Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hypoxie verandert de miRNA-niveaus die betrokken zijn bij niet-Mendeliaanse overerving van autismespectrumstoornis bij muizen

41.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68435

⸱

11 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Gevher Nesibe Genome and Stem Cell Institute, Erciyes University, 2Betül Ziya Eren Genome and Stem Cell (GENKÖK) Center, Erciyes University, 3Department of Medical Biology, Erciyes University, 4Department of Histology and Embryology, Yozgat Bozok University, 5Department of Physiology, Erciyes University, 6Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine, Erciyes University, 7University of Nice Sophia Antipolis, 8Department of Medical Genetics, Erciyes University

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een protocol om hypoxie op te wekken bij neonatale muizen door ze af te leveren in gecontroleerde omgevingen met variërende zuurstofconcentraties. Muismodellen die bij de geboorte aan zuurstofvariaties zijn blootgesteld, hebben de expressie van miRNA's die betrokken zijn bij de inductie van gedragsfenotypische veranderingen zoals autisme duurzaam gevarieerd.

Samenvatting

Hypoxie kan tijdens de perinatale periode om verschillende redenen in verschillende mate optreden en de ontwikkeling beïnvloeden. We willen de gevolgen van milde tot ernstige neonatale hypoxie bij muizen onderzoeken, met de nadruk op het mogelijke verband met neurodegeneratieve foetale hersendisfuncties gerelateerd aan autismespectrumstoornis (ASS).

We induceerden hypoxie bij neonatale muizen door ze af te leveren in gecontroleerde omgevingen met variërende zuurstofconcentraties. De resultaten toonden verhoogde niveaus van HIF-1α (een marker van hypoxie) in de hersenschors en hippocampus, evenals verhoogde neurodegeneratie in deze regio's. Bovendien zagen we veranderde expressie van ASS-gerelateerde miRNA's (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p en miR-499a-5p) in hypoxische groepen, consistent met eerdere resultaten in menselijke en diermodellen van ASS. Deze moleculaire veranderingen gingen gepaard met gedragsveranderingen zoals verminderde beweging, snelheid, sociale interactie en repetitief gedrag, evenals een verhoogde neiging om hoekzoekend gedrag te vertonen bij muizen die werden blootgesteld aan hypoxische omstandigheden. Hoewel gedrags- en moleculaire veranderingen detecteerbaar waren in de 12% O2-groep (milde hypoxie), werden de meest uitgesproken veranderingen waargenomen in de ernstigere hypoxiegroepen, bij 10% O2 en 8% O2.

Over het algemeen suggereren de resultaten dat neonatale hypoxie blijvende moleculaire veranderingen kan veroorzaken die verband houden met neurodegeneratieve ziekten met gedragsgevolgen. Bovendien kan blootstelling aan hypoxie tijdens de vroege ontwikkeling, zelfs bij een normale geboorte, het geheugen en het leervermogen aantasten. De resultaten benadrukken de noodzaak van vroege opsporing en interventie bij pasgeborenen die zijn blootgesteld aan hypoxie om neurologische problemen op de lange termijn te voorkomen. miRNA-niveaus worden tijdens de ontwikkeling gereguleerd en hun modificaties in weefsels, vooral in geslachtscellen, vormen een risicofactor voor de volgende generatie. De analyses bieden een basis voor het bestuderen van de regulerende routes die van invloed zijn op functionele en gedragsveranderingen onder hypoxie.

Inleiding

Gedefinieerd als een toestand van zuurstoftekort, kan hypoxie unieke cellulaire en moleculaire reacties uitlokken die van cruciaal belang zijn voor het begrijpen van zijn rol in verschillende pathologieën. Het kan ontwikkelingssequenties verstoren, wat leidt tot moleculaire, cellulaire en neuronale veranderingen en verwondingen. Bovendien onderbreekt vroege blootstelling aan hypoxie de ontwikkeling van het centrale zenuwstelsel (CZS), waardoor de axonale connectiviteit en de ontwikkeling van synapsen worden belemmerd1.

Bovendien, hoewel is aangetoond dat hypoxie nadelige effecten heeft op de ontwikkeling van het CZS, kan het ook een cruciale fysiologische rol spelen onder specifieke omstandigheden, zoals tijdens de embryogenese. Normale fysiologische hypoxie verwijst naar een situatie waarin het zuurstofgehalte van nature laag is tijdens de embryonale ontwikkeling op een gunstige manier. Dit proces stelt embryonale cellen in staat energie te produceren door het anaërobe metabolisme te bevorderen, ondersteunt de ontwikkeling van de bloedsomloop door de vascularisatie te versnellen, zorgt voor een goede ontwikkeling van het hart en de botten en stimuleert de migratie van neurale lijstcellen2. Omgekeerd kan hypoxie die buiten de fysiologische context optreedt, nadelige effecten hebben op de ontwikkeling en de algehele gezondheid, inclusief de embryonale ontwikkeling, wat kan leiden tot vroeggeboorte of zelfs embryonale letaliteit1. Het is daarom een groot probleem voor de volksgezondheid, aangezien veel pasgeborenen tijdens de normale bevalling hypoxische aandoeningen ervaren, vaak zonder onmiddellijke herkenning door verzorgers of medisch personeel3. Bovendien zijn afwisselingen in neuronale connectiviteit geassocieerd met hypoxie gekoppeld aan neurologische ontwikkelingsstoornissen, waaronder autismespectrumstoornissen (ASS) en verstandelijke handicaps1.

Vanuit een moleculair perspectief kan hypoxie de neurologische ontwikkeling beïnvloeden door de expressie van genen die synaptische functies reguleren te veranderen, waardoor de neuronale connectiviteit wordt verstoord en wordt bijgedragen aan de ontwikkeling van neurologische ontwikkelingsstoornissen4.

Klinisch gezien beïnvloedt neonatale hypoxie de ontwikkeling van het CZS via hormonale en metabole routes1. Als reactie op acute hypoxie geeft de hypothalamus snel het corticotropine-releasing hormoon en argininevasopressine af, dat vervolgens de afgifte van adrenocorticotroop hormoon uit de hypofysevoorkwab veroorzaakt, gevolgd door de productie van glucocorticoïden in de foetale bijnierschors en de mate van deze respons is gecorreleerd met de intensiteit en duur van hypoxie. Deze snelle respons van de hypothalamus-hypofyse-bijnier (HPA) -as op acute stress onderstreept de cruciale rol van glucocorticoïden bij het beperken van de fysiologische effecten van stress en het handhaven van foetale homeostase door geassocieerde genexpressie, eiwitsynthese en cellulair metabolisme te beïnvloeden 5,6.

