Beheer na levertransplantatie en monsterverzameling bij Daurische grondeekhoorns voor eencellige RNA-sequencing

Samenvatting

Dit protocol beschrijft procedures voor verlengde leveropslag en orthotope transplantatie bij de Daurische grondeekhoorn (DGS; Spermophilus dauricus), een typische seizoensgebonden overwinteraar. Het omvat methoden voor het oogsten van levertransplantaten en bloedmonsters voor prognostische evaluaties en het verwerken ervan voor onderzoeken op basis van één cel.

Samenvatting

Functioneel herstel van het transplantaat en immunocompatibiliteit van transplantaat en gastheer vertegenwoordigen belangrijke prognostische problemen na levertransplantatie. Cruciaal is dat conventionele knaagdiermodellen met ratten of muizen een beperkt inzicht bieden in de mechanismen van door onderkoeling geïnduceerde transplantaatletsels tijdens conservering. Deze kloof onderstreept de behoefte aan alternatieve modellen. Aangezien levertransplantaties van de koude-adaptieve Daurian grondeekhoorn (DGS; Spermophilus dauricus) kan langdurige koudebewaring ondersteunen en dus een hoge overlevingskans ondersteunen bij DGS's na transplantatie, daarom beschrijft dit protocol de essentiële postoperatieve dierenverzorging en fysiologische monitoring die nodig zijn voor getransplanteerde DGS-proefpersonen. Bovendien biedt het gestandaardiseerde procedures voor het voorbereiden van levertransplantaatmonsters van hoge kwaliteit voor stroomafwaartse analytische technieken, waaronder eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq) voor transcriptomische profilering en histopathologisch onderzoek. Het succesvol genereren van goed voorbereide DGS-transplantaatmonsters is de cruciale eerste stap bij het toepassen van zowel traditionele als geavanceerde methodologieën om dit onconventionele maar zeer relevante model te bestuderen. Dit protocol behandelt de multi-omische informatie voor DGS, waardoor toekomstig onderzoek naar chirurgische ingrepen en ziektemodellering wordt vergemakkelijkt, niet alleen bij knaagdieren in winterslaap, maar ook bij andere gespecialiseerde organismen.

Inleiding

In de afgelopen twee decennia hebben steeds meer onderzoekers erkend dat de superieure adaptieve capaciteiten van overwinterende soorten onschatbare mogelijkheden bieden om nieuwe mechanismen in biologische aanpassing bloot te leggen, en doorbraken kunnen inspireren op verschillende medische gebieden, zoals orgaanbehoud en metabole revalidatie 1,2,3,4,5,6,7,8 . Het eerste uitgebreide chirurgische protocol voor langdurige leverconservering van koude en orthotope transplantatie in een winterslaap, de Daurian grondeekhoorn (DGS; Spermophilus dauricus), is onlangs vastgesteld. Blijkbaar maakt het koude-adaptieve karakter van het DGS een langere koude opslag van de donortransplantaten en een hoge overleving na transplantatie van de ontvangende dieren mogelijk. Er is dus een vervolgprotocol nodig om het postoperatieve herstel van dieren te monitoren en monsters voor te bereiden voor verschillende histopathologische en omics-onderzoeken.

Gezien de significante fysiologische verschillen tussen de DGS's en de standaard knaagdiermodellen, en de complexe en dynamische fysiologische veranderingen na levertransplantatie bij de ontvangende dieren, is het verkrijgen van hoogwaardige monsters van hen cruciaal voor de stroomafwaartse analyses en dus voor het begrip van de transplantaat-gastheerfysiologie na transplantatie. Afgezien van het verkrijgen, verwerken en onderzoeken van bloed- en leverweefselmonsters met conventionele methoden, zou een succesvolle dissociatie van de leverparenchymale cellen die hepatocyten zijn, en de niet-parenchymale cellen (NPC's) die endotheelcellen, stellaatcellen, Kupffer-cellen en andere immuuncellen omvatten, de opheldering mogelijk maken van de complexe post-operationele cellulaire en moleculaire interacties met de zich snel ontwikkelende single-cell-based multi-omics. Daartoe is sinds het begin van de jaren 1950 de klassieke methode op basis van collagenaseperfusie ontwikkeld en voortdurend verfijnd ^9,10,11. Desalniettemin vereisen de duidelijke anatomische structuur van de DGS-lever, door vasculaire reconstructie geïnduceerde postoperatieve verklevingen en de door chirurgie veroorzaakte fysiologische veranderingen in de levertransplantaten allemaal een verfijning van de extractieomstandigheden.

