieren handdoek.
   4. Vul de ELISA-microplaat met wasbuffer, schud de ELISA-microplaat voorzichtig gedurende 30 s en gooi de inhoud weg. Herhaal dit vier keer en tik na elke stortbeurt met de ELISA-microplaat op keukenpapier om de resterende vloeistof te verwijderen.
      OPMERKING: Voorkom onnauwkeurige absorptiemetingen door de ELISA-microplaat grondig te wassen.
7. Ontwikkeling en aflezen van ELISA-microplaten
   1. Breng het reagens van Ellman over naar een reservoir.
   2. Gebruik snel een meerkanaalspipet om 200 μL Ellman's reagens toe te voegen aan de blanco, NSB, B₀, TA, standaard en monsterputjes.
   3. Voeg 5 μL AChE-tracer toe aan het TA-putje.
   4. Bedek de ELISA-microplaat met parafilm, plaats deze in een tegen licht beschermde container en incubeer 60-90 minuten bij kamertemperatuur onder agitatie.
      OPMERKING: Gebruik de_B0-putjes als indicatoren voor de juiste incubatietijd. Ideale B_0-putten zien er zichtbaar geel uit, maar niet donker.
   5. Verwijder de paraffinefilm en lees de ELISA-microplaat af bij een optische dichtheid van 412 nm.
      OPMERKING: Putjes B₀ met een absorptiecottie tussen 0,3 AE en 1,0 AE, met aftrek van de blanco's, geven aan dat de ELISA-microtiterplaat voldoende ontwikkeld is.
   6. Facultatief: Als de ELISA-microplaat onderontwikkeld is, vervang dan de paraffinefilm en laat deze nog een extra periode incuberen in een tegen licht beschermde container. Als de ELISA-microtiterplaat overontwikkeld is, dumpt u het Ellman-reagens, spoelt u eenmaal met wasbuffer en ontwikkelt u de ELISA-microtiterplaat opnieuw met het reagens van Ellman.

Figuur 2: Lay-out van de microplaat. Een voorbeeld van een microplaatlay-out voor de concurrerende ELISA. NSB geeft een niet-specifieke bindingsput aan. B₀ geeft een maximale bindingsput aan. TA geeft een totale activiteit goed aan. Std. geeft een standaardput aan met het bijbehorende nummer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Omzetting naar concentratie

1. Gebonden AChE tracer berekeningen
   1. Gemiddelde van de absorptie van de twee blanco's en trek het gemiddelde af van de absorptie van elke put.
      OPMERKING: Gebruik de blanco afgetrokken absorpties voor de rest van de berekeningen.
   2. Bereken de gemiddelde extincties van de NSB-,_B-0- en blanco putten.
   3. Gebruik de volgende vergelijking om de gecorrigeerde B 0-extinctie te berekenen:
      
      OPMERKING: Corr. staat voor gecorrigeerd, Abs. staat voor absorptie en Avg. staat voor gemiddeld. Als de gemiddelde absorptie van de lege putten (met het blanco gemiddelde afgetrokken) een negatief getal is, gebruik dan nul voor de berekening.
   4. Bereken de verhouding voor elke norm en steekproef met behulp van de volgende vergelijking:
      
   5. Vermenigvuldig de verhouding van elk monster met 100 om het percentage te berekenen.
      OPMERKING: Monsters tussen 20% en 80% vallen op de standaardcurve.
2. Standaard curveberekeningen
   1. Gemiddelde van de verhouding van de dubbele putten van elke standaard (1 tot 8).
   2. Bereken de logit van de gemiddelde verhouding van elke norm met behulp van de volgende vergelijking:
      
   3. Met behulp van de bekende concentraties van elke standaard (Tabel 1) als de X-waarden en de logit van elke standaard als de Y-waarden, bereken je de helling en het Y-snijpunt.
   4. Bereken de bepalingscoëfficiënt door de log₁₀ van de bekende cGMP-standaardconcentraties te gebruiken als de X-waarden en de logit van elke standaard als de Y-waarden.
      OPMERKING: Controleer of de bepalingscoëfficiënt dicht bij 1 ligt.
3. cGMP-concentratieberekeningen in pmol/ml
   1. Bereken de logit van elk monster met behulp van de volgende vergelijking:
      
