Snelle diagnose van Mycobacterium tuberculosis-infectie en resistentie tegen geneesmiddelen op basis van real-time fluorescentie-PCR

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het detecteren van Mycobacterium tuberculosis en zijn resistentie tegen geneesmiddelen met behulp van real-time fluorescentie kwantitatieve PCR (qPCR) technologie.

Samenvatting

Tuberculose (tbc) is een groot gezondheidsprobleem dat kwetsbare bevolkingsgroepen onevenredig treft. De opkomst en verspreiding van resistente tuberculose vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde volksgezondheid. Traditionele diagnostische methoden voor Mycobacterium tuberculosis (MTB), zoals uitstrijkjesmicroscopie en kweek, hebben aanzienlijke beperkingen en resulteren vaak in vertraagde klinische behandeling. Om deze uitdaging aan te gaan, werd een efficiënt diagnostisch schema ontwikkeld op basis van real-time fluorescerende PCR. Hoogwaardige MTB-nucleïnezuren kunnen uit testmonsters worden geëxtraheerd en de resistentiestatus kan worden geïdentificeerd op belangrijke resistentieplaatsen. In vergelijking met traditionele methoden verkort deze aanpak de detectietijd aanzienlijk tot slechts enkele uren, waardoor de infectie- en resistentiestatus kort na het eerste bezoek van een patiënt kan worden bepaald. De detectiegevoeligheid is hoger dan 85% en de specificiteit bereikt 95%. Deze niet-invasieve technologie minimaliseert niet alleen het ongemak voor de patiënt, maar ondersteunt ook een nauwkeurige diagnose in medische instellingen aan de basis vanwege de lage kosten en hoge efficiëntie. Over het algemeen betekent de aanpak een aanzienlijke verbetering in de tbc-diagnostiek.

Inleiding

Tuberculose (tbc), een chronische infectieziekte veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis (MTB), behoort tot de top tien van wereldwijde doodsoorzaken¹. Resistente tuberculose (DR-TBC) vormt een grote uitdaging voor de inspanningen om tuberculose tegen te gaan. Het actieplan voor het opbouwen van tbc-vrije gemeenschappen (2022-2027), uitgegeven door het Chinese Center for Disease Control and Prevention (China CDC), benadrukt de noodzaak van vroege screening op resistentie tegen geneesmiddelen bij alle bacteriologisch bevestigde longtuberculosepatiënten². Het pleit voor de toepassing van nieuwe moleculaire diagnostische technologieën om de detectiemogelijkheden van DR-TB te verbeteren, diagnostische tijdlijnen te verkorten, de identificatie van DR-TB-gevallen te maximaliseren, gestandaardiseerde behandeling en beheer te garanderen en de nodige infectiebeheersingsmaatregelen te implementeren³. Bovendien verplicht de Mededeling over de versterking van de preventie en bestrijding van DR-tbc (nr. 4, 2023) de landelijke bevordering van geavanceerde diagnostische technieken. Het dringt aan op tijdige resistentiescreening voor alle bacteriologisch bevestigde tbc-patiënten om universele screening te bereiken, diagnostische standaardisatie te verbeteren en de toegankelijkheid van de gezondheidszorg te verbeteren⁴.

DR-TB verwijst naar tbc-gevallen die resistent zijn tegen ten minste één anti-tbc-medicijn. De huidige classificaties omvatten rifampicine-resistente (RR), mono-resistente, polyresistente, multiresistente (MDR), pre-extensief geneesmiddelresistente (pre-XDR) en extensief geneesmiddelresistente (XDR) TBC. Een wereldwijde meta-analyse van de epidemiologie van DR-TB onthult alarmerende resistentiepercentages: MDR-TB met 11,6%, isoniazideresistentie met 15,7%, rifampicineresistentie met 9,4% en monoresistentie met 11,8%. Deze gegevens onderstrepen de ernst en complexiteit van DR-TB⁵.

