Dit protocol maakt het mogelijk om binnen 6-8 uur voldoende primaire chondrocyten te isoleren, waardoor verder diepgaand onderzoek naar de kraakbeenbiologie en kraakbeenziektemechanismen mogelijk wordt.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vitro isolatie en kweek van primaire chondrocyten van muizen voor kraakbeenbiologie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Vernietiging van gewrichtskraakbeen leidt tot veranderde activiteit van chondrocyten, wat een belangrijke oorzakelijke factor is bij een verscheidenheid aan kraakbeenaandoeningen, waaronder artrose (OA) en reumatoïde artritis (RA). Als het meest voorkomende celtype in kraakbeen, is een diepgaande studie van de biologische eigenschappen van chondrocyten essentieel voor de ontwikkeling van effectieve strategieën voor de behandeling van ziekten. Isolatie en kweek van primaire chondrocyten leveren belangrijk experimenteel materiaal voor het onderzoek naar kraakbeenaandoeningen en dragen bij aan het ontrafelen van de mechanismen van kraakbeenbeschadiging en -herstel. Dit protocol geeft een gedetailleerde beschrijving van de in vitro isolatie- en kweekmethoden voor primaire chondrocyten afkomstig van muizen. Door gebruik te maken van het geoptimaliseerde collagenase II-protocol kan de isolatie van chondrocyten binnen 8 uur worden voltooid voor neonatale kraakbeenmonsters van het kniegewricht van muizen. De celopbrengst is ongeveer 1-2 × 10³ cellen/mg kraakbeenweefsel, variërend afhankelijk van de versheid van het weefsel en de initiële celdichtheid; De geïsoleerde cellen vertonen een levensvatbaarheid van >90%. Dit protocol gebruikt primaire chondrocyten van muizen als voorbeeld, en toont de morfologische kenmerken en adhesiestatus van cellen die gedurende 1, 2 en 5 dagen na isolatie zijn gekweekt. Reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) en western blotting toonden aan dat behandeling met interleukine-1β (IL-1β) collageen type II alfa 1 (Col2a1) verminderde en de expressie van matrix metallopeptidase 13 (Mmp13) verhoogde, wat bevestigt dat geïsoleerde chondrocyten reageren op inflammatoire stimuli. In vergelijking met conventionele methoden maakt dit protocol gebruik van een hogere collagenaseconcentratie om de impact van langere isolatietijd op de levensvatbaarheid van cellen te verminderen, terwijl mogelijke celbeschadiging door behandeling met trypsine wordt vermeden. De verkregen primaire chondrocyten zijn zuiver en levensvatbaar, geschikt voor diepgaande studies naar mechanismen die verband houden met kraakbeenletsel, die belangrijke implicaties hebben voor in vitro onderzoek en de klinische behandeling van kraakbeenaandoeningen.
Inleiding
Vernietiging van gewrichtskraakbeen is een belangrijke oorzaak van verschillende kraakbeenaandoeningen, zoals artrose en RA 1,2. Chondrocyten, het overheersende celtype in kraakbeen, zijn essentieel voor het behoud van de homeostase en het vergemakkelijken van herstel als reactie op letsel3. Veranderingen in de activiteit van chondrocyten beïnvloeden niet alleen de structurele integriteit van kraakbeen, maar veroorzaken ook ontstekingsreacties en progressieve weefseldegeneratie4. Daarom is een diepgaand onderzoek naar de biologische eigenschappen van chondrocyten cruciaal voor het ophelderen van de etiopathogenese van deze ziekten.
In de afgelopen jaren heeft de rol van chondrocyten bij ontstekingsreacties steeds meer aandacht gekregen. Studies hebben aangetoond dat inflammatoire cytokines, zoals IL-1β en tumornecrosefactor-α (TNF-α), de metabolische processen van chondrocyten aanzienlijk in gevaar brengen, wat resulteert in een verhoogde expressie van matrixafbrekende enzymen en verminderde matrixsynthese 5,6,7. Deze veranderingen leiden uiteindelijk tot de geleidelijke degeneratie van kraakbeen en gewrichtsdisfunctie. Daarom is het onderzoeken van de biologische veranderingen van chondrocyten onder pathologische omstandigheden in in-vitromodellen bijzonder noodzakelijk geworden. Voortbouwend op de traditionele tweedimensionale (2D) monolaagcultuur, zijn recente ontwikkelingen in de driedimensionale (3D) chondrocytencultuur en organoïdetechnologieën in toenemende mate toegepast in kraakbeengerelateerd onderzoek. Deze verfijnde systemen bieden een meer fysiologisch relevante micro-omgeving en bieden waardevolle inzichten in het gedrag van chondrocyten in ziektecontexten8.