   2. Gebruik de volgende vergelijking om de concentratie cGMP in elk monster te berekenen (in picomol cGMP per milliliter monster):
      
      OPMERKING: D.R. staat voor dilution ratio. De homogenaat D.R. som voor levermonsters verdund met een verdunningsverhouding van 1:5 zoutzuur is gelijk aan 6. De buffer D.R. som voor levermonsters verdund met een verdunningsverhouding van 1:2 van ELISA-buffer is gelijk aan 3. Daarom worden de termen gegroepeerd tussen haakjes vermenigvuldigd met 18.
4. cGMP-concentratieberekeningen in nmol/g
   1. Bereken de nanomol cGMP per putje met de volgende vergelijking:
      
   2. Bereken het aantal grammen weefsel in elk geacetyleerd monster met de volgende vergelijking:
      
      OPMERKING: "mg weefsel" is de massa weefsel die in milligram aan de homogenisatiebuis wordt toegevoegd. "gebruikt volume HCl": het volume van 0,1 N zoutzuur dat wordt gebruikt om de monsters te verdunnen voor homogenisatie.
   3. Bereken het aantal grammen weefsel in elk met ELISA-buffer verdund monster aan de hand van de volgende vergelijking:
      
      OPMERKING: "volume verdund monster" is het volume van het monster verdund door ELISA-buffer. "250 μl" is het volume van het geacetyleerde monster. De genoemde "reagentia" zijn de acetyleringsreagentia 4 M KOH en azijnzuuranhydride.
   4. Bereken het aantal grammen weefsel per putje met de volgende vergelijking:
      
      OPMERKING: "buffervolume" is het volume ELISA-buffer dat wordt gebruikt om de weefselmonsters te verdunnen voordat de monsters aan de putjes worden toegevoegd.
   5. Deel de nanomol cGMP per putje door het gram weefsel per putje om de concentratie cGMP in nmol/g te berekenen.

Standaard nummer	Concentraties van cGMP (pmol/ml)
Standaard 1	3.0
Standaard 2	1.5
Standaard 3	0.75
Standaard 4	0.375
Standaard 5	0.1875
Standaard 6	0.09375
Standaard 7	0.046875
Standaard 8	0.0234375

Tabel 1: Standaardconcentraties. De bekende concentraties van de normen 1 tot en met 8.

Resultaten

Yorkshire gedomesticeerde varkens die werden behandeld met natriumchloride in de voeding (0,15 mmol/kg) of ¹⁵N-gelabeld nitraat (0,15 mmol/kg) eenmaal per dag gedurende vijf opeenvolgende dagen als een bolus in chow, werden geperfundeerd met een heparine-natriumoplossing (0,9% natriumchloride) voorafgaand aan weefselverzameling; Alle details van de collectie zijn eerder gepubliceerd¹⁹. cGMP-concentraties in de gluteusspieren en levers van vier gedomesticeerde varkens uit Yorkshire werden gemeten in overeenstemming met het beschreven ELISA-protocol. Leverweefsels werden verdund in een verdunningsverhouding van 1:5 en gluteusspieren in een verdunningsverhouding van 1:10, met 0,1 N zoutzuur (HCl) om eiwitten neer te slaan. De HCl-verdunde homogenaten werden geacetyleerd en vervolgens verdund met ELISA-buffer in een verdunningsverhouding van 1:2 en 1:3 voor zowel lever- als gluteusspiermonsters. cGMP-concentraties werden gemeten zoals hierboven beschreven. De extincties werden omgezet in picomol cGMP per milliliter geprepareerd monster en vervolgens in nanomol cGMP per gram weefsel (nmol/g weefsel) zoals vermeld in het bovenstaande protocol.

