Methodenartikel

Ontwikkeling van een innovatief LED-gebaseerd verlichtingsapparaat voor in vitro toepassing van fotodynamische therapie met Rose Bengal

DOI:

10.3791/68462

⸱

12 september 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Inserm, CHU Lille, U1189-ONCO-THAI-Assisted Laser Therapy and Immunotherapy for Oncology, University of Lille, 2CNRS, Inserm, CHU Lille, UMR9020-U1277-CANTHER-Cancer Heterogeneity Plasticity and Resistance to Therapies, University of Lille

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript presenteert een nieuw, innovatief 3D-geprint verlichtingsapparaat voor het bestuderen van Rose Bengal-gemedieerde fotodynamische therapie in vitro.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een nieuw apparaat voor fotodynamische therapie (PDT) voor het evalueren van de werkzaamheid van Rose Bengal (RB)-gemedieerde PDT in vitro. Het apparaat, CELL-LED-550/3 genaamd, bestaat uit twee 3D-geprinte onderdelen, het ene genereert een groen licht van 550 nm uit een enkele LED (het lichtbrongedeelte) en het andere verdeelt dit licht naar een celkweekplaat met 96 putjes (het lichtverdelergedeelte). Het lichtbrongedeelte wordt aangestuurd door een driver met drie verschillende modi, waardoor het lichtverdelergedeelte drie verschillende stralingsniveaus kan leveren aan het onderste buitenoppervlak van de putten: 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 of 0,62 mW/cm2. Het lichtverdelergedeelte is ontworpen om de putten afzonderlijk en gelijktijdig te verlichten. Om de relevantie van het CELL-LED-550/3-apparaat aan te tonen, werd het vermogen om celdood te induceren door RB-gemedieerde PDT op HepG2-hepatocellulaire carcinoomcellen geëvalueerd. Eerst werden HepG2-cellen gedurende 2 uur behandeld met toenemende concentraties Rose Bengal, een fotosensibilisator met een absorptiepiek (de hoogste) rond 550 nm. De behandelde cellen werden vervolgens verlicht met behulp van het CELL-LED-550/3-apparaat dat was ingesteld op het maximale bestralingsniveau bij lichtdoses van 0.3 J/cm2, 0.6 J/cm2 en 1.2 J/cm2 (respectievelijk met verlichtingstijden van 8 min en 4 s, 16 min en 8 s, en 32 min en 16 s). Ten slotte werd de levensvatbaarheid gemeten met behulp van Cell-Titer Glo 24 uur na PDT. De experimentele resultaten tonen aan dat RB-gemedieerde PDT met behulp van het CELL-LED-550/3-apparaat in staat is om een afname van de levensvatbaarheid van HepG2-cellen te induceren, op een manier die zowel afhankelijk is van de concentratie van Rose Bengal als van de toegediende dosis licht. Op basis van het proof of concept dat in dit artikel wordt gepresenteerd, voegt het CELL-LED-550/3-apparaat een extra hulpmiddel toe aan de studie van RB-gemedieerde PDT.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met meer dan 905.000 nieuwe gevallen en 830.000 sterfgevallen in 2020 is de primaire leverkanker de zevende meest voorkomende vorm van kanker en de op één na belangrijkste doodsoorzaak door kankerwereldwijd1. Onder primaire leverkankers is hepatocellulair carcinoom (HCC) de meest voorkomende vorm, goed voor ongeveer 90% van de gevallen2. Als gevolg van onopgemerkte chronische leverziekte en slechte naleving van het toezicht, wordt slechts 25% van de patiënten met HCC in een vroeg stadium van de ziekte gediagnosticeerd3. Deze vroeg gediagnosticeerde patiënten worden doorgaans behandeld door middel van leverresectie, levertransplantatie of lokale ablatieve therapieën met curatieve intentie en vertonen een goede prognose met een vijfjaarsoverleving van meer dan 70%4,5. Voor de overige 75% van de patiënten (degenen met tussen- of laat gediagnosticeerde HCC) blijft de prognose weliswaar zeer slecht, hoewel innovatieve behandelingsmodaliteiten, waaronder gerichte therapieën, immunotherapieën en combinatieregimes overlevingsvoordelen opleveren6: de vijfjaarsoverleving bedraagt in feite niet meer dan 30% voor deze groep patiënten en daalt tot 2% voor de subgroep van gemetastaseerde patiënten6. Het onderzoeken van alternatieve behandelingsopties is daarom cruciaal om de behandelingsresultaten te verbeteren en de overleving te verlengen bij patiënten met HCC in een tussen- of gevorderd stadium. Fotodynamische therapie (PDT), een antikankertherapie die veel wordt toegepast in de dermatologie7, zou een geschikte alternatieve kandidaat kunnen zijn.

PDT is een fotochemische behandeling die het gebruik van een fotosensibiliserend middel (PS), een geschikte golflengte van zichtbaar licht en moleculaire zuurstof combineert om cytotoxische reactieve zuurstofsoorten (ROS) te genereren8. De antikankereffecten van PDT zijn afgeleid van drie ROS-geïnduceerde mechanismen9: ten eerste directe cytotoxische effecten op kwaadaardige cellen10, vervolgens schade aan het tumorvaatstelsel dat tumorweefselhypoxie, tekort aan voedingsstoffen en regressie induceert11, en ten slotte inductie van ontstekingsreacties door het vrijkomen van gevaarsignalen en tumorantigenen van beschadigde of stervende tumorcellen12. Al meer dan drie decennia is PDT het onderwerp van intensief onderzoek om het potentieel ervan voor de behandeling van verschillende soorten en vormen van kanker te evalueren 13,14,15,16,17,18. Op basis van de werkzaamheid die uit deze onderzoeken is gebleken 19,20,21, wordt PDT tegenwoordig momenteel in de dermatologie gebruikt voor de behandeling van niet-melanome huidkankers 7. Voor de andere indicaties is het aantal klinische studies de afgelopen jaren toegenomen, wat de aanzienlijke inspanningen aantoont om PDT, alleen of in combinatie met standaardbehandelingen, in de klinische praktijk te brengen 22,23,24.