Verlaagde normale zuurstofniveaus activeren verschillende reacties op hypoxie, waarvan de meeste worden gereguleerd door transcriptiefactoren, hypoxie-induceerbare factoren (HIF's) en cellulaire zuurstofsensoren zoals prolylhydroxylasen (PHD's)1. HIF-1, een regulatorvan de O2-homeostase zoals aangetoond in in vitro studies7, is een heterodimeer dat bestaat uit HIF-1α en HIF-1β8. Onder hypoxische omstandigheden wordt de vervanging van het waterstofatoom door een hydroxylgroep in het complex verminderd, wat leidt tot de accumulatie van HIF-1α, dat vervolgens dimeriseert met HIF-1β. Als gevolg hiervan transloceert het HIF-1-dimeer naar de kern, waar het de transcriptie van honderden genen activeert1.

De zuurstofafhankelijke aard van neuronen maakt ze bijzonder vatbaar voor hypoxische stress. Daarom kan hypoxie een aanzienlijke invloed hebben op de hersenfysiologie, met langetermijnimplicaties voor de neuronale functie, door axonale pathfinding en synapsontwikkeling te belemmeren9. Deze veranderingen in neuronale verbindingen kunnen vatbaar zijn voor verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen zoals ASS en verstandelijke beperking 9,10.

Perinatale verstikking wordt gedefinieerd als zuurstofgebrek tijdens de bevalling en kan optreden als gevolg van perinatale gebeurtenissen zoals maternale foetale bloeding, compressie van de navelstreng, placentacomplicaties, baarmoederruptuur, schouderdystocie of het niet inademen van de pasgeborene. Deze ernstige gebeurtenis treft elk jaar ongeveer vier miljoen pasgeborenen wereldwijd en resulteert in een miljoen neonatale sterfgevallen 11,12,13. Hoewel de meeste zuigelingen episodes van hypoxie overleven, ontwikkelen sommige patiënten hypoxisch-ischemische encefalopathie, wat kan leiden tot permanente neurologische problemen zoals convulsies, hersenverlamming, cognitieve vertragingen en motorische stoornissen. Bovendien kunnen verstikking en ischemie disfunctie veroorzaken van verschillende organen en systemen, zoals het CZS (28%), het cardiovasculaire systeem (25%), de nieren (50%) en de longen (23%)11.

Bovendien zijn onvolwassenheid van het cerebrale vaatstelsel en slechte autoregulatie factoren die pasgeborenen vatbaar maken voor ischemische risico's. In dergelijke processen zijn ontsteking en oxidatieve stress de belangrijkste mediatoren van neonatale hypoxisch-ischemische schade en de bijbehorende celdoodmechanismen. Abnormale apoptose kan de zich ontwikkelende hersenen blootstellen aan risico's op motorische en cognitieve stoornissen14.

Gezien de complexiteit van ASS, is het essentieel om de onderliggende genetica te begrijpen die een polygene structuur lijkt te hebben, evenals de omgevingsfactoren die de ontwikkeling ervan bepalen. In het bijzonder impliceert de polygene basis van ASS een multifactoriële etiologie, waarbij genetische aanleg interageert met externe factoren, waaronder hypoxie. De 60%-92% concordantie die wordt waargenomen bij monozygote tweelingen benadrukt het belang van genetische invloeden, terwijl de discordantie aangeeft dat omgevingsfactoren ook een rol spelen. De prevalentie van autisme wordt geschat op 13/10.000, en dit percentage wordt verondersteld de afgelopen jaren te zijn toegenomen15. Studies ondersteunen de hypothese dat blootstelling aan omgevingsfactoren tijdens de zwangerschap het risico op autisme kan verhogen, maar de resultaten van deze onderzoeken zijn vaak inconsistent vanwege verschillen in diagnostische criteria, vergelijkingsgroepen, steekproefomvang en blootstellingsbeoordelingsmethoden15,16.

Hoewel de kenmerkende neuropathologische bevindingen onduidelijk zijn, onthullen studies microscopisch kleine en functionele hersenafwijkingen. Deze afwijkingen suggereren dat de etiologisch relevante periode in utero kan zijn en dat de pathogenese kan beginnen tijdens de prenatale periode15. Blootstellingen tijdens de zwangerschap zijn de belangrijkste focus van epidemiologisch onderzoek naar mogelijke risicofactoren voor autisme. Met name de hypothese dat verloskundige complicaties het risico op ASS kunnen verhogen, wordt door veel onderzoeken ondersteund, maar de omvang en gevolgen van deze effecten variëren tussen onderzoeken17.

Naast genetische factoren spelen epigenetische mechanismen een sleutelrol bij het reguleren van genexpressie onder hypoxische omstandigheden. MiRNA's vormen met name een belangrijk regulerend mechanisme in de cellulaire respons op hypoxie, zoals hun impact op HIF. Tijdens de vroege stadia van hypoxie kunnen specifieke veranderingen in miRNA-niveaus bijdragen aan de accumulatie van HIF-1 en het behoud van stabiele niveaus van HIF-2 en HIF-318. Hoewel het expressieprofiel van veel miRNA's verandert onder hypoxische en ischemiecondities, is aangetoond dat een beperkt aantal hypoxie-geassocieerde miRNA's een functionele rol speelt en de HIF-expressie beïnvloedt. Dit verklaart waarom verschillende menselijke weefsels verschillen in hypoxische responsen als gevolg van weefselspecifieke miRNA-expressie18.

Opkomende gegevens geven ook aan dat specifieke miRNA's betrokken zijn bij ASS-pathologie. In ons eerdere werk hebben we aangetoond dat miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p en miR-499a-5p, waarvan bekend is dat ze celoverleving, differentiatie en stressreacties bij kanker reguleren, een afwijkende expressie vertonen bij ASS-patiënten, wat mogelijk van invloed is op neurologische ontwikkelingsresultaten. Vervolgens bevestigden we deze bevindingen in bloed-, hypothalamus- en spermamonsters van muismodellen van ASS, waarbij we een consistente associatie van genregulerende veranderingen met de ziekte aantoonden19. Deze resultaten geven aan dat de downregulatie van deze miRNA's in cruciale stadia van groei en ontwikkeling een aanzienlijke invloed kan hebben op de ontwikkeling van ziekten zoals ASS. Dit toont verder de diepgaande invloed van neonatale hypoxie op moleculaire en gedragskenmerken aan.