Rifampicine en isoniazide zijn hoekstenen voor de behandeling van tuberculose. De Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) merkt echter op dat er weliswaar snelle diagnostische technologieën voor rifampicineresistentie beschikbaar zijn, maar dat analoge hulpmiddelen voor isoniazideresistentie ontbreken. Deze kloof belemmert de tijdige diagnose van multiresistente tuberculose (MDR-tbc). De voorlopige definitie van "rifampicine-resistente tuberculose" weerspiegelt deze diagnostische beperking en benadrukt het onvoldoende vermogen om snel resistentie tegen andere geneesmiddelen te detecteren ^6,7. De WHO schat dat gevallen van isoniazide-resistente tuberculose twee keer zo vaak voorkomen als gevallen van rifampicine-resistente gevallen. Exclusief vertrouwen op rifampicineresistentiescreening riskeert isoniazide-monoresistente TB (Hr-TB) over het hoofd te ^zien8. Onopgemerkte HR-tbc-patiënten die met standaardregimes worden behandeld, lopen een verhoogd risico op falen van de behandeling, terugval en progressie naar MDR-tbc⁹. Ethambutolresistentie is ook zorgwekkend. Als cruciaal medicijn voor de behandeling van tuberculose en MDR-tbc, rapporteerde China's DR-TB-basisonderzoek uit 2017 ethambutolresistentiepercentages van 4,9% in nieuwe gevallen en 17,2% in gevallen van herbehandeling¹⁰.

Op dit moment is voor de detectie van geneesmiddelresistentie van resterende tuberculose kunstmatige cultuur in sommige laboratoria nog steeds de voorkeursmethode, maar real-time fluorescerende PCR-technologie is superieur aan conventionele methoden bij het detecteren van geneesmiddelresistentie van tuberculose: detectie en kwantificering: real-time fluorescerende PCR biedt nauwkeurige kwantitatieve analyse door real-time monitoring van fluorescerende signalen, terwijl conventionele methoden deze nauwkeurigheid missen. Traditionele experimentmethoden zijn tijdrovend en arbeidsintensief, vereisen opgeleid personeel en zijn zeer subjectief. Integendeel, real-time PCR legt fluorescerende sondes en signalen vast via de computer, waardoor menselijke fouten worden geminimaliseerd. Conventionele gegevensanalysemethoden zijn subjectiever, terwijl real-time PCR nauwkeurige en objectieve analyses bereikt door middel van amplificatiecurves, standaardcurves en andere analysemethoden. Deze vooruitgang maakt real-time fluorescerende PCR de voorkeursmethode voor het detecteren van geneesmiddelresistentie van tuberculose¹¹.

Samenvattend is resistente tuberculose (DR-TBC) naar voren gekomen als een wereldwijde crisis. Resistentie tegen belangrijke geneesmiddelen - isoniazide, rifampicine en ethambutol - bemoeilijkt de inspanningen om tuberculose onder controle te houden. Tijdige en nauwkeurige detectie van resistentie tegen geneesmiddelen is cruciaal voor het begeleiden van op maat gemaakte behandelingsregimes, het verbeteren van therapeutisch succes en het verminderen van de dreiging van DR-tbc.

Om de diagnostische uitdaging aan te gaan, gebruikte deze studie een kit die Mycobacterium tuberculosis kan identificeren en geneesmiddelresistente mutaties binnen 3,5 uur kan detecteren met behulp van sputummonsters. Dit werd bereikt met behulp van real-time fluorescentie qPCR. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en nauwkeurig, waardoor het een waardevol hulpmiddel is in de strijd tegen DR-TB.

Protocol

Dit onderzoek is goedgekeurd door de ethische commissie van het Fifth Division Hospital van Xinjiang Production and Construction Corps; Het ethische nummer is LLWYH2025001 en er is geen ethisch conflict. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Afname van monsters