Dit protocol biedt een gedetailleerde richtlijn voor postoperatieve behandeling en monsterafname in DGS's na levertransplantatie. Dit protocol maakt met name de isolatie van hepatocyten uit levertransplantaten met een hoge opbrengst en cellevensvatbaarheid mogelijk, en beschrijft de daaropvolgende verwerking van geïsoleerde hepatocyten voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq).

Protocol

Alle dierproeven werden goedgekeurd door het Institutional Committee for Animal Care and Use (LSC-WangSQ-2) van de Universiteit van Peking. De DGS's die in deze studie zijn gebruikt, werden in het laboratorium geproduceerd door zwangere vrouwelijke DGS'en die waren gevangen in het grasland van de stad Zhangjiakou. De dieren waren ongeveer 1-2 jaar oud op het moment van het experiment. DGS, zowel mannelijke als vrouwelijke, en met een gewicht tussen 180 g en 400 g, werden gebruikt als donoren en ontvangers. Het gewicht van de ontvanger was iets groter dan dat van de donor, met een verschil van minder dan 50 g. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Zorg na transplantatie

1. Huisvest de DGS's na levertransplantatie in een warme en schone omgeving onder een licht/donkercyclus van 12:12, met standaard laboratoriumvoer en water ad libitum.
2. Controleer dagelijks het lichaamsgewicht, beoordeel de incisie in de buik op bloedingen en observeer de mentale toestand en activiteitsniveaus van de ontvanger.
3. Onmiddellijk na de operatie dient u gedurende 3 dagen elke 12 uur een subcutane injectie van cefuroxim (16 mg/kg) en buprenorfine (0,05 mg/kg) toe.
4. Intramusculair injecteren tacrolimus (1 mg/kg) per dag tot 24 uur voorafgaand aan de weefseloogst.
   OPMERKING: Aangezien de DGS's voornamelijk afkomstig zijn van in het wild gevangen, blijven transplantatie-immunologische factoren niet te verwaarlozen. Transplantatie tussen DGS'en wordt beschouwd als allogene transplantatie (geen syngene transplantatie). Als het onderzoek immunologische factoren, zoals afstoting, moet uitsluiten, zorg er dan voor dat tacrolimus in de postoperatieve periode wordt gestandaardiseerd.