De selectie van een celbron bepaalt in belangrijke mate of in vitro bevindingen de pathofysiologie van gewrichten nauwkeurig samenvatten. In tegenstelling tot onsterfelijke chondrocytenlijnen of kraakbeenexplantaten, behouden primaire chondrocyten de oorspronkelijke genetische achtergrond, mechanogevoelige calciumsignaalroutes en fenotypische stabiliteit van gewrichtskraakbeen, waardoor ze een superieure chondrogene capaciteit en biologisch gedrag vertonen dat beter aansluit bij dat van residente kraakbeencellen9. Systematische verschillen in calciumsignaleringsbronnen en belangrijke ionkanalen en stroomafwaartse routes zijn gedocumenteerd tussen primaire chondrocyten en de ATDC5-cellijn10. Bijgevolg moeten bij het onderzoeken van gewrichtsfysiologie of pathologie primaire chondrocyten prioriteit krijgen. Daarom is het optimaliseren van de isolatie en kweek van primaire chondrocyten essentieel voor het nauwkeurig modelleren van ziektegerelateerde biologie en het verkennen van potentiële therapeutische geneesmiddelen 11,12,13,14,15. Desalniettemin brengen bestaande methoden de levensvatbaarheid van cellen of de integriteit van het fenotype in gevaar als gevolg van langdurige spijsvertering16,17.
Hier beschrijven we een protocol voor de in vitro isolatie en kweek van primaire chondrocyten afkomstig van kraakbeenweefsel van muizen, dat snel voldoende cellen oplevert. Vergeleken met conventionele protocollen met een lage enzymconcentratie en langdurige spijsvertering, heeft deze studie de enzymverteringsomstandigheden en de stappen voor de voorbehandeling van het weefsel geoptimaliseerd. Deze optimalisatie heeft de spijsverteringstijd aanzienlijk verkort tot 6-8 uur, terwijl mogelijke celbeschadiging door behandeling met trypsine wordt vermeden15,17. Met deze methode kunnen ongeveer 1-2 × 103 chondrocyten worden verkregen uit elke mg kraakbeenweefsel van muizen. Dit protocol biedt een betrouwbare gids voor het isoleren en kweken van primaire chondrocyten in vitro en biedt een robuust model voor onderzoeken naar kraakbeenaandoeningen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden goedgekeurd door de ethische commissie van het Xi'an Honghui-ziekenhuis (nr. 202309009) en de experimentele procedures hielden zich strikt aan de 3R-principes van vervanging, vermindering en verfijning voor dierproeven.
Figuur 1A illustreert een schematisch diagram van de bereiding van reagentia en apparatuur. De Materiaaltabel bevat informatie over de reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.
1. Experimentele muizen
OPMERKING: In deze studie werden vier 3 dagen oude, wildtype C57BL/6J-muizen gebruikt.
- Houd de kooien op een constante temperatuur van 25 °C ± 2 °C en een luchtvochtigheid van 50%-60%, met een licht/donkercyclus van 12 uur/12 uur. Zorg voor specifiek pathogeenvrij (SPF) steriel muizenvoer van klasse (gesteriliseerd door 60Co-bestraling) en steriel water ad libitum.
- Verzamel post mortem kniegewrichtskraakbeen (~10 mg/muis) van vier 3 dagen oude muizen om primaire chondrocyten te isoleren.
2. Verzameling en verwerking van kraakbeenspecimens
- Verwerking van muizen en weefseldissectie
- Euthanaseer neonatale muizen binnen 3 dagen na de geboorte. Steriliseer het lichaamsoppervlak door af te vegen met 75% medische alcohol.