In deze studie hebben we de impact van milde tot matige neonatale hypoxie op het risico op het ontwikkelen van autisme op volwassen leeftijd getest. Om dit te doen, werden neonatale muizen blootgesteld aan verschillende niveaus van hypoxie. Muizen die bij de geboorte hypoxie ervoeren, vertonen inderdaad gedragsveranderingen op volwassen leeftijd en, nog belangrijker, op moleculair niveau, veranderingen die verband houden met ASS. Onze resultaten leverden dus waardevolle informatie op over de langetermijneffecten van hypoxie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Local Animal Experiments Ethics Committee van Erciyes University (HAYDEK) en uitgevoerd onder licentienummer 21/216.

1. Dierlijke proefpersonen

OPMERKING: Bij deze studie waren Balb/c-muizen betrokken van de Transgene Unit van het Betül-Ziya EREN Genome and Stem Cell Center (GENKÖK) aan de Universiteit van Erciyes.

  1. Gebruik 2 maanden oude Balb/c-muizen met een gewicht van gemiddeld 18-25 g. Houd de muizen op een temperatuur van 20 ± 2°C, met een luchtvochtigheid van 52 ± 3% in een licht/donkercyclus van 12 uur (6-18 uur).
  2. Voer de muizen met standaard muizenkorrels, met wekelijkse verschoning van het strooisel en zorg voor onbeperkte toegang tot voedsel en water.
    OPMERKING: Moleculaire studies werden uitgevoerd in de Genomics and Hypoxia Laboratories van de GENKÖK en het Histology and Embryology Laboratory van Bozok University. Een 'STOP-punt' geeft aan waar u uw werk kunt pauzeren en bewaren op de aangegeven temperatuur.

2. Hypoxie model vestiging

  1. Ontwerp het experiment zo dat het 4 groepen omvat, waaronder 3 hypoxische en 1 schijncontrolegroep.
  2. Koppel gezonde vrouwelijke muizen aan gezonde mannelijke muizen om gezonde zwangere vrouwelijke muizen te vormen, die uiteindelijk in de volgende groepen zullen worden ingedeeld: ernstige hypoxie (8% O2) (n = 4), matige hypoxie (10% O2) (n = 4), milde hypoxie (12% O2) (n = 4) en normoxie (21% O2) als schijncontrolegroep (n = 4).
  3. Om hypoxie op te wekken, brengt u de drachtige muizen over naar het hypoxielaboratorium en begint u ze 72 uur voor dag E21.5 te controleren.
  4. Detecteer het bevallingspunt van de drachtige muizen in de hypoxische groepen en plaats ze onmiddellijk in hypoxiekamers. Pas het zuurstofgehalte voor elke kamer aan zoals beschreven voor elke groep (weergegeven in stap 2.2.).
  5. Houd pasgeborenen slechts 5 minuten in hypoxische omstandigheden en breng ze vervolgens onmiddellijk over naar normale huisvestingsomstandigheden.
    OPMERKING: Het langer in hypoxische omstandigheden houden van proefpersonen kan leiden tot dodelijkheid.
  6. Gebruik 2 pasgeborenen (willekeurig gekozen) uit elke groep om door hypoxie veroorzaakte schade te bevestigen en het geslacht te bepalen. Houd de resterende pups naast hun moeder in normale huisvestingsomstandigheden tot het einde van de lactatieperiode voor aanvullende moleculaire en gedragstesten voor de volwassenheidsfase (zie experimenteel ontwerp in aanvullende figuur 1).

3. Geslachtsbepaling om mogelijke verschillen in hypoxische effecten tussen geslachten in het pasgeborenenstadium te beoordelen

  1. Weeg elke muis (willekeurig geselecteerd (x2/groep)) afzonderlijk om de vereiste dosering anesthetica te berekenen. Dien ketamine toe in een dosis van 100 mg/kg en xylazine in een dosis van 10 mg/kg intraperitoneaal.
  2. Zodra de muis volledig verdoofd is, gaat u verder met euthanasie via cervicale dislocatie en verzamelt u onmiddellijk staartweefsel in steriel gelabelde buisjes van 1,5 ml (een STOP-punt, -80 °C)
  3. Verzamel onmiddellijk alle hersenweefsels en breng deze over naar centrifugebuisjes met 10% formaldehyde voor verdere analyse (een STOP-punt, 25 °C).
  4. Bereid weefsels voor op DNA-extractie.
    1. Bereid staartmonsters voor en ontdooi ze bij 25 °C (indien nodig). Voeg 300 μL lysisbuffer met 1 M Tris, 0,5 M EDTA, 4% SDS, dH2O en proteïnase K toe aan de monsters.
  5. Homogeniseer de monsters.
    1. Meng de monsters grondig door vortex en broed een nacht bij 55 °C.
    2. Voeg de volgende dag 100 μL ammoniumacetaat toe en meng kort door middel van vortexen. Centrifugeren bij 12.000 g gedurende 20 minuten bij 25 °C
  6. Voer fasescheiding uit.
    1. Breng de heldere waterige fase voorzichtig over in nieuwe steriele, gelabelde buisjes van 1,5 ml.
    2. Voeg 500 μL isopropanol toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 25 °C (een STOP-punt, -20 °C). Centrifugeren bij 12.000 g gedurende 10 minuten bij 25 °C
  7. Was de DNA-pellet.
    1. Nadat u de pellet op de bodem van de buis hebt geïnspecteerd, gooit u de supernatant voorzichtig weg.
    2. Voeg 1000 μL 70% ethanol toe en tik zachtjes op de buis om de pellet te laten drijven. Centrifugeer bij 7500 g gedurende 10 minuten bij 25 °C
  8. Zuiver het DNA.
    1. Nadat u de pellet op de bodem van de buis hebt geïnspecteerd, gooit u de supernatant voorzichtig weg.
    2. Gebruik een micropipet van 10 μL om resterende ethanol te verwijderen en laat het volledig drogen.
    3. Voeg 100 μL nucleasevrij water (NFW) toe om de pellet te resuspenderen. Incubeer bij +4 °C gedurende 10-15 min.
  9. Kwantificeer en bewaar het DNA.
    1. Meet de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer. Bewaar DNA-monsters bij +4 °C tot verder gebruik. (een STOP-punt).
  10. Voer een polymerasekettingreactie (PCR) uit.
    1. Ontwerp SRY-F, SRY-R en indirecte PAX6-F, PAX6-R primers (zie aanvullende tabel 1).
    2. Bereid een PCR-mengsel als volgt (per monster): 5 μL PCR-buffer (10x), 4 μL MgCl2, 4 μL dNTP's, 0,5 μL van elk van de vier primers, 31 μL dH2O en 0,5 μL Taq-polymerase.
      OPMERKING: Taq-polymerase moet als laatste en vlak voor gebruik worden toegevoegd om een optimale amplificatie te garanderen.
    3. Bereid de gelabelde PCR-buisjes voor en plaats ze op een koelrek van +4 °C. Verdeel 45 μL van het mengsel in de buisjes.
    4. Tik zachtjes op het blok om ervoor te zorgen dat de druppels van het PCR-mengsel op de bodem van de buis zitten.
    5. Voeg 5 μL DNA-monsters toe en pipetteer kort. Draai kort en centrifugeer dan de buizen.
    6. Plaats de buisjes in de PCR-machine en stel het programma in op de volgende omstandigheden: Aanvankelijk, incubatie bij 95 °C gedurende 5 min, 40 cycli denaturatie bij 94 °C gedurende 1 min, gloeien bij 57 °C gedurende 45 s en verlenging bij 72 °C gedurende 1 min. Na de cycli een laatste verlenging bij 72 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door een stilstand bij 40 °C voor onbepaalde tijd.
  11. Visualiseer de resultaatmonsters met behulp van 2% agarosegelelektroforese.
    OPMERKING: Voorbeelden met twee banden zijn mannen en die met slechts één band zijn vrouwen.