cGMP-concentraties gemeten in leverweefsels leverden optimale experimentele resultaten op onder de bovenstaande omstandigheden. De cGMP-concentraties in de controlegroep en in de met nitraat behandelde groep in varkenslever zijn respectievelijk 0,0202 nmol/g ± 0,003 nmol/g weefsel en 0,0364 nmol/g ± 0,011 nmol/g weefsel (Figuur 3). Verschillende waarden bevestigen de betrouwbaarheid van de resultaten. De extincties van de B_0-putten met aftrek van de blanco's, die variëren van 0,466 tot 0,475, vallen binnen het bereik van 0,3 AU tot 1,0 AE, wat voldoende microplaatontwikkeling met Ellman's reagens verifieert. De hoge kwaliteit van de standaardcurve blijkt zowel uit de geleidelijke toename van de extinctie van standaard 1 naar standaard 8 als uit de lineariteit van de standaardcurve, geverifieerd door een bepalingscoëfficiënt van 0,99. Het percentage voor elke gemeten put (31,5%-71,2%) ligt tussen 20% en 80%, wat bevestigt dat alle monsters op de standaardcurve vallen. Monsters die de vermelde kenmerken bezitten, zijn geschikt voor interpretatie.

cGMP-concentraties gemeten in de gluteusspierweefsels leverden suboptimale experimentele resultaten op. Het suboptimale label wordt toegekend aan de gluteus-spierresultaten omdat de meeste procentuele waarden van de gluteus-spierputten (3,69%-27,3%) onder de 20% daalden, wat aangeeft dat er meer verdunde monsters nodig waren om de extincties op de standaardcurve te laten vallen. De cGMP-concentraties in de controlegroep en in de met nitraat behandelde groep in de gluteusspier van varkens zijn respectievelijk 1,22 nmol/g ± 0,49 nmol/g weefsel en 0,732 nmol/g ± 0,18 nmol/g weefsel (grafiek niet weergegeven). De gluteusspiermonsters delen de absorptie van de B_0-putten en -standaarden van de levermonsters. Het gebruik van deze suboptimale steekproeven kan tot onjuiste conclusies leiden; daarom zijn de voorbereiding van meer verdunde monsters en een hermeting van de cGMP-concentraties nodig.

Figuur 3: cGMP-concentratie in leverweefsel. De gemiddelde cGMP-concentratie van varkenslever behandeld met natriumchloride (0,15 mmol/kg) of ¹⁵N-gelabeld nitraat (0,15 mmol/kg) in nmol/g weefsel. n = 4; de foutbalken geven de standaarddeviatie aan; gegevens werden geanalyseerd door Welch's t-test; NS staat voor No Significance. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het protocol geeft instructies over de stappen die nodig zijn om cGMP-concentraties in vaste weefsels te meten met behulp van competitieve ELISA. Variaties in cGMP-concentraties kunnen wijzen op verschillen in de overvloed van NO in weefsels. Door deze verschillen in vaste weefsels te onderzoeken, kan informatie over NO in verschillende organen worden opgehelderd.

In het protocol werden weefselmonsters eerst gehomogeniseerd ter voorbereiding op de ELISA. Dit begon met het snel invriezen van een massa vast weefsel en het vervolgens verpulveren. Het opbreken van weefsels voorafgaand aan de homogenisatiestap is bedoeld om de parelhomogenisator te helpen de cellen te lyseren. Weefsels werden gehomogeniseerd in 0,1 N zoutzuur om eiwitten neer te slaan, een techniek die in andere methoden werd gebruikt^20,21. Ten slotte werden de vaste stoffen en het neerslag via centrifugatie gescheiden van de oplosbare componenten. Om de standaardcurve te maken, werd een voorraad cGMP (300 pmol cGMP/ml) serieel verdund om acht verschillende standaarden te maken. Standaarden en monsters werden geacetyleerd om de gevoeligheid van de test te verbeteren door concentraties tot 0,1 pmol cGMP/ml te detecteren. Deze toename in gevoeligheid wordt bereikt wanneer de acetylgroep een binding vormt met cGMP, waardoor het vermogen van elk antilichaam (aanwezig in het antiserum) om te binden aan het geacetyleerde cGMP¹⁸ wordt verbeterd. Het acetyleren van zowel de standaarden als de monsters zorgt voor uniformiteit in cGMP-binding tussen de putten. De acetyleringsstap kan worden weggelaten voor zowel standaarden als monsters als de cGMP-concentratie in de microplaatputjes naar verwachting hoger zal zijn dan 1,0 pmol/ml¹⁸.