- Isoleer de kniegewrichten van muizen met steriele chirurgische instrumenten. Plaats ze in steriel 1x PBS.
- Snijd de spieren, botten, synovium en ander proliferatief bindweefsel rond het kniegewricht voorzichtig weg met steriele chirurgische instrumenten. Behoud alleen het kraakbeenweefsel van het kniegewricht.
- Spoel de weefselmonsters 3x met steriel 1x PBS. Gooi de vloeistof weg.
OPMERKING: Figuur 1B illustreert een vereenvoudigd schematisch diagram van de acquisitie en voorbewerking van kraakbeenweefsel.
Afbeelding 1: Vereenvoudigde workflow voor materiaalvoorbereiding en verwerking van kraakbeenmonsters. (A) Schematisch diagram van de opstelling van reagentia en apparatuur, inclusief reagentia, verbruiksartikelen en belangrijke instrumenten. (B) Stapsgewijs protocol voor het verwerken van kraakbeenweefsel uit kniegewrichten van muizen. Afkortingen: PBS = fosfaatgebufferde zoutoplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. Isolatie en kweek van primaire chondrocyten
- Breng het geïsoleerde kraakbeenweefsel over in een nieuwe celkweekplaat met 6 putjes. Hak met een steriel chirurgisch mesje nr. 11 het weefsel in kleine stukjes van ongeveer 0,25mm3 groot. Spoel eenmaal af met voorgekoelde steriele 1x PBS. Gooi de vloeistof weg.
- Voeg 2 ml voorverwarmde (37 °C) digestieoplossing met hoge concentratie collagenase II (25 mg/ml, opgelost in steriel Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] basaal medium) toe om het weefselblok te bedekken.
- Incubeer de celkweekplaat in een bevochtigde 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 15 minuten voor enzymatische vertering. Gooi de vloeistof na de incubatie weg.
- Herhaal stap 3.2 en 3.3.
OPMERKING: Enzymvertering met hoge concentratie is een voorbereidende stap. Het is bedoeld om het weefsel voor te verteren, de structuur gedeeltelijk af te breken voor een betere daaropvolgende spijsvertering en matrixverklevingen te verwijderen die kunnen ontstaan als gevolg van het afsnijden van de weefselperiferie. - Voeg 2 ml voorverwarmde (37 °C) digestieoplossing met een lage concentratie collagenase II (5 mg/ml, opgelost in steriel DMEM/F12 basaal medium) toe om het weefselblok te bedekken.
- Incubeer de celkweekplaat in een bevochtigde 5% CO2 -incubator bij 37 °C gedurende 6-8 uur voor de spijsvertering en observeer de voortgang van de celscheiding. Af en toe langzaam horizontaal schudden (80-120 tpm) of voorzichtig pipetteren om de lysisefficiëntie te verbeteren.
OPMERKING: Voor neonataal muizenweefsel is de celafgifte zichtbaar rond 3 uur, met volledige isolatie mogelijk tussen 6 en 8 uur. Tijdens de 6-8 uur durende collagenase II-behandeling observeert u de lysis elk uur en beëindigt u de spijsvertering wanneer er geen duidelijke weefselbrokken zichtbaar zijn voor het blote oog en 90% van de cellen vrij en in suspensie onder een microscoop zijn. Tijdens het verteringsproces kan onder een optische microscoop worden waargenomen dat vacuole-achtige chondrocyten geleidelijk loskomen van de massa van het kraakbeenweefsel. Deze stap kan meerdere keren worden herhaald om de schade aan chondrocyten veroorzaakt door langdurige spijsvertering te minimaliseren, en de spijsverteringsoplossing kan worden vervangen door een verse collagenase II-digestieoplossing met een lage concentratie om de celopbrengst te verhogen. - Filtreer alle digestieproducten door een celzeef van 100 μm in een steriele centrifugebuis van 50 ml.
OPMERKING: Gebruik een celzeef van 100 μm om verlies van chondrocytenaggregaten te voorkomen en de opbrengst te verhogen. Resterende weefselfragmenten worden verwijderd tijdens de uitwisseling van het medium. - Spoel de celkweekplaat af met steriel 1x PBS. Filtreer opnieuw door de celzeef.