4. Bevestiging van hypoxieschade bij neonatale muizen

  1. Microscopisch evalueren van hersenweefsel verzameld van geofferde muizen om hypoxische schade te bevestigen en immunohistochemisch te onderzoeken om HIF-1α te testen.
    1. Fixeer en paraffine sluit het weefsel in.
      1. Bewaar weefsels gedurende 12 uur in formaldehyde en was ze vervolgens 6 uur in water.
      2. Fixeer weefsels door te dehydrateren in ethylalcoholreeksen gedurende 1 dag voor elke concentratie: 70%, 80%, 90%, vervolgens 3 uur in 100% ethylalcohol. Plaats weefsels 15 minuten in xyleen om te klaren.
      3. Breng weefsels over naar paraffine serie I, II en III gedurende elk 1 uur. Oriënteer de hersenmonsters na het derde uur goed en leg ze in schone paraffine.
      4. Snijd met behulp van een roterende microtoom 5 μm dikke secties uit de paraffineblokken.
    2. Bereid dia's voor.
      1. Voor hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring plaatst u secties op gewone glazen objectglaasjes.
      2. Plaats voor immunohistochemie secties op positief geladen glasplaatjes.
        OPMERKING: (een STOPPUNT), dia's kunnen in dit stadium worden gearchiveerd voor verdere evaluatie en werk.
    3. Voer HE-kleuring uit.
      1. Dompel de monsters 10 minuten onder in Xyleen I-oplossing.
      2. Dompel de monsters nog 10 minuten onder in Xyleen II-oplossing.
      3. Breng de monsters over naar een reeks afnemende alcoholconcentraties, elk gedurende 1 minuut: 100%, 96% en 80%.
      4. Was de monsters 2 minuten met gedestilleerd water.
      5. Dompel de monsters 8 minuten onder in hematoxyline en was ze vervolgens 2 minuten in gedestilleerd water .
      6. Behandel de monsters na het wassen gedurende 1 s met zure alcohol, gevolgd door een wasbeurt van 1 minuut.
      7. Plaats de monsters gedurende 10 s in ammoniakwater en herhaal vervolgens de wasbeurt van 1 minuut.
      8. Plaats de monsters gedurende 70 s in 30% alcohol.
      9. Dompel de monsters 10 minuten onder in eosine.
      10. Breng de monsters geleidelijk over door de alcoholconcentraties gedurende 1 minuut te verhogen: 96%, 96% en 100%.
      11. Dompel de monsters elk 1 minuut onder in Xyleen I-, Xyleen II- en Xyleen III-oplossingen.
      12. Dek af met een dekglaasje.
    4. Onderzoek met een microscoop.
      1. Onderzoek na HE-kleuring het volledige hersenweefsel van elke groep onder een lichtmicroscoop.
      2. Evalueer hippocampale en corticale gebieden op neuronale degeneratie en pericellulair/perivasculair oedeem.
  2. Voer HIF-1α-kleuring uit.
    1. Incubeer de monsters 's nachts bij 67 °C in een incubator op positief geladen objectglaasjes om een adequate fixatie te garanderen.
    2. Snijd secties door xyleen I- en xyleen II-oplossingen om de deparaffinisatie te voltooien.
    3. Rehydrateer secties door ze achtereenvolgens 5 minuten in 100%, 96%, 80% en 70% ethanoloplossingen te plaatsen, gevolgd door 5 minuten spoelen in gedestilleerd water.
    4. Ontmasker epitopen door secties in de magnetron te zetten in 0,01 M citroenzuur (pH 6,0) bij 665 W gedurende twee cycli van 5 minuten.
    5. Koel de secties 20 minuten af op kamertemperatuur (RT).
    6. Baken de omtrek van de secties af met een hydrofobe pen en was de secties vervolgens 3 keer in PBS gedurende 5 minuten elk.
    7. Incubeer secties in 3% waterstofperoxide in methanol gedurende 10 minuten om de endogene peroxidase-activiteit te blokkeren.
    8. Was de secties opnieuw 3 keer in PBS gedurende 5 minuten per keer.
    9. Om niet-specifieke binding van immunoglobuline te voorkomen, incubeert u secties gedurende 7 minuten met een UV-blokkerend reagens.
    10. Incubeer de coupes een nacht bij 4 °C met het primaire antilichaam anti-HIF-1α (verdunning 1:200).
    11. Was de secties 3 keer in PBS gedurende 5 minuten per keer.
    12. Breng gebiotinyleerd secundair antilichaam aan op secties en incubeer gedurende 40 minuten bij RT.
    13. Was de secties opnieuw 3 keer in PBS gedurende 5 minuten per keer.
    14. Breng streptavidineoplossing aan op de secties en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
    15. Was de secties 3 keer in PBS gedurende 5 minuten per keer.
    16. Ontwikkel de kleuringsreactie door 3,3'-diaminobenzidine (DAB) aan te brengen en onder een lichtmicroscoop te observeren.
    17. Bestkleur de secties met gemodificeerde Gill II-hematoxylineoplossing om de kernen te kleuren.
    18. Droogt secties uit door ze door toenemende concentraties ethanol (70%, 80%, 96% en 100% ethanol) te leiden.
    19. Wis de secties door ze elk 10 minuten te incuberen in Xyleen I- en Xyleen II-oplossingen.
    20. Monteer secties met een montagemedium en een dekglaasje.
    21. Onderzoek gemonteerde secties onder een lichtmicroscoop en beoordeel gebieden van de hippocampus en prefrontale cortex.
    22. Meet immunoreactiviteitsniveaus met behulp van open-source beeldverwerkingssoftware.