2. De voorbereiding van de levertransplantaatsteekproef

1. Bereiding van oplossingen en instrumenten
   1. Bereid 50 ml HBSS met 500 μM EGTA ( Ca²⁺- en Mg²⁺-vrij; pH 7,4). Voor gebruik voorverwarmen in een waterbad van 40 °C.
   2. Los Collagenase IV (0,4 mg/ml) op in 50 ml HBSS (met Ca²⁺ en Mg²⁺) en incubeer gedurende 30 minuten bij een waterbad van 40 °C.
   3. Percoll-oplossing: Meng Percoll met 10× PBS in een verhouding van 9:1 (v/v) en verdun met 1× PBS in een verhouding van 9:1 (v/v) in een tube van 15 ml. Bewaar de oplossing op ijs.
      OPMERKING: 5 ml 90% Percoll-oplossing is voldoende per DGS.
   4. Dompel chirurgische instrumenten voor gebruik 30 minuten onder in 70% ethanol.
   5. Stel het perfusiesysteem samen dat bestaat uit een peristaltische pomp met regelbaar toerental, silastische slangen en een waterbad. Spoel de slang met warme zoutoplossing om luchtbellen te verwijderen en bevestig een steriel filter van 0.22 μm aan de slanguitlaat.
      NOTITIE: Voorafgaand aan het spoelen van luchtbellen, is het noodzakelijk om de hergebruikte slang uit te spoelen door 70% ethanol gedurende 15 minuten grondig te laten draaien, gevolgd door een volledige spoeling met ddH₂O gedurende 15 minuten om resterende ethanol te verwijderen.
2. Procedure bij dieren
   1. Verdoof de DGS na transplantatie via intraperitoneale injectie van 2,5% tribroomethanol in een dosis van 1 ml/100 g lichaamsgewicht. Voer tests uit op verlies van reflexen, zoals reactie op teenbeknelling, om volledige anesthesie te garanderen.
   2. Scheer de buikvacht en houd de DGS vast op de operatietafel met de buikzijde naar boven.
   3. Spuit 70% ethanol over de buikstreek van het dier en open vervolgens de buikholte door met een scherpe schaar en tandtang een grote kruisincisie van de huid en het buikvlies te maken.
   4. Beweeg de darmen voorzichtig naar de rechterkant van de buikholte met een wattenstaafje totdat het levertransplantaat, de poortader (PV) en de vena cava inferior (IVC) duidelijk zichtbaar zijn (Figuur 1A).
      OPMERKING: Vanwege postoperatieve verklevingen in de buikholte na levertransplantatie, ontleed u de verklevingen voorzichtig met een vochtig wattenstaafje.
   5. Steek een spuit van 5 ml in het IVC onder de anastomosestoma om 1-2 ml bloed op te vangen en oefen onmiddellijk lichte druk uit op de prikplaats met een droog wattenstaafje om hemostase te bereiken nadat de naald uit het bloedvat is teruggetrokken (Figuur 1B).
      OPMERKING: Om bloedingen tot een minimum te beperken, kan de naald worden vervangen door een naald uit een spuit van 1 ml, wat neerkomt op ongeveer 30 G.
   6. Prik de PV voorzichtig met een 22-G-katheter in een hoek van 15° ten opzichte van het vaatoppervlak, gevolgd door het terugtrekken van de naald van de katheter. Zodra de succesvolle punctie is bevestigd, schuift u de canule voorzichtig nog eens 1-1,5 cm door het bloedvat. Zet de positie van de canule vast met behulp van een vasculaire clamp (Figuur 1C).
      OPMERKING: Als de canule correct is geplaatst, is er een terugstromende bloedstroom zichtbaar. Als de PV-canulatie mislukt of technische problemen ondervindt, schakel dan over op het canuleren van de infrahepatische IVC en wijs de PV aan als de perfusaatuitstroomroute.
   7. Start de perfusiepomp met warme zoutoplossing met 6-8 ml/min en sluit vervolgens het bovengenoemde filter van 0.22 μm aan op de canule.
   8. Zodra de perfusie via PV is gestart, maakt u een incisie in de IVC om bloedafvoer mogelijk te maken. 50-80 ml zoutoplossing is nodig voor voldoende perfusie (Figuur 1D).
      OPMERKING: Succesvolle perfusie wordt bevestigd wanneer de getransplanteerde lever tijdens dit proces overgaat in een bleke geelwitte kleur. Sommige donkerrode congestiegebieden kunnen op het leveroppervlak achterblijven en kunnen niet volledig worden verwijderd, waarschijnlijk als gevolg van intraoperatief levertrauma zoals ischemie-reperfusieschade.
   9. Na voldoende perfusie met 50-80 ml warme zoutoplossing, pauzeert u de pomp.
   10. Ligate de linker laterale kwab aan de basis met behulp van 2-0 zijden hechtdraad, gevolgd door excisie van de lob distaal van de ligatieplaats. Evenzo wordt de mediaankwab aan de basis geligeerd en volgens dezelfde methode verwijderd (Figuur 1E,F).
       OPMERKING: Gedeeltelijke hepatectomie wordt uitgevoerd om het gebruik van de getransplanteerde lever voor meerdere experimentele doeleinden te maximaliseren en om het verbruik van collagenasebuffer te verminderen en tegelijkertijd een grondige spijsvertering van de lever te vergemakkelijken.
   11. Verdeel het gereseceerde leverweefsel in verschillende stukken: een deel wordt gebruikt voor NPC-isolatie gevolgd door scRNA-seq, de andere delen worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde voor histologische secties, of ingevroren in vloeibare stikstof voor andere experimenten.
       OPMERKING: Stap 2.2.11 kan door een andere persoon gelijktijdig met de volgende stappen worden uitgevoerd om tijd te besparen.