Er bestaat een verscheidenheid aan fotosensibiliserende middelen die worden gebruikt voor PDT25. Onder hen is aangetoond dat Rose Bengal (RB) werkt als een efficiënt fotodynamisch middel tegen strottenhoofdtumorcellen26, melanoomcellen27, borstkankercellen28 en prostaatkankerweefsels29. Het werk dat in dit artikel wordt gepresenteerd, is gebaseerd op de noodzaak om te evalueren of RB-gemedieerde PDT ook efficiënt is voor HCC-cellen.

Een dergelijke evaluatie vereiste inderdaad de voorafgaande ontwikkeling van een op groene LED gebaseerd apparaat voor de 550 nm-verlichting van celkweekplaten met 96 putjes. Voor dit apparaat werd een ontwerp in twee delen geïmplementeerd30: een lichtbrondeel genereert een groen licht van 550 nm uit een enkele LED, terwijl een lichtverdelerdeel dit licht door het gebruik van een glasvezelbundel afzonderlijk en weg van de LED naar de 96 putten verdeelt. Dit tweedelige ontwerp voorkomt ten eerste dat de cellen schadelijke warmte-effecten ondervinden die kunnen ontstaan door de ongecontroleerde warmte die in de LED wordt gegenereerd, en maakt het ten tweede mogelijk om de cellen in een celcultuurincubator te verlichten terwijl het lichtbrongedeelte met zijn elektronische componenten (inclusief de LED) buiten blijft. Deze innovatieve functies geven het zogenaamde CELL-LED-550/3-apparaat grote voordelen ten opzichte van de reeds gepubliceerde LED-gebaseerde systemen die speciaal zijn ontworpen voor plaatverlichting met meerdere putjes 31,32,33,34,35.

In dit artikel wordt het apparaat CELL-LED-550/3 eerst in detail beschreven. Vervolgens, als proof of concept, toont een studie naar de levensvatbaarheid van cellen de werkzaamheid aan van RB-gemedieerde PDT met behulp van CELL-LED-550/3 in een 2D HCC-celcultuurmodel (HepG2)30. Het CELL-LED-550/3-apparaat is niet alleen goedkoop en draagbaar, maar ook een bijzonder relevant hulpmiddel voor RB-gemedieerde PDT-experimenten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Constructie van het apparaat

OPMERKING: De twee onderdelen van het CELL-LED-550/3-apparaat worden afzonderlijk vervaardigd en, alleen als laatste stap, worden ze aan elkaar gekoppeld.

  1. Constructie van het lichtbrongedeelte
    1. Bevestig een ventilatorkoellichaam van de juiste grootte aan de achterkant van de printplaat (PCB) waarop de 550 nm 3 W LED is gemonteerd.
    2. Bedek de LED met een heldere PMMA (polymethylmethacrylaat) collimatorlens om eerst de lichtbundel te homogeniseren en vervolgens de stralingshoek te verkleinen van 120° naar 10°. Een dergelijke vermindering maakt het mogelijk om de hoeveelheid licht die aan het lichtverdelergedeelte wordt geleverd, te vergroten.
    3. Sluit de LED aan op de huidige driver met tri-mode dimming, waardoor verschillende instralingsniveaus kunnen worden geleverd.
    4. Bouw de behuizing, de voorkant van de behuizing en de sluiting van de behuizing apart in 3D-printen (rode vakken in figuur 1).
    5. Installeer de driver en de LED die zijn uitgerust met zowel de lens als de ventilator koellichaam op hun speciale plaatsen in de behuizing (blauwe vakken in afbeelding 1).
    6. Installeer de stroomaansluiting en de tuimelschakelaar op hun daarvoor bestemde plaatsen in de behuizingssluiting (blauwe vakken in afbeelding 1).
    7. Sluit de driver en het koellichaam van de ventilator aan op de stroomaansluiting via de tuimelschakelaar.
    8. Monteer de behuizing, de behuizingssluiting en de voorkant van de behuizing.
    9. Controleer of de LED is uitgelijnd met de as van de cilindrische opening van de voorkant van de behuizing.
      OPMERKING: De cilindrische opening van de voorkant van de behuizing is bedoeld voor de optische verbinding van het lichtbrongedeelte (vrouwelijke connector) met het lichtverdelergedeelte (mannelijke connector).

figure-protocol-1
Afbeelding 1: Driedimensionale voor- (A), achterkant (B) en geëxplodeerde (C) aanzichten van het lichtbrongedeelte. Aangepast van Lefebvre, A. et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