5. Gedragsexperimenten

  1. Laat de resterende muizen na bevestiging van hypoxie de lactatieperiode met hun moeder afmaken.
  2. Voer geslachtsbepaling uit op postnatale dag 21 op basis van anogenitale afstand en huisvest de dieren vervolgens in verschillende kooien op basis van hun geslacht. Wanneer de muizen in de hypoxische en schijncontrolegroepen de leeftijd van 2 maanden bereiken, onderwerp ze dan aan gedragsexperimenten.
  3. Voordat u gedragstests uitvoert, moet u de proefpersonen 15-30 minuten laten wennen aan de testomgeving voordat u gaat testen.
  4. Zorg ervoor dat u alle apparaten/apparaten tussen proefpersonen en proeven desinfecteert met 70% ethanol.
  5. Voer een nieuwe objectherkenningstest (NOR) uit.
    1. Zet de camera in een positie waarin onderwerpen duidelijk te zien en te volgen zijn.
    2. Installeer de juiste software voor het volgen van video's.
    3. Bereid de testarena voor (een doos van 60 cm × 60 × cm × doos van 40 cm) met twee voorwerpen die niet groter zijn dan de muis. Zorg ervoor dat de twee objecten van dezelfde grootte en vorm zijn en gemakkelijk toegankelijk zijn (10 cm × 10 cm afstand van de muren en parallel).
    4. Dag 1: Kennismakingsfase:
      1. Plaats de muis in de arena met de twee identieke objecten. Laat de muis de objecten gedurende een bepaalde tijd (bijv. 10 minuten) vrij verkennen.
      2. Observeer en registreer tijdens deze sessie de hoeveelheid tijd die de muis met elk object heeft doorgebracht. Noteer ook het aantal keren dat de muis naar elk object draaide of ermee omging
    5. Dag 2: Introductie van nieuwe objecten:
      1. Vervang een van de bekende objecten van dag 1 door een nieuw object (anders qua uiterlijk, textuur of vorm).
      2. Breng de muis terug naar de arena, zodat hij weer vrij kan verkennen voor dezelfde tijd als in de eerste sessie.
    6. Registreer de totale tijd die de muis heeft doorgebracht met het bekende object (vanaf dag 1) en het nieuwe object. Noteer het aantal keren dat de muis naar elk object draaide of er interactie mee had.
    7. Bereken de discriminatie-index (DI) om het geheugen en het leren van de muis te beoordelen met behulp van de formule:
      Discriminatie-index (DI) = {(Tijd doorgebracht met nieuw object − Tijd doorgebracht met bekend object)/(Totale tijd doorgebracht met beide objecten)} × 100.
      OPMERKING: Een hogere DI duidt op een grotere interesse in het nieuwe object, wat wijst op een beter geheugen en leervermogen. Een DI dicht bij 0 geeft geen voorkeur aan, wat wijst op gelijke interesse of een slecht geheugen voor het bekende object.
    8. Gebruik de DI om het leer- en geheugenvermogen van de muis objectief te beoordelen, op basis van zijn natuurlijke nieuwsgierigheid en het vermogen om bekende en nieuwe objecten te herkennen en te onderscheiden.
  6. Staartophangingstest (TST) uitvoeren
    1. Installeer de camera op een plek waar de muizen goed zichtbaar zijn en in de gaten kunnen worden gehouden. Installeer de juiste software voor het volgen van video's.
    2. Bereid de experimentele opstelling voor met ruimte om 3 muizen tegelijk te huisvesten.
    3. Gebruik 25 cm hoge kartonnen panelen met tussenpozen van 20 cm om de muizen te isoleren, zodat ze elkaar niet kunnen zien tijdens de test.
    4. Knip stroken tape van 12 cm lang af en bevestig ze voorzichtig aan de staart van elke muis, zodat de staart stevig vastzit zonder schade aan te richten. Plaats de tape aan het einde van de staart (2 cm) zodat de muis kan worden opgehangen zonder zichzelf te verwonden.
    5. Neem de muizen 6 minuten op terwijl ze hangen.
    6. Stop aan het einde van de duur de opname, verwijder de muis en plaats deze terug in de behuizingskooi. Analyseer de video's om de duur van actieve beweging en de duur van immobiliteit te bepalen.
      LET OP: Dit geeft inzicht in de stressreactie, aangezien immobiliteit vaak duidt op een staat van aangeleerde hulpeloosheid of stress. De mate van immobiliteit wordt vaak gebruikt om gedragswanhoop of stressrespons bij muizen te meten, die verband kan houden met de effecten van stress of depressieve toestanden.
    7. Beoordeel op basis van de waargenomen patronen van beweging en immobiliteit de emotionele toestand en stresscopingmechanismen van muizen als reactie op de gedwongen suspensie.
  7. Voer een marmerbegravingstest uit
    1. Vul een lege kooi (20 cm × 35 cm × 15 cm) met een maïskolf van 5 cm hoogte. Schik 20 knikkers in 5 rijen met elk 4 knikkers. Zorg ervoor dat de knikkers gelijkmatig over het oppervlak zijn verdeeld.
    2. Plaats het onderwerp in een hoek van de kooi en zorg ervoor dat u vrij toegang hebt tot de hele kooi.
    3. Geef de muis 20 minuten om de kooi te verkennen. Gedurende deze tijd kan de muis wat begraafgedrag vertonen en proberen de knikkers te bedekken met maïskolf. Haal na 20 minuten de muis uit de kooi.
    4. Tel het totale aantal knikkers dat de muis onder de maïskolf heeft begraven gedurende de periode van 20 minuten. Noteer het totale aantal begraven knikkers, want dit is de belangrijkste maatstaf voor gedrag.
      OPMERKING: Het aantal begraven knikkers wordt vaak gebruikt als een indicator van angst, dwangmatig gedrag of neofobie bij knaagdieren. Een hoger aantal begraven knikkers wordt vaak geassocieerd met hogere niveaus van angst of dwangmatige neigingen.
    5. Beoordeel op basis van het totale aantal begraven knikkers angstgerelateerd gedrag en dwangmatige neigingen bij muizen, die kunnen worden gebruikt om de effecten van behandelingen of experimentele aandoeningen te beoordelen.
  8. Voer een sociale interactietest uit.
    1. Installeer de camera op een plek waar de muizen goed zichtbaar zijn en in de gaten kunnen worden gehouden.
    2. Sluit de camera aan op de computer en stel de juiste videotrackingsoftware in. Zet een rechthoekige doos (60 cm × 40 cm × 25 cm) op met twee wanden (40 cm × 25 cm) met twee deuren (8 cm) om de drie kamers te scheiden.
    3. Plaats een kooi (15 cm × 10 cm) met daarin een muis die bekend is bij de proefpersoon en een andere kooi (15 cm × 10 cm) met daarin een muis die nog niet eerder interactie heeft gehad met de proefpersoon van het experiment.
    4. Begin met opnemen en plaats het onderwerp in het middelste vak.
      OPMERKING: Andere muizen dan de proefdieren die in deze test worden gebruikt, moeten van hetzelfde geslacht en gezond zijn.
    5. Houd het onderwerp 5 minuten in de gaten en neem het op met de videocamera. Stop aan het einde van de duur de opname, verwijder de muis en plaats deze terug in de behuizingskooi.
    6. Analyseer met behulp van SIT-software de sociale interactietijd en sociale nieuwigheidsneigingen van de muizen en vergelijk deze met de schijncontrolegroep.
      OPMERKING: Meer tijd besteed aan sociaal gedrag (bijv. verzorgen of snuiven) en minder tijd besteden aan het vermijden of vertonen van agressie kan worden geïnterpreteerd als een blijk van hoge gezelligheid. Het vermijden van interactie, meer tijd in afzondering doorbrengen of verhoogde agressie vertonen kan duiden op angst, sociale terugtrekking of een verminderd vermogen om sociaal met elkaar om te gaan.
  9. Voer een open veldtest uit.
    1. Plaats de camera op een plek waar de muizen duidelijk te zien en in de gaten kunnen worden gehouden. Sluit de camera aan op de computer en stel geschikte videotrackingsoftware in.
    2. Zet de testarena op (een doos van 60 cm × 60 cm × 40 cm) en verdeel de doos met denkbeeldige lijnen om 16 vierkanten te maken.
    3. Begin met opnemen en plaats de muis voorzichtig in het midden van de arena. Observeer en registreer het gedrag van de muis gedurende 5 minuten.
    4. Stop aan het einde van de duur de opname, verwijder de muis en plaats deze terug in de behuizingskooi.
    5. Meet met behulp van de volgsoftware het externe en interne gedrag van lopen, klimmen, ontsnappen, verzorgen, immobiliteit, totale oversteken, ontlasting en plassen om de niveaus van angst, motoriek, verkennende en emotionele activiteit van de proefpersonen te beoordelen.
  10. Voer de Morris water doolhof (MWM) test uit.
    1. Bereid het doolhof met een diameter van 120 cm en 60 cm diep in een gedragslaboratorium voor op 23 ± 1 °C.
    2. Verdeel het doolhof in vier denkbeeldige kwadranten en hang verschillende visuele aanwijzingen (in vorm en kleur) aan het midden van elk kwadrant van de doolhofwanden op ongeveer 20 cm van de basis. Plaats een platform van 17 cm lang en met een diameter van 10 cm op 20 cm van de muur.
      OPMERKING: Het doolhof, de aanwijzingen en het platform mogen niet van positie of locatie veranderen, zodat muizen hun geheugen nauwkeurig kunnen trainen.
    3. Vul het doolhof met water van 21-26 °C tot 1 cm onder het platform en beits het met een zwarte acrylverf voor meerdere oppervlakken.
      OPMERKING: In het geval dat andere muizenstammen worden gebruikt, moet het water worden gekleurd met een contrastkleur van de muizen om ze te kunnen volgen.
    4. Plaats de camera in een positie die het volledige beeld vastlegt en sluit deze aan op de MWM-software op de computer.
      OPMERKING: De platformplek moet in het programma worden toegewezen voor de vijfde proefdag.
    5. De test duurt 5 dagen met elk vier proeven. Begin de eerste vier dagen met opnemen en begin de proef door de proefpersoon elke dag voorzichtig in een ander kwadrant te plaatsen, met het gezicht naar de tankwand gericht.
    6. Wijs de locatie van het platform toe in het testschema van dag 5.
      OPMERKING: Dit voorkomt dat de proefpersonen een associatief geheugen vormen. Zorgvuldige plaatsing van de proefpersonen in het water en het handhaven van de juiste temperatuur is essentieel om te voorkomen dat externe stress wordt toegevoegd. Proefversies duren 5 minuten en eindigen automatisch wanneer (i) het platform is bereikt (ii) de tijdslimiet van 5 minuten is verstreken. In de loop van dagen moeten proefpersonen de locatie van het platform leren kennen en deze in minder tijd vinden.
    7. Verwijder op de vijfde dag het platform en plaats de muizen voorzichtig in een vierkant van het doolhof zoals eerder beschreven.
      OPMERKING: De proefperiode eindigt automatisch wanneer (i) de muis het platform vindt en betreedt, (ii) de tijdslimiet van 5 minuten verstrijkt. Gezonde proefpersonen moeten de locatie van het vorige platform vinden. De software berekent automatisch de tijd die de muis nodig had om het platform in elke proef te vinden en helpt bij het beoordelen van het korte- en langetermijngeheugen en het leervermogen van de proefpersonen.