   12. Isolatie van NPC's. Snijd de weefsels in ongeveer 1-2 mm³ stukken in het RPMI-1640-medium en enzymatisch verteerd met gentleMACS volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel). De levensvatbaarheid van de cellen en de celconcentratie werden bepaald met behulp van een geautomatiseerde celteller.
       OPMERKING: Stap 2.2.12 en stappen 2.2.13-2.3.5 gaan gelijktijdig verder.
   13. Snijd het middenrif door en klem de suprahepatische IVC vast (Figuur 1G).
   14. Breng de inlaatslang over naar de voorverwarmde EGTA-buffer. Start de pomp opnieuw op met een snelheid van 6-8 ml/min.
   15. Klem de IVC regelmatig gedurende 5-10 s vast om een gelijkmatige verdeling van de perfusieoplossing door het leverparenchym te vergemakkelijken. De lever zwelt zichtbaar op tijdens het afklemmen en ontspant bij het loslaten.
       OPMERKING: Het is van cruciaal belang om langdurige onderbreking van de afvoer te vermijden, aangezien langdurige verstopping het risico loopt het dunne bindweefsel rond de lever te scheuren en de perfusie of vloeistofdynamica in het capillaire leverbed te verstoren. Bovendien kan aanhoudende obstructie de levensvatbaarheid van de cel in gevaar brengen en de opbrengst verminderen als gevolg van de gevoeligheid van de hepatocyten voor mechanische krachten.
   16. Na perfusie met 40-50 ml EGTA-oplossing, start u de collagenasebufferperfusie met een snelheid van 4-6 ml/min gedurende 8-10 minuten. Klem het effluentbloedvat kort vast zoals in de bovenstaande stappen (Figuur 1H).
       OPMERKING: Na 5-6 minuten collagenaseperfusie wordt de lever merkbaar zachter en verschijnen er kloven aan het oppervlak. Als deze morfologische veranderingen afwezig zijn, verlaag dan de perfusiesnelheid tot 3-4 ml/min en verleng de totale verteringstijd tot 12-13 min. Na voltooiing van 50 ml collagenaseperfusie vertoont de lever een brokkelige, tofu-achtige consistentie, wat een indicator is van voldoende spijsvertering (Figuur 1I).
   17. Stop de pomp en verwijder de canule. Snijd de lever af van het lichaam, plaats deze in een schaal van 5 cm met 10 ml ijskoude DMEM/F12 medium.
3. Zuivering van hepatocyten
   1. Scheur de lever open om cellen vrij te maken en breng de celoplossing over in een conische 50 ml met een filter van 70 μm eroverheen.
   2. Nadat de celsuspensie gedurende 3 minuten bij 4 °C bij 50 x g is gecentrifugeerd, wordt het bovenstaande weggegooid en wordt de pellet opnieuw gerusticeerd met 20 ml 1× PBS. Herhaal deze stap 3 keer. Resuspendeer de celpellet met 5 ml DMEM/F12-medium na de laatste centrifugatie.
   3. Meng de celsuspensie voorzichtig met een gelijk volume van 90% Percoll-oplossing in een tube van 15 ml. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Na Percoll-centrifugatie valt het mengsel uiteen in drie verschillende lagen: de bovenste laag (ongeveer 0,5-1 ml) bevat dode cellen, terwijl levensvatbare hepatocyten geconcentreerd zijn in de onderste laag (ongeveer 0,5-0,8 ml) (Figuur 2). Met dit protocol wordt doorgaans een opbrengst van 5-8 × 10,⁷ levensvatbare hepatocyten met een levensvatbaarheid van >80% verkregen. (Figuur 3A,B).
   4. Zuig de dode cellen en het bovenstaande zorgvuldig op, vermijd krachtige verstoring van de lagen, en breng de levensvatbare cellen opnieuw in suspensie met 10 ml DMEM/F12-medium. Centrifugeer bij 50 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
   5. Gooi het bovenstaande weg en suspendeer de gezuiverde hepatocyten met 1-5 ml 1× PBS aangevuld met 2% foetaal runderserum tot een uiteindelijke concentratie van 500-1200 cellen/μl.
   6. Meng de hepatocyten en NPC's in een verhouding van 1:1 van de hoeveelheid, d.w.z. de celsuspensie werd bereid door 10.000 hepatocyten en 10.000 NPC's te mengen.
4. ScRNA-seq
   OPMERKING: Stappen 2.4.1-2.4.3 zijn uitgevoerd volgens de gebruikershandleiding van de op druppels gebaseerde singlecell 3′ genexpressiebibliotheekvoorbereidingskit¹². Er werd gebruik gemaakt van het op druppels gebaseerde microfluïdische singlecell-partitionerings- en barcoderingsplatform, dat kritieke stappen omvat voor het genereren van gelkralen-in-emulsies (GEM), de constructie van de cDNA-bibliotheek en Illumina-sequencing volgens standaardprotocollen.
   1. Om GEM-generatie en barcodering uit te voeren, gebruikt u een celsuspensie met 20.000 hepatocyten en NPC's. De efficiëntie van het afvangen van cellen is maar liefst 60%.
   2. Schoon voor cDNA-amplificatie de post-GEM-RT-monsters op volgens de gebruikershandleiding¹².
   3. Bibliotheek constructie
   4. Sequentie single-cell RNA-bibliotheken met behulp van een sequencingplatform om een diepte van 150 Gb per monster te bereiken; Demultiplex onbewerkte basisaanroepbestanden in FASTQ-bestanden met behulp van Cell Ranger (v8.0.0).
   5. Lijn FASTQ-bestanden uit met het genoom van Ictidomys tridecemlineatus (NCBI-toetreding: GCF_016881025.1) voor kwantificering van expressie, waarmee de experimentele workflow wordt voltooid.