  1. Constructie van het lichtverdelergedeelte
    1. Bouw de ondersluiting van de behuizing, de behuizing en de bovensluiting afzonderlijk in 3D-printen (samen vormen ze een holle doos) (rode dozen in figuur 2).
    2. Bouw de 96-well spacer in wit 3D-printen (rode doos in Figuur 2) zodat deze precies past op de holle doos genoemd in 1.2.1. De witte kleur heeft als doel om de lichtreflectie te maximaliseren en zo de lichtverdeling te optimaliseren.
      OPMERKING: De diameter en de afstand in het midden van de ronde openingen in de afstandhouder met 96 putjes moeten gelijk zijn aan de diameter en de middenafstand van de putten van de plaat met 96 putjes die wordt gebruikt voor biologische tests.
    3. Boor 96 kleine gaatjes in de bovenste sluiting van de holle doos, zodat ze op één lijn liggen met het midden van de 96 ronde openingen in de afstandhouder met 96 putjes, wanneer deze op de bovenste sluiting wordt geplaatst.
    4. Steek een plastic optische vezel met een diameter van 0,5 mm, van onder naar boven, in elk van de 96 kleine gaatjes van de bovensluiting.
    5. Breng polyesterhars aan op de onderkant van de bovensluiting om de 96 optische vezels aan de bovensluiting te hechten.
    6. Nadat de hars is opgedroogd, polijst u de distale uiteinden van de optische vezels totdat ze zich aanpassen aan de bovenkant van de bovensluiting.
    7. Verzamel de optische vezels in de holle doos vermeld in stap 1.2.1 tot een enkele bundel die wordt beschermd door een omhulsel, die zich uitstrekt over ongeveer twee meter uit de doos.
      OPMERKING: De hoogte van de doos moet voldoende zijn om buigen van de optische vezels en optische verzwakking die kan worden veroorzaakt, te voorkomen.
    8. Monteer de holle doos zo dat de vezelbundel door de speciale opening van de behuizing gaat.
    9. Plaats de proximale uiteinden van de optische vezels samen tot een 3D-geprinte mannelijke connector, waardoor de verbinding met het lichtbrongedeelte (vrouwelijke connector) mogelijk is.
      NOTITIE: Voor deze connector is geen lijm nodig om lichtverzwakking te voorkomen die deze lijm kan veroorzaken.
    10. Plaats de afstandhouder met 96 putjes op de holle doos.
    11. Maak een scherm door een calqueerpapier tussen een transparante PMMA-plaat (onderzijde) en een krasbestendige mylar-plaat (bovenzijde) te plaatsen om de smalle straal die aan elk distaal uiteinde van de optische vezel wordt geleverd, te diffunderen tot een straal die zo groot is als de putdiameter van de plaat met 96 putjes die wordt gebruikt voor biologische tests.
    12. Bouw het zeefframe in 3D-printen (rode doos in afbeelding 2) zodat de middelste opening precies past bij de grootte van de plaat met 96 putjes die wordt gebruikt voor biologische tests en daardoor de putjes perfect zijn uitgelijnd met de ronde openingen van de afstandhouder met 96 putjes.
    13. Bevestig het scherm aan de bovenkant van de afstandhouder met 96 putjes met het schermframe.

figure-protocol-2
Figuur 2: Driedimensionale aanzichten van het lichtverdelergedeelte. Aangepast van Lefebvre, A. et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

  1. Assemblage van het lichtbrongedeelte met het lichtverdelergedeelte
    1. Steek de mannelijke connector van het lichtverdelergedeelte in de vrouwelijke connector van het lichtbrongedeelte.
      OPMERKING: Zodra de mannelijke connector is aangesloten op de vrouwelijke, moet de lichtstraal die door het lichtbrongedeelte wordt geleverd, iets meer beslaan dan het oppervlak van het lichtontvangende element van het lichtverdelergedeelte, waardoor de toevoer van licht naar de 96 optische vezels wordt gegarandeerd.