Ter voorbereiding op het toevoegen van monsters aan de putten werden de monsters verder verdund met ELISA-buffer. Door de extra verdunning konden de monsters op de standaardcurve vallen en meer lijken op de inhoud van de NSB-,_B0- en standaardputten, waardoor uniformiteit ontstond. Samen met de monsters en standaarden worden verschillende andere oplossingen in de putten gemengd. In de NSB-putjes wordt ELISA-buffer (met en zonder de acetyleringsreagentia) toegevoegd terwijl antiserum wordt onthouden. Dit is om de hoeveelheid AChE-tracer (acetylcholinesterase gebonden aan cGMP) te bepalen die bindt aan het IgG van de muis dat aan de put kleeft in afwezigheid van het specifieke antilichaam waaruit het antiserum bestaat. B_0-putjes bevatten ELISA-buffer (met de acetyleringsreagentia), AChE-tracer en antiserum; daarom vertonen de B_0-putten het bindende vermogen van de AChE-tracer zonder de concurrentie van cGMP. Nadat alle putjes op de juiste manier zijn gevuld, wordt de microplaat geïncubeerd en vervolgens gewassen. Het reagens van Ellman werd aan de putten toegevoegd. Ten slotte werd een AChE-tracer aan de TA toegevoegd, ruim nadat het reagens van Ellman was toegevoegd. Dit geeft goed de katalytische activiteit van de AChE-tracer weer, ongeacht hoeveel tracer door de antilichamen aan de microplaat was gebonden. De microtiterplaat werd ontwikkeld bij kamertemperatuur, waardoor de AChE-tracer een colorimetrische reactie kon katalyseren.

Verschillende stappen in het protocol kunnen de resultaten van de test wijzigen; Extra zorg moet worden besteed aan het uitvoeren van de volgende stappen voor een optimaal resultaat. De identificatie van geschikte verdunningen voor elk weefseltype voor de homogenisatiestap en na acetylering is nodig om te garanderen dat de monsters op de standaardcurve vallen. Bij het opstellen van de standaarden moeten de oplossingen grondig worden gevortexeerd of gemengd voordat een aliquot wordt verwijderd of nadat een aliquot wordt toegevoegd. Deze stap is belangrijk om de verwachte cGMP-concentraties van elke standaard te bereiken. Tijdens de acetyleringsstappen moet elke standaard en elk monster gedurende dezelfde duur worden gevortexd om consistente absorptiewaarden te bereiken. Standaarden en monsters moeten ook onmiddellijk vóór de toevoeging van een aliquot aan de desbetreffende put worden gevortexeerd. Deze praktijk resulteert in nauwkeurigere cGMP-concentraties. Grondig wassen van de microplaat verbetert ook de nauwkeurigheid van de absorptiewaarden, omdat alle ongebonden AChE-tracer uit de put wordt verwijderd. Na de toevoeging van het reagens van Ellman moet er voldoende tijd worden gegeven voor de ontwikkeling van de microtiterplaat, waarbij aandacht moet worden besteed aan de kleur en, belangrijker nog, de absorptie van de B 0-putjes. Het is belangrijk om te erkennen dat de cGMP-concentratie tussen duplicaten of drievouden meer kan variëren in monsters met lagere cGMP-niveaus in vergelijking met monsters met hogere concentraties. Het meten van een meer geconcentreerde steekproef kan helpen dit probleem aan te pakken. Om rekening te houden met eventuele variabiliteit tussen microplaten, moeten monsters van hetzelfde weefseltype bovendien waar mogelijk op dezelfde plaat worden gemeten. Het volgen van deze richtlijnen zal naar verwachting de kwaliteit van de resulterende gegevens van de test verbeteren.