6. Bevestiging van hypoxieschade bij volwassen muizen

  1. Nadat de gedragstest is voltooid, offert u de proefpersonen op door cervicale dislocatie.
  2. Verzamel hippocampusweefsel en bloedmonsters van 6 muizen van elke groep, inclusief de schijncontrolegroep, voor moleculaire analyse (sectie 7).
  3. Plaats de hersenen van de overige 4 muizen in een 10% formaldehyde-oplossing om de effecten van blootstelling aan hypoxie tijdens de neonatale periode op de morfologie van de hersenen van volwassenen te onderzoeken.
  4. Gebruik dezelfde techniek als eerder uitgelegd in sectie 4 om histologische analyse van volwassen muizenhersenen uit te voeren.

7. Totale RNA-isolatie uit volwassen fasemonsters

  1. Voeg 500 μL trizol toe aan elk weefselmonster en 500 μL bloed.
  2. Homogeniseer de monsters voor hersenweefsel met behulp van een spuit.
  3. Incubeer het mengsel 5 minuten bij RT.
  4. Voeg 200 μL chloroform toe aan elke buis en incubeer nog eens 5 minuten bij RT.
  5. Centrifugeren bij 12.000 g gedurende 20 minuten bij +4 °C.
  6. Breng de waterfase (RNA) voorzichtig over in een nieuwe steriele buis.
  7. Voeg isopropanol toe (verhouding 1:1 tot de waterige fase) en incubeer het mengsel een nacht. (een STOP-punt/ -20 °C).
  8. Centrifugeer de volgende dag 10 minuten bij 12.000 g bij +4 °C.
  9. Gooi het bovenstaande voorzichtig weg en voeg 1000 μL 75% ethanol toe aan de pellet.
  10. Centrifugeer 5 minuten bij 7.500 × g bij +4 °C.
  11. Herhaal de stap voor het wassen van ethanol twee keer.
    OPMERKING: als de pellet te klein is, is één wasbeurt voldoende.
  12. Gooi het bovenstaande weg en laat de pellet aan de lucht drogen bij RT.
  13. Zodra de pellet volledig droog is, resuspendeert u de pellet met 50 μL NFW en incubeert u deze 10-15 minuten op ijs bij +4 °C.
  14. Meet de RNA-concentratie spectrofotometrisch.
  15. Bewaar RNA-monsters bij -80 °C tot verdere analyse.