1. Gebruik internationaal gestandaardiseerde sputumflessen met schroefdop die worden aanbevolen door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO), of verzegelde plastic dozen en dozen van vetvrij papier om sputummonsters te verzamelen.
2. Label de sputumcontainers met de naam van de patiënt, het nummer (het poliklinische volgnummer voor nieuwe patiënten of het registratienummer voor vervolgpatiënten), onderzoeksitems en de volgnummers van de container 1, 2, 3 (1 = onmiddellijk sputum op dezelfde dag, 2 = nachtsputum, 3 = ochtendsputum de volgende dag). Voor patiënten zonder sputum, verzamel monsters door middel van aërosol-geïnduceerde sputumverzameling.
   OPMERKING: Het personeel moet de kwaliteit van de verzamelde sputummonsters evalueren. Het monstervolume moet over het algemeen op 3-5 ml worden gehouden. Gekwalificeerde monsters zijn onder meer droog sputum, bruin met bloed bevlekt sputum, sputum met een kleine hoeveelheid vers bloed of slijmsputum. Niet-gekwalificeerde monsters, zoals speeksel, moeten na verdere richtlijnen opnieuw worden ingediend voor testen.

2. Voorbehandeling van sputum

1. Voeg 1-2 keer het volume van 4% NaOH-oplossing toe aan de sputumcontainer op basis van het volume van het verzamelde sputum. Schud en meng de inhoud gedurende 2 min.
2. Plaats de container gedurende 15 minuten in een bioveiligheidskast bij kamertemperatuur en schud hem gedurende deze periode meerdere keren om een volledige vloeibaarmaking van het sputum te garanderen.
   OPMERKING: Ga voorzichtig om met NaOH vanwege de bijtende aard. Als het sputum niet volledig vloeibaar is, verleng dan de schudtijd. Deze stap is vooral belangrijk tijdens het hele experiment.

3. Preparaat van reagens (pre-PCR-gebied)

1. Bereiding van reagentia: Bereid reagentia in de daarvoor bestemde pre-PCR-ruimte. Ontdooi bevroren reagentia tot kamertemperatuur. Vortex voor 5-10 s. Centrifugeer bij 3000 × g gedurende 5-10 s bij kamertemperatuur.
   OPMERKING: Dit reagens is een duaal systeem (A/B) en moet afzonderlijk worden bereid.
2. Bereiding van PCR-mastermix
   1. Mix A: Combineer in een microcentrifugebuisje van 1,5 ml (n + 3) × 19,6 μL RIF PCR Mix A en (n + 3) × 0,4 μL TB-enzym. Vortex voor 5-10 s. Centrifugeer bij 3000 × g gedurende 5-10 s bij kamertemperatuur (PCR Mix A: 60 μL).
   2. Meng B: Combineer in een andere microcentrifugebuis van 1,5 ml (n + 3) × 19,6 μl RIF PCR Mix B en (n + 3) × 0,4 μl tbc-enzym. Vortex en centrifuge zoals hierboven (PCR Mix B: 60 μL).
3. Opslag en gebruik: Bewaar de voorbereide mastermixen bij ≤-18 °C. Indien niet onmiddellijk gebruikt, binnen 4 uur gebruiken.
   OPMERKING: Hetzelfde protocol is van toepassing op EMB- en INH-reagentia.
4. Aliquoting PCR-mastermix: Doseer 20 μL PCR Mix A en Mix B in afzonderlijke PCR dunwandige reactiebuisjes. Breng de gedoseerde buisjes in verzegelde zakken over naar de extractieruimte.

4. Nucleïnezuurextractie en laden van monsters (extractiegebied)

1. Centrifugeer 1,2 ml volledig vloeibaar gemaakt sputum bij 15.058 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande weg en bewaar de korrel. Optioneel: Centrifugeer het gehele verteerde monster als de apparatuur dit toelaat.
2. Resuspendeer de pellet in 1,2 ml zoutoplossing, vortex en centrifugeer bij 15.058 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal deze wasstap drie keer.
3. Voeg 250 μL TB extractiebuffer toe aan de pellet. Vortex en voer thermische lyse uit bij 99 °C gedurende 10 minuten. Koel af tot kamertemperatuur. Centrifugeer bij 15.058 g × g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en verzamel het bovenstaande (geëxtraheerde monster).
   OPMERKING: Verhoog voor viskeuze monsters het volume van de vloeibaarmakingsbuffer of verleng de vortextijd. Als monsters uitsluitend voor DNA-extractie zijn, verleng dan de vloeibaarmakingstijd om een volledige spijsvertering te garanderen.
4. Voeg met behulp van een micropipet 5 μl geëxtraheerd monster of negatieve/positieve controles toe aan elke dunwandige PCR-reactiebuis. Sluit de tubes onmiddellijk af en label ze op de juiste manier.
5. Vortex geladen PCR-buisjes gedurende 5-10 s en centrifugeren kort (5-10 s). Breng de buisjes over naar het PCR-amplificatiegebied.