Resultaten

Histologisch onderzoek van transplantaten die gedurende 24 uur bij 4 °C werden bewaard en in DGS waren getransplanteerd, toonde een normale structuur van de leverlobben met minimale tekenen van ontsteking, necrose of cholestase op postoperatieve dag 3 en 6, vergelijkbaar met de schijnoperatieve groep (Figuur 4A-C).

De isolatie van primaire hepatocyten uit het postoperatieve DGS duurt ongeveer 1 uu...

Discussie

Volgens het protocol dat de conservering en transplantatie van donorleververkoudheid in DGS's beschrijft, beschrijven de hier beschreven procedures de postoperatieve monitoring en op maat gemaakte farmacologische behandeling van DGS's die zijn getransplanteerd met een lever die ten minste 24 uur koud is bewaard. Dit protocol maakt het mogelijk om de ontvanger langer dan 7 dagen na de transplantatie te laten overleven, waarbij duidelijke voordelen van de overwinteraars als onderzoeksmodel...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1× PBS	Servicebio	G4202
10× PBS	Servicebio	G4207
4% Paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Buprenorphine	Shafei	H12020276
Cannula (22 G)	BBRAUN	4254090B
Cefuroxime	Selleck	E4838
Cell culture dish (60 mm)	NEST	705001
Collagenase IV	Sigma-Aldrich	C5138
Conical tube (15 mL)	NEST	601052
Conical tube (50 mL)	NEST	602052
Cotton swab	Home supply store
Countstar Automated Cell Counte	Ruiyu	Countstar Rigel S2
DMEM/F12	Gibico	C11330500BT
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378
FBS	Gibco	10099-141
Filter (0.22 μm)	Merck Millipore	SLGP033RB
Filter (70 μm)	Biologix	15-1070
gentleMACS	Miltenyi	130-093-235
HBSS (with Ca2+ and Mg2+)	Servicebio	G4204
HBSS (without Ca2+ and Mg2+)	Servicebio	G4203
NPCs dissociation kit	Miltenyi	130-096-730
Percoll	Cytiva	17-0891-09
Peristaltic pump	Yuyan	BT100
RPMI-1640	Gibico	C11875500BT
Saline	SRB	SRB009
Sequencer	Illumina	NovaSeq X Plus
Silastic tubing	Tygon	E-3603
Silk suture	ETHICON	SA845G
Syringe (1mL)	Lige Science	LG05-124	Alleen de naald van de spuit is nodig
Syringe (2mL)	Lige Science	LG05-124	Alleen de cilinder van de spuit is nodig
Tacrolimus	Selleck	S5003
Transfer pipet	Biologix	30-0138A1
Tribromoethyl alcohol	Sigma-Aldrich	T48402
Water bath	Grant	SAP2