8. Complementaire DNA (cDNA) synthese

  1. Werk op een koelrek van +4 °C en bereid de RNA-monsters voor die zijn geïsoleerd uit bloed- en hersenweefsel.
  2. Bereid de gelabelde PCR-buisjes voor.
  3. Meng de reagentia van de cDNA-synthesekit volgens de instructies van de fabrikant.
  4. Bereid in totaal 14 μl van het reactiemengsel voor elk monster en verdeel het over de buisjes.
  5. Voeg 6 μL RNA-monster toe aan de mix.
  6. Voer cDNA-synthese uit in het PCR-apparaat volgens de temperatuur- en tijdsomstandigheden die door de fabrikant zijn gespecificeerd.
    OPMERKING: Het cDNA dat in dit stadium wordt gesynthetiseerd, kan tot verder gebruik bij -80 °C worden bewaard.
  7. Verdun het gesynthetiseerde cDNA in een verhouding van 1:5.
  8. Bewaar het verdunde cDNA bij -80 °C voor toekomstige qPCR-analyse.

9. Kwantitatieve real-time PCR voor miRNA (miR-19a-3p, miR-361-5p, miR-150-5p, miR-126-3p, miR-499a-5p en U6 klein nucleair RNA als normalisatiecontrole) expressie

  1. Ontwerp de primers voor elk miRNA (zie aanvullende tabel 2 voor sequenties).
  2. Bereid het PCR-reactiemengsel volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Doseer 14 μl van het reactiemengsel in elk putje van een PCR-plaat met 96 putjes.
  4. Voeg 6 μL van het 1:5 verdunde cDNA toe aan elk putje voor een totaal reactievolume van 20 μL.
  5. Voer PCR in tweevoud uit voor elk monster om variatie te minimaliseren door dit programma te volgen: Eerste denaturatie bij 95 °C gedurende 120 s, 45 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s, gloeien en amplificeren bij 56 °C gedurende 60 s, en analyse van de smeltcurve bij 60 °C gedurende 15 s, vervolgens bij 95 °C.
  6. Analyseer de resultaten met behulp van Ct-waarden (cyclusdrempel) en normaliseer de gegevens met behulp van de 2-ΔΔCt-methode .

10. Statistische analyse

  1. . Beoordeel de normaliteit van de gegevens met behulp van histogrammen, Q-Q-plots en de Shapiro-Wilk-test om miRNA-expressiegegevens te analyseren.
    1. Als de gegevens normaal worden verspreid, gebruik dan One-Way ANOVA.
    2. Als de gegevens niet normaal verdeeld zijn, pas dan de Kruskal-Walli-test, de student-t-test of de Mann-Whitney U-test toe.
  2. Gebruik bij het beoordelen van genderverschillen binnen elke groep de t-test van de student of de Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de verdeling van de gegevens. Statistische significantie wordt bepaald door een p-waarde van <0,05.
    OPMERKING: Alle analyses moeten worden uitgevoerd met behulp van geschikte statistische software. Hier wordt GraphPad Prism 8 gebruikt.
  3. Beoordeel de normaliteit van de gegevens met behulp van histogrammen, Q-Q-plots en de Shapiro-Wilk-test om de resultaten van gedragsexperimenten te analyseren.
    1. Als de gegevens normaal worden verspreid, gebruik dan een tweerichtings-ANOVA.
    2. Voor gegevens die normaal niet worden verspreid, voert u de Kruskal-Walli-test, Student's t-test of Mann-Whitney U-test uit.
    3. Beoordeel genderverschillen binnen elke groep met behulp van de t-test van de student of de Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de verdeling van de gegevens. Nogmaals, beschouw de resultaten als statistisch significant als de p-waarde < 0,05 is.
  4. Gebruik voor immunohistochemische analyses Two-Way ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest om vrouwelijke en mannelijke groepen te vergelijken.
  5. Gebruik de post-hoctest van Sidak om vrouwelijke en mannelijke groepen binnen elke hypoxie-aandoening te vergelijken. Statistische significantie wordt bepaald als de p-waarde < 0,05 is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In deze studie werden zwangere Balb/c-muizen blootgesteld aan hypoxische omstandigheden van 8% O2 (ernstig), 10% O2 (matig) en 12% O2 (mild) tijdens de bevalling, en de pasgeboren muizen werden gedurende 5 minuten onder deze hypoxische omstandigheden gehouden om modellen van milde, matige en ernstige neonatale hypoxie vast te stellen. De groep die werd aangeduid als de schijncontrolegroep werd onderworpen aan normoxische (21% O2) geboo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Perinatale hypoxie, een groot neonataal gezondheidsprobleem, kan moleculaire, cellulaire en neuronale veranderingen veroorzaken door kritieke ontwikkelingsprocessen te verstoren en is in verband gebracht met verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen, waaronder autismespectrumstoornis (ASS)1. Hoewel ernstige hypoxie uitgebreid is bestudeerd vanwege de onmiddellijke effecten, blijven de langetermijngevolgen van milde tot matige hypoxie tijdens de perinata...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Dankbetuigingen