2. Biologische analyses

  1. Celkweek proces
    1. Kweek hepatocarcinoom cellijn HepG2 in RPMI 1640 medium aangevuld met 10% door warmte geïnactiveerd runderserum en 1% streptomycine en penicilline.
    2. Bewaar de kweekkolven met HepG2-cellen in een incubator voor 5 % CO2 -cellen bij 37 °C.
    3. Vervang de voedingsbodem om de 3 dagen door de voedingsbodem uit de kolven op te zuigen en te vervangen door de tot 37 °C verwarmde voedingsbodem RPMI 1640.
    4. Gebruik een microscoop om de samenvloeiing van de cellen in de kweekkolven te controleren totdat ze 80%-90% samenvloeiing bereiken.
  2. Zaaien proces
    1. Haal de cellen uit de broedmachine en plaats ze onder het vooraf gereinigde microbiologische veiligheidsstation.
    2. Verwijder de voedingsbodem uit de kweekkolven.
    3. Was de kweekkolven met fosfaatbufferoplossing.
    4. Breng 3 ml trypsine (0,25%, 0,53 mM) aan op de cellen en plaats de kweekkolven gedurende 5 minuten in de incubator bij 37 °C om de cellen los te maken.
    5. Haal na 5 minuten de trypsine uit de kweekkolven met 7 ml kweekmedium en verwijder de volledige oplossing van medium + trypsine + cellen in een tube van 15 ml.
    6. Tel de cellen met behulp van een cellenteller. Neem hiervoor 20 μL van de oplossing met de cellen en doe deze in een buisje. Voeg 20 μL trypan blauwe oplossing toe en plaats de cel + trypan blauwe oplossing op de teldia en plaats deze in de cellenteller.
    7. Nadat de cellen zijn geteld, verdunt u ze in een kweekmedium om een oplossing van 150.000 cellen/ml te verkrijgen en zaait u de cellen in een witte plaat met 96 putjes en een doorzichtige platte bodem met een snelheid van 1,5x104 cellen/putje. De witte kleur is bedoeld om de lichtreflectie en -verdeling in de putten te maximaliseren.
      OPMERKING: Het aantal cellen per putje moet worden aangepast aan de gebruikte cellijn. Een voorafgaande dichtheidstest kan nodig zijn om het juiste aantal cellen te vinden om te zaaien.
    8. Bereid twee platen voor voor elke leestijd van de levensvatbaarheid. Eén plaat wordt verlicht en één blijft donker.
    9. Incubeer de platen gedurende 24 uur vóór de behandeling om celhechting mogelijk te maken.
  3. Rose Bengalen behandeling
    1. Bereid een voorraadoplossing van Rose Bengal door Rose Bengal poeder te reconstitueren in een zoutoplossing van 10%. Deze oplossing moet vlak voor de celbehandeling worden bereid om degradatie van de Bengaalse roos vanwege zijn stabiliteit te voorkomen.
    2. Bereid Bengaalse rozenoplossingen in toenemende concentraties (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM) door de eerder bereide Bengaalse rozenbouillonoplossing in het celkweekmedium te verdunnen.
    3. Nadat de oplossingen zijn bereid, verwijdert u het kweekmedium van de platen met de cellen en voegt u 100 μl Rose Bengal Treatment Solutions toe.
    4. Incubeer de cellen gedurende 2 uur met een Rose Bengal-behandeling om Rose Bengal-internalisatie mogelijk te maken.
      OPMERKING: De incubatietijd voor de Bengaalse rose oplossing kan verschillen, afhankelijk van de gebruikte cellijn. De kinetiek van de incorporatie van Bengaalse roos moet mogelijk worden verfijnd door middel van fluorescentiemeting om de juiste incubatietijd te vinden voor elke bestudeerde cellijn.
    5. Verwijder na 2 uur de Rose Bengal-oplossingen, was de cellen twee keer met PBS en voeg 100 μL/putje Rose Bengaal-vrij kweekmedium toe.
      OPMERKING: Extra wasbeurten met PBS kunnen nodig zijn voor hogere concentraties Rose Bengalen. Er kan een visuele controle worden uitgevoerd om er zeker van te zijn dat de cellen correct zijn gewassen. Eenmaal voldoende gespoeld, mag de PBS geen roze kleur aannemen vanwege de Bengaalse roos die buiten de cellen aanwezig is.
    6. Bedek de microplaten met aluminiumfolie om ze te beschermen tegen blootstelling aan licht. Verlicht de helft van de platen voor de PDT-test (zie stap 2.4). De onverlichte platen leveren controlegegevens voor de PDT-resultaten (donkere toestand). Ze zullen ook gegevens verstrekken over de impact van niet-foto-geactiveerde Rose Bengal op de levensvatbaarheid van cellen. De andere microtiterplaten worden gebruikt voor blootstelling aan licht in het apparaat (PDT-toestand).
  4. Werkwijze voor het apparaat CELL-LED-550/3
    1. Sluit de mannelijke connector op de lichtverdeler aan op de vrouwelijke connector van de lichtbron. Steek vervolgens de lichtbron in een stopcontact.
    2. Verwijder twee microplaten (PDT + Dark conditie) uit de couveuse, verwijder het aluminium voor de PDT-conditie en plaats deze plaat op de lichtverdeler.
    3. Stel de dimmer van de driver in op het maximale niveau om het door de LED geleverde vermogen te maximaliseren en een gemiddelde instraling van 0,62 mW/cm2 over de 96 putjes te verkrijgen.
      OPMERKING: De dimmer van de driver moet worden ingesteld op de meest geschikte waarde voor de biologische tests (van de drie beschikbare). Wat de dimmer van de driver ook is, voor de lage afgegeven straling is het gebruik van een veiligheidsbril niet nodig.
    4. Verlicht de plaat totdat de gewenste dosis licht op de cellen is bereikt. Om de gewenste lichtdosis te verkrijgen, kunnen twee parameters worden aangepast, Tijd en Bestraling, verwijzend naar de volgende vergelijking:
      Lichtdosis (J / cm2 ) = Bestraling (W / cm2) × Tijd (s) (vergelijking 1).
      De bestralingssterkte kan worden gemoduleerd door de driverdimmer af te stemmen op respectievelijk 0,02 mW/cm2, 0,23 mW/cm2 of 0,62 mW/cm2. Van de gekozen bestralingssterkte kan vergelijking 1 worden gebruikt om de verlichtingstijd te berekenen die nodig is om de beoogde lichtdosis te bereiken.
    5. Zodra de gewenste lichtdosis is bereikt, schakelt u het apparaat uit. Vervang de PDT-microplaat in aluminium en plaats deze samen met de bedieningsplaat terug in de couveuse totdat de levensvatbaarheidstest is uitgevoerd.
    6. OPTIONEEL: Verlicht de andere platen indien nodig, volgens dezelfde procedure als hierboven beschreven.
  5. Test op de levensvatbaarheid van cellen
    1. Laat na de PDT-test de verlichte plaat 24 uur in de incubator staan voordat u de impact van PDT op de verlichte cellen meet door hun levensvatbaarheid te meten. De incubatietijd kan worden gevarieerd om de min of meer langetermijneffecten van PDT op de cellen te bestuderen. Voor elke post-PDT-incubatietijd moet een niet-verlichte plaat (donkere toestand) gedurende dezelfde periode worden geïncubeerd.
    2. Neem na de incubatietijd een verlichte en een niet-verlichte plaat en voeg in elk putje 100 μl reagens uit de testkit voor de levensvatbaarheid van cellen toe om de levensvatbaarheid van de cellen te meten op basis van het mitochondriaal metabolisme en de ATP-productie door cellen.
    3. Incubeer de multiplaat 10 minuten in het donker voordat u de levensvatbaarheid van de cel meet.
    4. Lees na 10 minuten incubatie de luminescentie af die in elke put wordt uitgezonden met behulp van een multimodale lezer. De uitgezonden luminescentie is evenredig met de productie van ATP door de levende cellen op het moment van toevoeging van de oplossing voor de levensvatbaarheid van de cellen.
    5. Beschouw de luminescentiewaarde van de onbehandelde (NT) aandoening als 100% levensvatbaarheid en normaliseer de luminescentiewaarden van de behandelde aandoeningen naar de NT-toestand om het percentage levensvatbaarheid te verkrijgen dat door elke behandeling wordt geïnduceerd.
    6. Herhaal hetzelfde leesprotocol voor de levensvatbaarheid van de cellen voor elke leestijd na de PDT-behandeling (bijv. 24 uur, 48 uur en 72 uur na de behandeling).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoals te zien is in afbeelding 3, maakt het CELL-LED-550/3-apparaat de homogene verlichting van onderaf mogelijk van een plaat met 96 putjes met groen licht van 550 nm.