- Verzamel al het filtraat van de vorige stap in een centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met uitgeschakelde rem. Gooi het bovenstaande na het centrifugeren weg.
- Voeg 2 ml steriel 1x PBS toe en suspendeer het neerslag voorzichtig opnieuw door lichtjes te blazen en aan te zuigen met een pipet. Breng over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur met uitgeschakelde rem. Gooi het bovenstaande na het centrifugeren weg.
- Resuspendeer het neerslag uit stap 4.10 met 2 ml vers bereid steriel DMEM/F12 compleet medium, dat 15% foetaal runderserum (FBS) en 1% P/S bevat. Inventariseer de geoogste celsuspensie met behulp van een hemocytometer en plaats de cellen vervolgens in een steriel kweekschaaltje van 10 cm bij 2-2,5 × 105 cellen/cm2. Vul aan tot een eindvolume van 10 ml met volledig medium.
OPMERKING: De zaaidichtheid van chondrocyten moet 2-2,5 × 105 cellen/cm2 zijn, aangezien zaaien met een lage of gemiddelde dichtheid kan leiden tot een fenotypische verschuiving van gewrichtschondrocyten naar fibroblasten. Proliferatieactiviteit en levensvatbaarheid van de geïsoleerde primaire cellen kunnen worden beoordeeld met behulp van optionele MTT-assays of trypanblauwe uitsluitingskleuring (optionele stap). - Incubeer in een bevochtigde 5% CO2 -incubator bij 37 °C.
- Vervang door vers DMEM/F12 compleet medium (met 10% FBS, 1% P/S) nadat onder een optische microscoop is waargenomen dat de cellen volledig aan de wand hechten.
- Vervang het medium elke 2 dagen. Ga door met kweken tot de samenvloeiing 70% bereikt, waarna volgende experimenten kunnen worden uitgevoerd.
OPMERKING: De serumconcentratie in het kweekmedium kan worden verhoogd tot 15% op basis van de celconditie. Figuur 2 illustreert een vereenvoudigd schematisch diagram van de vertering, isolatie en kweek van kraakbeenweefsel.
Figuur 2: Vereenvoudigde procedure voor de vertering van kraakbeenweefsel, primaire celisolatie en kweek. Kraakbeen werd gedurende 15 minuten continu fijngehakt en verteerd met een hoge concentratie collagenase II-digestieoplossing, eenmaal herhaald en vervolgens gedurende 6-8 uur verteerd met een lage concentratie collagenase II-digestieoplossing om de cellen te isoleren. Het verteerde weefsel werd vervolgens gefilterd en het filtraat werd verzameld en gecentrifugeerd. De celpellet werd gewassen met 1x PBS en gekweekt in DMEM/F12-medium totdat de samenvloeiing 70% bereikte, waarna de cellen klaar waren voor volgende experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Functionele verificatie van primaire chondrocyten
- Metabolisme en veranderingen van chondrocyten onder ontstekingsaandoeningen.
- Behandel cellen met 10 ng/ml IL-1β gedurende 24 uur om ontstekingsaandoeningen te simuleren.
- Voor RT-qPCR en western blotting, extraheer totaal RNA of totaal eiwit om de metabole indicatoren van de extracellulaire matrix van chondrocyten, zoals COL2A1, MMP13, te detecteren.
OPMERKING: Figuur 3 illustreert een schematisch diagram van de functionele validatie van primaire chondrocyten en de daaropvolgende experimentele procedures. De informatie over antilichamen wordt verstrekt in de Materiaaltabel. Gedetailleerde procedures voor western blotting en RT-qPCR worden gegeven in Tabel 1, Tabel 2, Tabel 3, Tabel 4 en Tabel 5. Alle methoden volgden de standaardprotocollen 11,18.