Het bovenstaande protocol kan worden geëxtrapoleerd naar andere zachte, vaste weefsels. Verdere ontwikkeling van de subsectie weefselpreparatie van het bovenstaande protocol kan resulteren in een methode die geschikt is voor het verwerken van harde weefsels, inclusief bot, die interessant kunnen zijn vanwege de vasculariteit ervan. Verdere ontwikkeling van deze techniek kan resulteren in een methode die geschikt is om cGMP-concentraties in een grote verscheidenheid aan vaste weefsels te meten, wat resulteert in een bruikbare methode om aanvullende informatie te verzamelen over de abundantie van NO in vrijwel elk weefsel. Hoewel het hierboven vermelde competitieve ELISA-protocol een nuttige techniek is voor het meten van cGMP en het schatten van de abundantie van NO, heeft het twee opmerkelijke beperkingen: (1) Deze test maakt geen onderscheid tussen cGMP gesynthetiseerd door oplosbaar guanylylcyclase en cGMP gesynthetiseerd door deeltjesguanylcyclase (pGC). Natriuretische peptiden stimuleren de pGC-activiteit²² en veranderingen in cGMP via deze route duiden dus niet op veranderingen in de overvloed van NO; (2) Bovendien beïnvloeden fosfodiësterase (PDE)-enzymen de resultaten van de ELISA-test. Verschillende PDE's hydrolyseren cGMP, waardoor de concentratie na stimulatie van sGC met NO²³ wordt verminderd. Daarom kan de katalytische activiteit van PDE's het verband tussen cGMP-concentraties en de abundantie van NO verdoezelen. De toevoeging van een PDE5-remmer, zoals sildenafil, om cGMP-verlies te voorkomen, is aan te raden voor experimenten die voornamelijk gericht zijn op het verkrijgen van exacte cGMP-concentraties, in tegenstelling tot het verkrijgen van metingen om trends in cGMP-concentraties te observeren. PDE5-remmers kunnen ongeveer 1 uur voor de monsterafname als sildenafil aan dieren worden toegediend (de effecten duren tot 4 uur^{en 24} uur) of, als een dergelijke toediening niet haalbaar is, kan sildenafil worden toegevoegd aan de verzamelde monsters. Bij het remmen van PDE's na weefselverzameling, voeg sildenafil toe aan het zoutzuur van 0,1 N, zodat de weefsels worden gehomogeniseerd in aanwezigheid van sildenafil. Er moeten metingen met en zonder sildenafil worden uitgevoerd om er zeker van te zijn dat er geen overspraak is tussen de dierbehandeling en sildenafil.