figure-results-1
Afbeelding 3: Foto's van het CELL-LED-550/3-apparaat tijdens een illustratieve verlichting van een plaat met 96 putjes wanneer de kamerverlichting AAN (A) of UIT (B) is ingeschakeld. Aangepast van Lefebvre, A. et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Elke put wordt afzonderlijk en weg van de enkele LED (tot twee meter) verlicht door het gebruik van een bundel optische vezels (Figuur 4).

figure-results-2
Afbeelding 4: De optische vezelbundel die de individuele verlichting van de putten van een plaat met 96 putjes mogelijk maakt, weg van de enkele LED. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de werkzaamheid van het CELL-LED-550/3-apparaat vast te stellen, werd het vermogen om RB-gemedieerde PDT op de HepG2-hepatocarcinoomcellijn te induceren geëvalueerd. Cellen werden behandeld met toenemende concentraties Bengaalse roos, variërend van 0-100 μM gedurende 2 uur vóór verlichting. Het gebruik van een dergelijk scala aan concentraties gericht op het bepalen van de effectieve dosis (EC50) van Rose Bengal die HepG2-cellen zou doden bij blootstelling aan groen licht. De impact van de lichtdosis die door het CELL-LED-550/3-apparaat wordt afgegeven op de inductie van celdood in HepG2-cellen werd ook bestudeerd. Om dit te doen, werden de cellen blootgesteld aan licht gedurende 8 minuten 9 s, 16 minuten 18 s of 32 minuten 36 s met een intensiteit van 0,62 mW/cm2 om lichtdoses van respectievelijk 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 en 1,22 J/cm2 te verkrijgen.

Ten eerste werd waargenomen dat verlichting alleen, in afwezigheid van Rose Bengal (Lichtconditie, Figuur 5), geen effect had op de levensvatbaarheid van HepG2-cellen, ongeacht de ontvangen dosis licht. Er werd ook waargenomen dat Bengaalse roos alleen, in afwezigheid van licht (RB-conditie, figuur 5), geen verandering in de levensvatbaarheid van de cellen veroorzaakte voor een van de geteste omstandigheden. Daarentegen tonen de resultaten aan dat RB-gemedieerde PDT met behulp van CELL-LED-550/3 in staat is om HepG2-cellen te doden. Bovendien werd een verhoogde werkzaamheid waargenomen in correlatie met een verhoogde lichtdosis, met een maximale effectieve concentratie (EC50) van 34,3 μM voor een lichtdosis van 0,30 J/cm2, 26,6 μM voor een dosis van 0,60 J/cm2 en 6,8 μM voor een dosis van 1,2 J/cm2.

Deze resultaten bevestigden de effectiviteit van dit nieuwe PDT-apparaat voor RB-gemedieerde PDT (Figuur 5).

figure-results-3
Figuur 5 — Werkzaamheid van het hulpmiddel in relatie tot de levensvatbaarheid van de HepG2-cellijn. Percentage van de levensvatbaarheid 24 uur na behandeling van HepG2. NT, onbehandeld; RB, alleen fotosensibilisator (0 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 75 μM en 100 μM); licht, verlichting voor 0,30 J/cm2, 0,60 J/cm2 en 1,22 J/cm2; PDT, verlichting met RB-behandeling. De resultaten worden gepresenteerd als gemiddelden ± SEM van drie onafhankelijke experimenten, uitgedrukt als een percentage van de NT. Er werd een ANOVA-test in twee richtingen uitgevoerd, met p ≤ 0,01 (**); p ≤ 0,0001 (****) wordt als statistisch significant beschouwd en p ≥ 0,05 wordt als niet-significant beschouwd (NS). Aangepast van Lefebvre, A. et al.30. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft zowel het protocol voor de ontwikkeling van een innovatief verlichtingsapparaat voor RB-gemedieerde PDT in vitro als het protocol voor de implementatie van een proof of concept voor het aldus ontwikkelde CELL-LED-550/3-apparaat30.

CELL-LED-550/3 bestaat uit twee delen, elk met een specifieke functie. Het doel van het eerste deel, het lichtbrongedeelte genoemd, is om uit een enkele LED een homogene groene lichtbundel te genereren met een diameter die groter is dan die van de glasvezelbundel van het tweede deel. Dit laatste, het lichtverdelergedeelte genoemd, heeft tot doel het licht dat door het lichtbrongedeelte wordt geleverd, via de glasvezelbundel afzonderlijk en weg van de LED naar de putten van een plaat met 96 putjes te verdelen. Op een afstand van de LED tot 2,5 m kunnen de cellen zo lang als nodig worden verlicht zonder enig risico op schadelijke thermische effecten die kunnen optreden als gevolg van de ongecontroleerde warmte die in de LED wordt gegenereerd.