5. PCR-amplificatie (amplificatiegebied)

OPMERKING: Programma's voor de detectie van resistentie tegen rifampicine, ethambutol en isoniazide werden ingesteld op een Hongshi thermische cycler (Tabel 1, Tabel 2 en Tabel 3). Fietsvoorwaarden zijn inbegrepen.

1. Plaats de geladen PCR-dunwandige reactiebuizen in de thermische cycler voor versterking.
2. Toegang tot de cycler-interface. Klik op Experiment Wizard en selecteer het experimenttype als Standaard Smeltcurve (zoals weergegeven in Afbeelding 1).
3. Klik op Plate Editor, selecteer horizontaal twee aangrenzende lege putjes en wijs het bijbehorende medicijnsjabloon toe in het rechterpaneel om één monster te definiëren (zoals weergegeven in afbeelding 2).
4. Configureer negatieve/positieve controles en voorbeeldinformatie. Klik op Start om het programma te starten. De speelduur is 2 uur en 22 min.
5. Breng na voltooiing de dunwandige PCR-reactiebuisjes (verzegeld) over in een verzegelde zak. Zet de sluiting vast en behandel deze als biologisch gevaarlijk afval.
6. Klik op Analyseren op de Thermal Cycler om de gegevens te verwerken.
   OPMERKING: De detectielimieten van deze methode zijn als volgt: Samengestelde groep: 10 bacteriën/ml; Rifampicine: 20.000 bacteriën/ml; Isoniazide: 10.000 bacteriën/ml; Ethambutol: 10.000 bacteriën/ml. (De gegevens van de detectielimiet (LoD) zijn afgeleid van de statistische analyse van 765 klinische gevallen in de instructiehandleiding van het reagens.)

6. Interpretatie van het resultaat

1. Bepaal mutaties door de verschillen in smelttemperatuur (Tm) tussen testmonsters en positieve controles te vergelijken.
   OPMERKING: Wildtype (geneesmiddelgevoelig): De Tm-waarden van het monster komen overeen met de positieve controle in alle vier de kanalen (afwijking ≤1 °C). Mutant (resistent tegen geneesmiddelen): De Tm-waarde in elk kanaal is ≥2 °C lager dan de positieve controle (ΔTm ≥2 °C).

Resultaten

Deze studie maakte gebruik van real-time fluorescentie-PCR en smeltcurve-analyse om sputummonsters van 17 tuberculosepatiënten te testen. Bovendien ondergingen 30 patiënten rifampicineresistentietesten en werden 20 getest op resistentie tegen isoniazide en ethambutol. De real-time fluorescentie PCR-methode toonde een positief detectiepercentage van 88,2% aan voor het Mycobacterium tuberculosis-complex .

Discussie

De opkomst van resistente Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC)-stammen op wereldschaal heeft de behandeling van tuberculose (tbc)-patiënten aanzienlijk bemoeilijkt. Met name multiresistente (MDR) en extensief resistente (XDR) tuberculose vormen een formidabele uitdaging voor de bestrijding van tuberculose¹². Snelle detectie van geneesmiddelresistentie is cruciaal voor het ontwerpen van geschikte behandelingsregimes, het voorkomen van therapeutisch fa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
High speed centrifuge
Lysis Buffer	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.	24110701
Mycobacterium tuberculosis Ethambutol Resistance Mutation Detection Kit	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.	24030801
Mycobacterium tuberculosis Isoniazid Resistance Mutation Detection Kit	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.	24011101
Mycobacterium tuberculosis Rifampicin Resistance Mutation Detection Ki	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.	24031001
SLAN-96P Real-Time PCR System	Shanghai Hongshi Medical Technology Co., Ltd.	SLAN-96P
Sputum Processing Solution	Xiamen Zhishan Biotechnology Co., Ltd.	24110701
TopPette Pipettor