Zelfs met zijn beperkingen wordt de test gebruikt als een informatief inzicht in de stroomafwaartse transmissie van het NO-signaal. Concluderend kan worden gesteld dat het koppelen van de meting van cGMP-concentraties in vaste weefsels aan andere NO-meetmethoden zorgt voor een beter begrip van de effecten van NO in organen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL BD Clear Oral Syringe	Becton Dickinson	50382903052177
14 mL Round Bottom Test Tube	Falcon	352059
2.0 ml Microtubes, Assorted	Olympus Plastics	24-283A
30-300 µL multichannel pipette	Eppendorf	3125000052
Acetic Anhydride (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400031	98% puur Gevaar: Ontvlambaar, Corrosief: veroorzaakt ernstige brandwonden, oogbeschadiging, acute toxiciteit Veilige omgang: Weghouden van ontstekingsbronnen, werken in een geventileerde ruimte, handschoenen dragen
cGMP Acetylcholinesterase Tracer (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	481020	kaliumdiwaterstoffosfaat, natriumchloride,  kaliummonowaterstoffosfaat, bovien albumine, natriumazide, EDTA, cGMP AChE tracer Gevaar: Gezondheidsrisico: orgaantoxiciteit bij herhaalde blootstelling, Corrosief: oogbeschadiging, Irritator voor huid en luchtwegen Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
cGMP ELISA Antiserum (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	481022	kaliumdiwaterstoffosfaat, natriumchloride,  kaliummonowaterstoffosfaat, bovien albumine,  natriumazide, EDTA, konijn anti-cGMP polyklonaal antiserum Gevaar: Gezondheidsrisico: orgaantoxiciteit bij herhaalde blootstelling, Corrosief: oogbeschadiging, Irritator voor huid en luchtwegen, acute toxiciteit Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
cGMP ELISA Standard (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	481024	kaliumdiwaterstoffosfaat, natriumchloride,  kaliummonowaterstoffosfaat, bovien albumine,  natriumazide, EDTA, cGMP standaard Gevaar: Gezondheidsrisico: orgaantoxiciteit bij herhaalde blootstelling, Corrosief: oogbeschadiging, Irritator voor huid en luchtwegen Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
Cyclic GMP ELISA Kit	Cayman Chemical Company	581021
ELISA Buffer Concentrate 10X (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400060	1 M fosfaat, 1% BSA, 4 M natriumchloride, 10 mM EDTA, 0.1% natriumazide Gevaar: Gezondheidsrisico: orgaantoxiciteit bij herhaalde blootstelling, Corrosief: oogbeschadiging, Irritator voor huid en luchtwegen Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, bewaar in een container met een sluitbaar deksel, draag handschoenen
ELISA Reagent Reservoir	Pierce (Now Thermo Fisher Scientific)	15075
Ellman's Reagent (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400050	kaliumdiwaterstoffosfaat, natriumchloride, kaliummonowaterstoffosfaat, acetylthiocholine (jodide), 5,5'-dithiobis-(2-nitrobenzoëzuur) Gevaar: Acute toxiciteit, gezondheidsrisico: orgaantoxiciteit, Corrosief: oogbeschadiging, huidirritant, irritator voor de luchtwegen Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
Hydrochloorzuur	Sigma-Aldrich	320331	Gevaar: Corrosief: corrodeert metaal, veroorzaakt ernstige brandwonden, oogbeschadiging, irritator voor de luchtwegen Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
Vloeibare Stikstof	Robert's Oxygen		Stikstof Gevaar: Gecomprimeerd gas: risico op cryogeen brandwonden, vorst, verstikking Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
Mouse Anti-Rabbit IgG Coated Plate (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400006	Gevaar: Geen
New Classic MF Balance	Mettler Toledo
Orbital Shaker	Stovall Life Science Inc. (Now IBI Scientific)	15-453-211 (Varies)
Parafilm	Bemis Company, Inc.	3023-4526 (Varies)
Polysorbaat 20 (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400035	Gevaar: Geen
Kaliumhydroxide (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400029	85% puur Gevaar: Corrosief: corrodeert metalen en huid, Oogbeschadiging, acute toxiciteit Veilige omgang: Werk in een geventileerde ruimte, draag handschoenen
Precellys Evolution Homogenizer	Bertin Technologies	PE000062-PEVO0-A
Precellys Lysing Kit Hard Tissue Homogenizing	Bertin Technologies	P000911-LYSK0-A
Sense Microplate Reader	HIDEX	425-301
Sorvall Legend Micro 17R Centrifuge	Thermo Fisher Scientific	75002441
Tissue Pulverizer	Cellcrusher	Cellcrusher kit
Vortex Genie 2	Scientific Industries	SI-0246
Wash Bottle	Sigma-Aldrich	Z423092
Wash Buffer Concentrate 400X (in cGMP kit)	Cayman Chemical Company	400062	kaliumdiwaterstoffosfaat, kaliummonowaterstoffosfaat, water <