Deze functie biedt een eerste belangrijk voordeel van de CELL-LED-550/3 ten opzichte van de andere LED-gebaseerde systemen die speciaal zijn ontworpen voor 96-well plaatverlichting 31,32,33,34,35,36. Bij alle andere systemen wordt de plaatsing van de LED(s) immers slechts enkele centimeters onder de cellen (meestal minder dan 5 cm) ingehouden, wat onvoldoende is om het risico van LED-gerelateerde schadelijke thermische effecten voor de cellen uit te sluiten. Om dit risico te beperken, bevatten de meeste van deze andere systemen (helaas doen sommige dat niet) een LED-koelsysteem 32,34,35 dat soms zeer (te) dicht bij de cellen is geplaatst, dat dan contraproductief kan worden beïnvloed door de resulterende thermische fluctuaties. Het ontwerp van het CELL-LED-550/3-apparaat in twee delen biedt nog een belangrijk voordeel ten opzichte van de meeste andere bestaande LED-gebaseerde systemen 31,32,33,35,36: dit maakt het mogelijk om de cellen in een celkweekincubator te verlichten zonder enig risico voor het apparaat. Het lichtverdelergedeelte, dat geen elektronische componenten bevat, kan inderdaad in de couveuse worden geplaatst, terwijl het lichtbrongedeelte, dat elektronische componenten bevat die gevoelig zijn voor vochtige omgevingen, buiten wordt gehouden om het risico van corrosie of defecten te voorkomen. Sommige bestaande op LED's gebaseerde systemen, inclusief elektronische componenten, maken een verlichting in een couveuse mogelijk, maar een dergelijk gebruik wordt ten eerste niet aanbevolen door de ontwerpers/fabrikanten en vereist ten tweede een "voldoende" droging na gebruik 33,34. Het vermogen om de cellen in een incubator te verlichten en zo de cellen tijdens het protocol onder dezelfde fysiologische omstandigheden (temperatuur, vochtigheid en CO2 -concentratie) te houden, is cruciaal om mogelijke vertekeningen bij de beoordeling van de levensvatbaarheid van cellen na PDT te voorkomen, vooral voor protocollen die lange verlichtingstijden vereisen. Er moet ook worden benadrukt dat het CELL-LED-550/3-apparaat een enkele LED bevat om alle 96 putten afzonderlijk en gelijktijdig te verlichten. Deze originele en innovatieve functie is niet beschikbaar met een van de andere bovengenoemde LED-gebaseerde systemen 31,32,33,34,35,36. De meeste van deze systemen bevatten 96 LED's, waarbij één LED onder elke put is geplaatst, en leveren daarom 96 individuele stralen 31,33,34,36, terwijl de overige systemen, van 6 tot 25 LED's die op enkele centimeters van de putplaat zijn geplaatst, een globale straal leveren die alle of een deel van de putten bestrijkt 31,32,35 . Op basis van de literatuur is nog nooit eerder voorgesteld om 96 individuele bundels te genereren uit een enkele LED, zoals CELL-LED-550/3 doet door het gebruik van een glasvezelbundel.

Het lichtbrongedeelte omvat een 550 nm 3 W LED die is geselecteerd op basis van twee hoofdcriteria. Ten eerste moet het emissiespectrum van de LED (en dus de centrale golflengte) het absorptiespectrum van de RB-fotosensibilisator overlappen. Zo'n overlapping, die perfect wordt bereikt met de geselecteerde LED (centrale golflengte: 554,4 nm; FWHM: 106,4 nm; beide geschat volgens de methodologie beschreven in Lefebvre et al.30) (Figuur 6), is essentieel voor de RB-foto-activering en dus voor de inductie van een RB-gemedieerde PDT. Ten tweede moet het optische vermogen van de LED lager zijn dan 5 W. Deze vermogensbeperking wordt opgelegd door het toelaatbare vermogen van de collimerende lens die in het lichtbrongedeelte is opgenomen en door dat van de optische vezelbundel die in het lichtverdelergedeelte is opgenomen.

figure-discussion-1
Figuur 6 :Absorptiespectrum van Bengaalse roos in water. Het max-genormaliseerde absorptiespectrum van Rose Bengal in water wordt uitgezet volgens de linkeras en de gemiddelde spectrale bestralingssterkte van CELL-LED-550/3 wordt geschaald volgens de rechteras. Het profiel van de gemiddelde spectrale bestraling komt overeen met dat van de LED die beschikbaar is op de website van de fabrikant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

De optische koppeling tussen de twee delen van het apparaat is een kritische factor. Deze koppeling heeft enerzijds tot doel om het maximale van het licht dat door de 3 W LED wordt uitgestraald op te vangen in een smalle bundel en anderzijds om deze bundel in de glasvezelbundel te injecteren. Wat het eerste doel betreft, maakt een asferische collimatorlens met een korte brandpuntsafstand, speciaal ontworpen voor PCB (Printed Circuit Board) gemonteerde LED, het mogelijk om de 120-graden LED-straal te concentreren in een 10-graden smalle bundel met ruimtelijk uniforme verdeling. De resulterende straal projecteert bovendien beelden van de vierkante LED-chip, die een verbeterde helderheid en minder optische aberraties vertonen in vergelijking met die verkregen met de initiële straal. Wat betreft de injectie van deze smalle bundel in de glasvezelbundel moeten vier belangrijke punten worden aangepakt. Eerst worden de proximale uiteinden van de 96 PMMA (polymethylmethacrylaat) optische vezels met een diameter van 0,5 mm (numerieke apertuur: 0,2) samengebracht tot een zelfgemaakte connector, zodat ze een vierkant lichtontvankelijk oppervlak vormen met zijden van 5 mm (Figuur 7). Om het lichtverlies te beperken, werd de voorkeur gegeven aan een vierkante vorm, in lijn met de vierkante uitsteeksels van de LED-chip door de bundel, boven de gebruikelijke ronde vorm voor de connector. Ten tweede is de zelfgemaakte connector zowel ontworpen om geen lijm nodig te hebben als 3D-geprint met een kristalheldere hars om de lichtabsorptie te beperken en zo oververhitting/carbonisatie van het materiaal te voorkomen. Ten derde werden zowel het lichtgevoelige oppervlak als het uiteindelijke oppervlak van de connector gepolijst met behulp van een polijstschijf, zodat het maximale licht er doorheen gaat. Ten vierde en ten slotte werd de afstand tussen de lens en het vierkante lichtontvangende oppervlak theoretisch bepaald en vervolgens op een optische bank aangepast, zodat het meest homogene centrale deel van de vierkante LED-projectie iets meer overlapt dan het lichtreceptieve oppervlak.