Figuur 3: Schematisch diagram van het functionele validatieprogramma voor primaire chondrocyten. Ontstekingsaandoeningen veroorzaakt door IL-1β-behandeling; effecten op kraakbeen-geassocieerde fenotypes beoordeeld door RT-qPCR en Western blotting. Afkortingen: IL-1β = interleukine-1β; RT-qPCR = Reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Voorwaarden voor de Western Blotting-workflow | |
| Stap | Toestand / Reagens |
| SDS-PAGE gel preparaat | 8 % (m/v) Tris-HCl scheidingsgel |
| Elektroforese stapelen | 80 V, 30-40 min |
| Elektroforese oplossen | 120 V, 1-1,5 uur |
| Overdracht | Halfdroog, 15 V, 30-60 min |
| Blokkeren | Snelle blokkeerbuffer, 2 uur bij kamertemperatuur |
Tabel 1: Omstandigheden van de Western blotting-workflow. Samenvatting van de omstandigheden van western blotting, inclusief SDS-PAGE-samenstelling, elektroforeseparameters, overdrachtsinstellingen en blokkeringsprocedure.
| Reverse transcriptie reactiemix | |
| Bestanddeel | Inhoud (μL) |
| 5× Transcriptor Reverse Transcriptase Reactiebuffer | 4 |
| Deoxynucleotide-mix (elk 10 mM) | 2 |
| Beschermer RNase-remmer (40 E/μL) | 0.5 |
| Transcriptor Reverse Transcriptase (20 U/μL) | 0.5 |
| Nucleasevrij water | tot 20 |
| Totaal volume | 20 |
Tabel 2: Reverse transcriptie reactiemix. Reverse transcriptiereactiesamenstelling voor cDNA-synthese.
| Primer informatie voor RT-qPCR van muis primaire chondrocyt | ||||
| Naam van het gen | Reeks (5'3 ') | Gloeitemperatuur (°C) | ||
| mGapdh | Voorwaarts | TGGCCTTCCGTGTTCCTAC | 60 | |
| Omkeren | GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA | |||
| mCol2a1 | Voorwaarts | TGACCTCAACTACATGGTCTACA | 60 | |
| Omkeren | CTTCCCATTCTCGGCCTTG | |||
| mMmp13 | Voorwaarts | CTTCTTCTTGTTGAGCTGGACTC | 60 | |
| Omkeren | CTGTGGAGGTCACTGTAGACT | |||
Tabel 3: Primer-informatie voor RT-qPCR van primaire chondrocyten van muizen. Sequenties en gloeitemperatuur (60 °C) van primers die worden gebruikt om Gapdh-, Col2a1- en Mmp13-transcripten in primaire chondrocyten van muizen te kwantificeren.
| RT-qPCR reactiemix | |
| Bestanddeel | Inhoud (μL) |
| 2 × SYBR Groene qPCR Master Mix | 10 |
| Verdund cDNA-sjabloon | 8 |
| Voorwaartse primer (10 μM) | 1 |
| Omgekeerde primer (10 μM) | 1 |
| Totaal volume | 20 |
Tabel 4: RT-qPCR-reactiemix. RT-qPCR reactiemix (20 μL) met SYBR Green mastermix, sjabloon en primers.
| RT-qPCR het cirkelen protocol | ||
| Stap | Temperatuur (°C) | Tijd |
| Initiële denaturatie (×1) | 95 | 10 minuten |
| Denaturatie (×40) | 95 | 5 seconden |
| Gloeien/uitbouwen (×40) | 60 | 15 s |
| Uitbreiding (×40) | 72 | jaren 30 |
| Smeltcurve (×1) | 95 55 95 | 60 s 30 s 30 s |
Tabel 5: RT-qPCR fietsprotocol. Denaturatie bij 95 °C gedurende 5 s, gloeien/uitzetten bij 60 °C gedurende 15 s en een laatste smeltcurve-analyse werden uitgevoerd gedurende 40 cycli.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zoals beschreven in Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3, hebben we het protocol uitgevoerd en met succes primaire chondrocyten geïsoleerd uit de kniegewrichten van muizen. Uit ongeveer 10 mg neonataal muizenkraakbeen verkregen we ongeveer 1 × 104 cellen met een levensvatbaarheid van >90%. Op de eerste dag van de in vitro kweek vertoonden primaire chondrocyten van muiz...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Isolatie en kweek van primaire chondrocyten zijn essentieel voor het ophelderen van de pathofysiologie van kraakbeenziekten22. In de primaire chondrocytencultuur is het optimaliseren van de collagenaseconcentratie en de verteringstijd cruciaal, omdat het de afbraak van de extracellulaire matrix in evenwicht brengt en tegelijkertijd mogelijke cellulaire schade vermindert17. Hierin beschrijven we een betrouwbare en reproduceerbare methode voo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflicten hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 82370909). Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3 zijn gemaakt met Figdraw.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1× PBS Powder (2 L) | Servicebio | G0002-2L | |
