Dit protocol maakt het mogelijk om binnen 6-8 uur voldoende primaire chondrocyten te isoleren, waardoor verder diepgaand onderzoek naar de kraakbeenbiologie en kraakbeenziektemechanismen mogelijk wordt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dit protocol maakt het mogelijk om binnen 6-8 uur voldoende primaire chondrocyten te isoleren, waardoor verder diepgaand onderzoek naar de kraakbeenbiologie en kraakbeenziektemechanismen mogelijk wordt.
Vernietiging van gewrichtskraakbeen leidt tot veranderde activiteit van chondrocyten, wat een belangrijke oorzakelijke factor is bij een verscheidenheid aan kraakbeenaandoeningen, waaronder artrose (OA) en reumatoïde artritis (RA). Als het meest voorkomende celtype in kraakbeen, is een diepgaande studie van de biologische eigenschappen van chondrocyten essentieel voor de ontwikkeling van effectieve strategieën voor de behandeling van ziekten. Isolatie en kweek van primaire chondrocyten leveren belangrijk experimenteel materiaal voor het onderzoek naar kraakbeenaandoeningen en dragen bij aan het ontrafelen van de mechanismen van kraakbeenbeschadiging en -herstel. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de in vitro isolatie- en kweekmethoden voor primaire chondrocyten afkomstig van muizen. Door gebruik te maken van het geoptimaliseerde collagenase II-protocol kan de isolatie van chondrocyten binnen 8 uur worden voltooid voor neonatale kraakbeenmonsters van het kniegewricht van muizen. De celopbrengst is ongeveer 1-2 × 10³ cellen/mg kraakbeenweefsel, variërend afhankelijk van de versheid van het weefsel en de initiële celdichtheid; De geïsoleerde cellen vertonen een levensvatbaarheid van >90%. Dit protocol gebruikt primaire chondrocyten van muizen als voorbeeld, en toont de morfologische kenmerken en adhesiestatus van cellen die gedurende 1, 2 en 5 dagen na isolatie zijn gekweekt. Reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) en western blotting toonden aan dat behandeling met interleukine-1β (IL-1β) collageen type II alfa 1 (Col2a1) verminderde en de expressie van matrix metallopeptidase 13 (Mmp13) verhoogde, wat bevestigt dat geïsoleerde chondrocyten reageren op inflammatoire stimuli. In vergelijking met conventionele methoden maakt dit protocol gebruik van een hogere collagenaseconcentratie om de impact van langere isolatietijd op de levensvatbaarheid van cellen te verminderen, terwijl mogelijke celbeschadiging door behandeling met trypsine wordt vermeden. De verkregen primaire chondrocyten zijn zuiver en levensvatbaar, geschikt voor diepgaande studies naar mechanismen die verband houden met kraakbeenletsel, die belangrijke implicaties hebben voor in vitro onderzoek en de klinische behandeling van kraakbeenaandoeningen.
Vernietiging van gewrichtskraakbeen is een belangrijke oorzaak van verschillende kraakbeenaandoeningen, zoals artrose en RA 1,2. Chondrocyten, het overheersende celtype in kraakbeen, zijn essentieel voor het behoud van de homeostase en het vergemakkelijken van herstel als reactie op letsel3. Veranderingen in de activiteit van chondrocyten beïnvloeden niet alleen de structurele integriteit van kraakbeen, maar veroorzaken ook ontstekingsreacties en progressieve weefseldegeneratie4. Daarom is een diepgaand onderzoek naar de biologis....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Xi'an Honghui-ziekenhuis (nr. 202309009) en de experimentele procedures hielden zich strikt aan de 3R-principes van vervanging, vermindering en verfijning voor dierproeven.
Figuur 1A illustreert een schematisch diagram van de bereiding van reagentia en apparatuur. De Materiaaltabel bevat informatie over de reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Experimentele muizen
OPMERKING: In deze studie werden....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Zoals beschreven in Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3, hebben we het protocol uitgevoerd en met succes primaire chondrocyten geïsoleerd uit de kniegewrichten van muizen. Uit ongeveer 10 mg neonataal muizenkraakbeen verkregen we ongeveer 1 × 104 cellen met een levensvatbaarheid van >90%. Op de eerste dag van de in vitro kweek vertoonden primaire chondrocyten van muiz.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Isolatie en kweek van primaire chondrocyten zijn essentieel voor het ophelderen van de pathofysiologie van kraakbeenziekten22. In de primaire chondrocytencultuur is het optimaliseren van de collagenaseconcentratie en de verteringstijd cruciaal, omdat het de afbraak van de extracellulaire matrix in evenwicht brengt en tegelijkertijd mogelijke cellulaire schade vermindert17. Hierin beschrijven we een betrouwbare en reproduceerbare methode voo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82370909). Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3 zijn gemaakt met Figdraw.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1× PBS Powder (2 L) | Servicebio | G0002-2L | |
| 100 mm celkweefselschotels | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 μm celzeef | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| 15mL Conische Centrifugeerbuis (Steriele, Enzym-Vrij) | Servicebio | EP-1501-J | |
| 50mL Conische Centrifugeerbuis (Steriele, Enzym-Vrij) | Servicebio | EP-5001-J | |
| 6-well celkweefselplaat | Servicebio | CCP-6H | |
| Anti-COL2A1 konijn polyklonaal antilichaam | Immunoway | YT1022 | Primary Antibodies; WB: 1/500 |
| Anti-GAPDH muis monoklonaal antilichaam | Proteintech | 60004-1-IG | Primary Antibodies; WB: 1/2000 |
| Anti-MMP13 konijn polyklonaal antilichaam | Immunoway | YT2796 | Primary Antibodies; WB: 1/1000 |
| Aseptische ultra schone werkbank | Thermo Fisher | 51029704 | |
| Celkweefsel incubator | Thermo Fisher | 51033782 | |
| Collagenase II | Solarbio | C8150 | |
| Aangepaste primers (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biotech | Ontworpen met behulp van Primer BLAST | |
| DMEM/F12 medium | Hyclone | SH30023.01 | |
| Foetaal runderserum | ExCell | FCS500 | |
| HRP-Geit Anti-Muis polyklonaal antilichaam | Immunoway | RS0001 | Secondary Antibodies; WB: 1/10000 |
| HRP-Geit Anti-Konijn polyklonaal antilichaam | Immunoway | RS0002 | Secondary Antibodies; WB: 1/10000 |
| Invers fasecontrastmicroscoop | OLYMPUS | CKX53 | |
| Micropipet | Thermo Fisher | ||
| Miniatuur tafelcentrifuge | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| Chirurgisch mesje nr. 11 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| Penicilline-Streptomycine Oplossing(100X) | Beyotime | C0222 | |
| Set dissectie-instrumenten voor kleine dieren | Servicebio | QXTZ01 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.