Met een dergelijke koppeling wordt een vermogen van 1,25 W verkregen voor de smalle bundel van 10 graden, terwijl het totale vermogen dat door de bundel van 96 optische vezels wordt doorgelaten 0,12 W is (er werd een fotodiodesensor gebruikt die geschikt is voor LED-licht (OPHIR).

figure-discussion-2
Figuur 7: Vierkant lichtontvankelijk oppervlak dat wordt verkregen door de 96 optische vezels samen te voegen tot een zelfgemaakte connector. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

CELL-LED-550/3 levert een gemiddelde instraling van 0,62 mW/cm2 (standaarddeviatie: 0,09 mW/cm2) (Figuur 8) aan de onderkant van de putten. Dit gemiddelde, waarbij rekening wordt gehouden met de bovengenoemde koppelingsefficiëntie, werd geschat en bleek stabiel te zijn in de tijd (variatiecoëfficiënt lager dan 0,6%) volgens de methodologieën die in detail zijn beschreven in Lefebvre en al.30. Met zo'n lage instraling (lager dan die van de hierboven besproken andere LED-gebaseerde systemen die speciaal zijn ontworpen voor plaatverlichting met 96 putjes), is bewezen dat verlichting alleen geen effect heeft op de levensvatbaarheid van HepG2-cellen, terwijl een zeer hoge efficiëntie is bereikt voor RB-gemedieerde PDT. Voor PDT-protocollen die hogere bestralingen vereisen om efficiëntie te garanderen, kunnen meerdere LED's worden gebruikt, en daarom kunnen meerdere lichtbrononderdelen worden geïmplementeerd, op voorwaarde dat het lichtvermogen dat in elke optische vezel wordt geïnjecteerd het toelaatbare vermogen van enkele tientallen milliwatt niet overschrijdt.

figure-discussion-3
Figuur 8 :Histogram dat de verdeling weergeeft van de bestralingen die aan de 96 putjes van een plaat worden geleverd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Door alleen de LED in het lichtbrongedeelte te vervangen door een andere geschikte LED, is het mogelijk om een ander CELL-LED-apparaat te verkrijgen. Een LED wordt als geschikt beschouwd als deze een optisch vermogen uitstraalt dat lager is dan 5 W (om de hierboven genoemde redenen) in het zichtbare bereik (volgens de specificaties van de glasvezelbundel). Aangezien er een aanzienlijk aantal van dergelijke LED's bestaat, zou een grote verscheidenheid aan CELL-LED-apparaten kunnen worden ontwikkeld en zouden daardoor veel PDT-protocollen in vitro kunnen worden geëvalueerd. Gegeven een PDT-protocol verdient de LED die de beste overlapping biedt met het absorptiespectrum van de betreffende fotosensibilisator uiteraard de voorkeur van alle geschikte LED's. In het geval van een vervanging van de LED moet bijzondere aandacht worden besteed aan de koellichaamconstructie van de ventilator. In feite moet dit geheel de juiste afmetingen hebben om oververhitting en daaropvolgende degradatie van zowel de LED als de driver te voorkomen. Bovendien is een nieuwe optische en thermische karakterisering nodig voor elke LED-vervanging.

Zowel de mogelijkheid om de meeste fotosensibilisatoren te activeren door eenvoudige vervanging van een enkele LED, als de mogelijkheid om de cellen in een incubator te verlichten, bieden een echte meerwaarde voor dit apparaat in vergelijking met de bestaande.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen het Centraal Ziekenhuis van Lille, Frankrijk, en INSERM bedanken voor hun steun aan onze studie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
550 nm 3 W LED gemonteerd op een printplaat OSRAMOSTAR KP CSLPM1.F1
75 cm2 CultuurcelkolfSarstedt3911002
Pakket van 100 kunststof optische vezels (0,5 mm diameter)ARCENCIEL LEDfibre05egmGlow End PMMA 0,5 dia - Lng  200 m     http://arcenciel-led.fr/accueil/193-fibre-optique-end-glow-05mm-prijs-per-m.html
CeltellerThermoFisherAMQAF2000Optioneel, je kunt tellen onder microscoop
Celcultuur incubatorPHCI (Dutscher)MCO-170AICUVD-PE
Cell Titer GloPromegaG7571
Heldere PMMA collimaterende lensGlecc store14mm Lens 10°Aliexpress - DEL collimating lens met 14 mm ondersteuning
Colorfab Ngen BlackColorfab SKU 020014FDA voedselcontactconformiteit
Colorfab Ngen WhiteColorfab SKU 020013FDA voedselcontactconformiteit
Stroomdriver met tri-mode dimming (CDM Driver)CDM DriverBD392200 mA
Epoxyhars CléopatreCrystal'DiamondCristal Diamond 150 mL
Fan heatsinkassemblageBOYD
HepG2 cellenATCCHB-8065
Multimodaal leesapparaat (CLARIOstar Plus)BMG Labtech430-2927
FosfaatbufferoplossingThermoFisher20012-068
PMMA (polymethylmethacrylaat) optische vezels (numerieke opening: 0,2)Guangzhou Mayki Lighting Limited
StroomaansluitingRSpro907-5680
RMPI 1640ThermoFisher21875-091
Wiegelschakelaar RSpro419-744
Rose BengaleThermoFisher / MerckA17053.14 / 330000-1G
Krasbestendig mylarbladRSproRS: 785-0802
OmhulselAUPROTECTØ 8,5 mm / Ø ext 11 mmPP Polypropyleen UV-bestendige zwarte golfomhulsel niet gesplitst
SVFEurobioCVF SVF00-01
CalqueerpapierCanson79368730
Transparante PMMA plaatRSproRS: 284-6269
TrypanblauwThermoFisher15250061
TrypsineThermoFisher25200-072
Ultimaker 2+Ultimaker
Witte heldere bodem 96-well plaatDutscher655098