| 100 mm celkweefselschotels | Servicebio | CCD-100 | |
| 100 μm celzeef | Sangon Biotech | F613463-0001 | |
| 15mL Conische Centrifugeerbuis (Steriele, Enzym-Vrij) | Servicebio | EP-1501-J | |
| 50mL Conische Centrifugeerbuis (Steriele, Enzym-Vrij) | Servicebio | EP-5001-J | |
| 6-well celkweefselplaat | Servicebio | CCP-6H | |
| Anti-COL2A1 konijn polyklonaal antilichaam | Immunoway | YT1022 | Primary Antibodies; WB: 1/500 |
| Anti-GAPDH muis monoklonaal antilichaam | Proteintech | 60004-1-IG | Primary Antibodies; WB: 1/2000 |
| Anti-MMP13 konijn polyklonaal antilichaam | Immunoway | YT2796 | Primary Antibodies; WB: 1/1000 |
| Aseptische ultra schone werkbank | Thermo Fisher | 51029704 | |
| Celkweefsel incubator | Thermo Fisher | 51033782 | |
| Collagenase II | Solarbio | C8150 | |
| Aangepaste primers (Gapdh, Col2a1, Mmp13) | Sangon Biotech | Ontworpen met behulp van Primer BLAST | |
| DMEM/F12 medium | Hyclone | SH30023.01 | |
| Foetaal runderserum | ExCell | FCS500 | |
| HRP-Geit Anti-Muis polyklonaal antilichaam | Immunoway | RS0001 | Secondary Antibodies; WB: 1/10000 |
| HRP-Geit Anti-Konijn polyklonaal antilichaam | Immunoway | RS0002 | Secondary Antibodies; WB: 1/10000 |
| Invers fasecontrastmicroscoop | OLYMPUS | CKX53 | |
| Micropipet | Thermo Fisher | ||
| Miniatuur tafelcentrifuge | SUNNE | SN-TDL-6 | |
| Chirurgisch mesje nr. 11 | Servicebio | QXJZ-11 | |
| Penicilline-Streptomycine Oplossing(100X) | Beyotime | C0222 | |
| Set dissectie-instrumenten voor kleine dieren | Servicebio | QXTZ01 |
Referenties
- Makris, E. A., Gomoll, A. H., Malizos, K. N., Hu, J. C., Athanasiou, K. A. Repair and tissue engineering techniques for articular cartilage. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 21-34 (2015).
- Bierma-Zeinstra, S., Van Middelkoop, M., Runhaar, J., Schiphof, D. Nonpharmacological and nonsurgical approaches in OA. Best Pract Res Clin Rheumatol. 34 (2), 101564(2020).
- Urlic, I., Ivkovic, A. Cell sources for cartilage repair-biological and clinical perspective. Cells. 10 (9), 2496(2021).
- Murphy, M. P., et al. Articular cartilage regeneration by activated skeletal stem cells. Nat Med. 26 (10), 1583-1592 (2020).
- Zhao, K., Ruan, J., Nie, L., Ye, X., Li, J. Effects of synovial macrophages in osteoarthritis. Front Immunol. 14, 1164137(2023).
- Wang, B. W., et al. Aucubin protects chondrocytes against IL-1β-induced apoptosis in vitro and inhibits osteoarthritis in a mouse model. Drug Des Devel Ther. 13, 3529-3538 (2019).
- Kuswanto, W., Baker, M. C. Repurposing drugs for the treatment of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 32 (8), 886-895 (2024).
- Heywood, H. K., Thorpe, S. D., Jeropoulos, R. M., Caton, P. W., Lee, D. A. Modulation of sirtuins during monolayer chondrocyte culture influences cartilage regeneration upon transfer to a 3d culture environment. Front Bioeng Biotechnol. 10, 971932(2022).
- Piñeiro-Ramil, M., et al. Generation of human immortalized chondrocytes from osteoarthritic and healthy cartilage : A new tool for cartilage pathophysiology studies. Bone Joint Res. 12 (1), 46-57 (2023).