Deze studie werd gefinancierd door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TÜBİTAK), en de auteurs danken Celalettin Göktaş (Transgene dierenfaciliteit) en de bioloog Selda Taşdemir (Gedragslaboratorium).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
(-20 °C) VriezerSiemens KD86NAWE0N
(+4 °C) BlokAntagen Biosciencehttps://antagen.net/product/384-well-pcr-plate-rack-cat-rkp384/
(+4 °C) KoelkastSiemens KD86NAWE0N
(-20 °C) BlokCleaver Sientifichttps://www.cleaverscientific.com/electrophoresis-products/coolcube-storage-rack/
Absoluut ethanolMerck1070172511
Ammonium acetaatSigma238074-500G
Analytische balans Adam EquipmentLAB214i
ChloroformMerck1024451000
Citroenzuur Merck100241
ComputerHPhttps://www.hp.com/us-en/shop/pdp/hp-all-in-one-24-cr1000t-238-9p2v3av-1
EDTASigmaE9884-1KG
Entellan Merck107961
EosineMerck109844
Ependorf (1,5 mL)?solab078.03.021
Ethovision systeemNoldushttps://noldus.com/ethovision-xt
EtuvNUVEEN 400/500 N/A
Falcon buizen (15 mL)Isolab078.02.001
FormaldehydeMerck104002
HittecameraSamsungSC2000
HematoxylinenMerck105175
HIF-1α antilichaamBiossbs-20398R 
Hypoxiakamers BiospherixA-Chamber
IsoproponalMerck1096342511
Light Cycler 480 IIRoche5015278001
Marmer Burying Test's KooiVishnu https://guide.labanimal.com/product/standard-housing-stainless-steel
Microcentrifuge buisjes (1,5 mL)Greiner616201
Micropipet tips (100 µL)Greiner774353
Micropipet tips (1000 µL)Greiner778353
Micropipetten (10 µL)GilsonFD10001
Micropipetten (100 µL)GilsonFD10004
Micropipetten (1000 µL)GilsonFD10003
Micropipet tips (10 µL)Greiner772353
Micropipetten(2 µL)GilsonGFAM00064
MicroscopieOlympusBx53
miRCURY LNA RT Kit (cDNA Synthese Kit)Qiagen339340
miRCURY LNA SYBR Green PCR KitQiagen339346
Multiwell platenRoche4729692001
Nano SpectrofotometerShimadzuC101-E112
Novel Object Recogniton Test's ArenaGlobal Biotech137
Open Field Test's ArenaGlobal Biotech117
Oxycycler BiospherixA42OC
Paraffine Leica 39602012
PBS TabletSigmaP4417-50TAB
PCR ApparaatSensoquestT3-0140
Plate SpinPeqlab91-PSPIN-P
PrismGraphPadhttps://www.graphpad.com/
Proteinase KSigmaP6556-10MG
QIAzol Lysis Reagens Isolatie ReagensQiagen79306
SDSSigma8170342500
Secondary Antilichaam AbcamA0545-1ML
Social Interaction Test's DriekamerGlobal Biotech118
SpinGilsonPMC880
Spuit (2 mL)Baybihttps://beybi.com.tr/urunler/medikal-urunler/medikal-sarf-malzemeleri/parcali-enjektorler
Tail Suspension Test's SetupZelf gemaakt, u kunt een vergelijkbaar vinden bij Harvard ApparatusZelf gemaakt, u kunt een vergelijkbaar vinden op (https://www.harvardapparatus.com/tail-suspension-test.html)
ThermomixerEppendorf#5355
Trizma baseSigma1503-1KG
VortexHeidolph541-10000-00-1
Xyleen Isolab 9,90,01,92,501

Referenties

  1. Bonkowsky, J. L., Son, J. -H. Hypoxia and connectivity in the developing vertebrate nervous system. Dis Model Mech. 11 (12), dmm037127(2018).
  2. Dunwoodie, S. L. The role of hypoxia in development of the mammalian embryo. Dev Cell. 17 (6), 755-773 (2009).
  3. Beck, S., et al. The worldwide incidence of preterm birth: a systematic review of maternal mortality and morbidity. Bull World Health Organ. 88 (1), 31-38 (2010).
  4. Milash, B., et al. Temporal dysynchrony in brain connectivity gene expression following hypoxia. BMC Genomics. 17 (1), 334(2016).
  5. Adachi, K., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters ovine fetal endocrine and physiological responses to hypotension. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 287 (1), R209-R217 (2004).
  6. Imamura, T., Umezaki, H., Kaushal, K. M., Ducsay, C. A. Long-term hypoxia alters endocrine and physiologic responses to umbilical cord occlusion in the ovine fetus. J Soc Gynecol Investig. 11 (3), 131-140 (2004).
  7. Fajersztajn, L., Veras, M. M. Hypoxia: from placental development to fetal programming. Birth Defects Res. 109 (17), 1377-1385 (2017).
  8. Ruas, J. L., Poellinger, L. Hypoxia-dependent activation of HIF into a transcriptional regulator. Semin Cell Dev Biol. 16 (4-5), 514-522 (2005).
  9. Mukandala, G., Tynan, R., Lanigan, S., O'Connor, J. J. The effects of hypoxia and inflammation on synaptic signaling in the CNS. Brain Sci. 6 (1), 6(2016).
  10. Lee, S., et al. Gene networks associated with non-syndromic intellectual disability. J Neurogenet. 32 (1), 6-14 (2018).
  11. Fattuoni, C., Palmas, F., Noto, A., Fanos, V., Barberini, L. Perinatal asphyxia: a review from a metabolomics perspective. Molecules. 20 (4), 7000-7016 (2015).
  12. Locci, E., et al. Exploring perinatal asphyxia by metabolomics. Metabolites. 10 (4), 141(2020).
  13. De Haan, M., et al. Brain and cognitive-behavioural development after asphyxia at term birth. Dev Sci. 9 (4), 350-358 (2006).
  14. Armstrong-Wells, J., Bernard, T. J., Boada, R., Manco-Johnson, M. Neurocognitive outcomes following neonatal encephalopathy. NeuroRehabilitation. 26 (1), 27-33 (2010).
  15. Gardener, H., Spiegelman, D., Buka, S. L. Prenatal risk factors for autism: comprehensive meta-analysis. Br J Psychiatry. 195 (1), 7-14 (2009).
  16. Hicks, S. D., Middleton, F. A. A comparative review of microRNA expression patterns in autism spectrum disorder. Front Psychiatry. 7, 176(2016).
  17. Cassidy, F. C., Charalambous, M. Genomic imprinting, growth and maternal-fetal interactions. J Exp Biol. 221 (Suppl_1), jeb164517(2018).
  18. Serocki, M., et al. miRNAs regulate the HIF switch during hypoxia: a novel therapeutic target. Angiogenesis. 21 (2), 183-202 (2018).
  19. Ozkul, Y., et al. A heritable profile of six miRNAs in autistic patients and mouse models. Sci Rep. 10 (1), 9011(2020).
  20. Siniscalco, D., et al. Autism spectrum disorders: is mesenchymal stem cell personalized therapy the future. J Biomed Biotechnol. 2012, 480289(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Neonatale hypoxiemicroRNA-dysregulatiegedragstestenMorris water mazeherkenning van nieuwe objectenknikkerbegraaftestsociale interactietestmarkers voor neurodegeneratievroege interventie
Hypoxie verandert de miRNA-niveaus die betrokken zijn bij niet-Mendeliaanse overerving van autismespectrumstoornis bij muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.