- Li, W., Zhou, Y., Han, L., Wang, L., Lucas Lu, X. Calcium signaling of primary chondrocytes and atdc5 chondrogenic cells under osmotic stress and mechanical stimulation. J Biomech. 145, 111388(2022).
- Zhao, Y., et al. Protein folding dependence on selenoprotein m contributes to steady cartilage extracellular matrix repressing ferroptosis via PERK/ATF4/CHAC1 axis. Osteoarthritis Cartilage. 33 (2), 261-275 (2025).
- Zhang, H., et al. Mechanical overloading promotes chondrocyte senescence and osteoarthritis development through downregulating FBXW7. Ann Rheum Dis. 81 (5), 676-686 (2022).
- Tang, H., et al. The IRF1/GBP5 axis promotes osteoarthritis progression by activating chondrocyte pyroptosis. J Orthop Translat. 44, 47-59 (2024).
- Bittner, N., et al. Primary osteoarthritis chondrocyte map of chromatin conformation reveals novel candidate effector genes. Ann Rheum Dis. 83 (8), 1048-1059 (2024).
- Ramser, A., Greene, E., Rath, N., Dridi, S. Primary growth plate chondrocyte isolation, culture, and characterization from the modern broiler. Poult Sci. 102 (1), 102254(2023).
- Mao, J., et al. Insufficiency of collagenases in establishment of primary chondrocyte culture from cartilage of elderly patients receiving total joint replacement. Cell Tissue Bank. 24 (4), 759-768 (2023).
- Lau, T. T., Peck, Y., Huang, W., Wang, D. A. Optimization of chondrocyte isolation and phenotype characterization for cartilage tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 21 (2), 105-111 (2015).
- Pagani, S., et al. Rna extraction from cartilage: Issues, methods, tips. Int J Mol Sci. 24 (3), 2120(2023).
- Goldring, M. B., Otero, M., Tsuchimochi, K., Ijiri, K., Li, Y. Defining the roles of inflammatory and anabolic cytokines in cartilage metabolism. Ann Rheum Dis. 67 (Suppl 3), 75-82 (2008).
- Wang, G., et al. TGFbeta attenuates cartilage extracellular matrix degradation via enhancing FBXO6-mediated MMP14 ubiquitination. Ann Rheum Dis. 79 (8), 1111-1120 (2020).
- Pang, Y., Zhao, L., Ji, X., Guo, K., Yin, X. Analyses of transcriptomics upon IL-1β-stimulated mouse chondrocytes and the protective effect of catalpol through the NOD2/NB-κb/MAPK signaling pathway. Molecules. 28 (4), 1606(2023).
- Naranda, J., Gradisnik, L., Gorenjak, M., Vogrin, M., Maver, U. Isolation and characterization of human articular chondrocytes from surgical waste after total knee arthroplasty (TKA). PeerJ. 5, e3079(2017).
- Koyama, N., et al. Pluripotency of mesenchymal cells derived from synovial fluid in patients with temporomandibular joint disorder. Life Sci. 89 (19-20), 741-747 (2011).
- Lawrence, J. E. G., et al. Single-cell transcriptomics identifies chondrocyte differentiation dynamics in vivo and in vitro. Dev Cell. , (2025).
- Huang, C., et al. Single-cell transcriptomic analysis of chondrocytes in cartilage and pathogenesis of osteoarthritis. Genes Dis. 12 (2), 101241(2025).
- Wu, C. L., et al. Single cell transcriptomic analysis of human pluripotent stem cell chondrogenesis. Nat Commun. 12 (1), 362(2021).
- Zhang, H., Huang, J., Alahdal, M. Exosomes loaded with chondrogenic stimuli agents combined with 3d bioprinting hydrogel in the treatment of osteoarthritis and cartilage degeneration. Biomed Pharmacother. 168, 115715(2023).
- Mahapatra, C., Jin, G. Z., Kim, H. W. Alginate-hyaluronic acid-collagen composite hydrogel favorable for the culture of chondrocytes and their phenotype maintenance. Tissue Eng Regen Med. 13 (5), 538-546 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.