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Llovet, J. M., et al. Hepatocellular carcinoma. Nat Rev Dis Primer. 7 (1), 1-28 (2021).
  3. Erstad, D. J., Tanabe, K. K. Hepatocellular carcinoma: Early-stage management challenges. J Hepatocell Carcinoma. 4, 81-92 (2017).
  4. Tabori, N. E., Sivananthan, G. Treatment options for early-stage hepatocellular carcinoma. Semin Intervent Radiol. 37 (5), 448-455 (2020).
  5. Tsuchiya, N., et al. Biomarkers for the early diagnosis of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol. 21 (37), 10573-10583 (2015).
  6. Puisieux, M. F., et al. Therapeutic management of advanced hepatocellular carcinoma: An updated review. Cancers. 14 (10), 2357(2022).
  7. Morton, C. A., et al. European dermatology forum guidelines on topical photodynamic therapy 2019 Part 1: treatment delivery and established indications - actinic keratoses, Bowen's disease and basal cell carcinomas. Eur Acad Dermatol Venereol. 33 (12), 2225-2238 (2019).
  8. Plaetzer, K., Krammer, B., Berlanda, J., Berr, F., Kiesslich, T. Photophysics and photochemistry of photodynamic therapy: Fundamental aspects. Lasers Med Sci. 24 (2), 259-268 (2009).
  9. Agostinis, P., et al. Photodynamic therapy of cancer: An update. CA Cancer J Clin. 61 (4), 250-281 (2011).
  10. Castano, A. P., Demidova, T. N., Hamblin, M. R. Mechanisms in photodynamic therapy: Part two-cellular signaling, cell metabolism and modes of cell death. Photodiagnosis Photodyn Ther. 2 (1), 1-23 (2005).
  11. Krammer, B. Vascular effects of photodynamic therapy. Anticancer Res. 21 (6B), 4271-4277 (2001).
  12. Falk-Mahapatra, R., Gollnick, S. O. Photodynamic therapy and immunity: An Update. Photochem Photobiol. 96 (3), 550-559 (2020).
  13. Mosaddad, S. A., et al. Photodynamic therapy in oral cancer: A narrative review. Photobiomodul Photomed Laser Surg. 41 (6), 248-264 (2023).
  14. Guidolin, K., et al. Photodynamic therapy for colorectal cancer: A systematic review of clinical research. Surg Innov. 29 (6), 788-803 (2022).
  15. Osuchowski, M., Bartusik-Aebisher, D., Osuchowski, F., Aebisher, D. Photodynamic therapy for prostate cancer - A narrative review. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102158(2021).
  16. Gustalik, J., Aebisher, D., Bartusik-Aebisher, D. Photodynamic therapy in breast cancer treatment. J Appl Biomed. 20 (3), 98-105 (2022).
  17. Domka, W., et al. Photodynamic therapy in brain cancer: mechanisms, clinical and preclinical studies and therapeutic challenges. Front Chem. 11, 1250621(2023).
  18. Crous, A., Abrahamse, H. Photodynamic therapy of lung cancer, where are we. Front Pharmacol. 13, 932098(2022).
  19. Calzavara-Pinton, P. G., et al. Methylaminolaevulinate-based photodynamic therapy of Bowen's disease and squamous cell carcinoma. Br J Dermato. 159 (1), 137-144 (2008).
  20. Basset-Seguin, N., et al. Topical methyl aminolaevulinate photodynamic therapy versus cryotherapy for superficial basal cell carcinoma: A 5 year randomized trial. Eur J Dermatol. 18 (5), 547-553 (2008).
  21. Szeimies, R. M., et al. A clinical study comparing methyl aminolevulinate photodynamic therapy and surgery in small superficial basal cell carcinoma (8-20 mm), with a 12-month follow-up. J Eur Acad Dermatol Venereol. 22 (11), 1302-1311 (2008).
  22. The IMmunotherapy Pleural 5-ALA PDT. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04400539 (2025).
  23. Blue-Light Photodynamic Therapy and Sonidegib for Multiple Basal Cell Carcinomas. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT06623201 (2025).
  24. Neoadjuvant PDT in the Treatment of Cholangiocarcinoma. , ClinicalTrials.gov. At https://clinicaltrials.gov/study/NCT04824742 (2025).
  25. Correia, J. H., Rodrigues, J. A., Pimenta, S., Dong, T., Yang, Z. Photodynamic therapy review: principles, photosensitizers, applications, and future directions. Pharmaceutics. 13 (9), 1332(2021).
  26. Bartusik-Aebisher, D., Ożóg, Ł, Domka, W., Aebisher, D. Rose Bengal and future directions in larynx tumor photodynamic therapy. Photochem Photobiol. 97 (6), 1445-1452 (2021).
  27. Srivastav, A. K., et al. Photosensitized rose Bengal-induced phototoxicity on human melanoma cell line under natural sunlight exposure. J Photochem Photobiol. B, Biology. 156, 87-99 (2016).
  28. Uddin, M. M. N., et al. Encapsulated Rose Bengal enhances the photodynamic treatment of triple-negative breast cancer cells. Molecules (Basel, Switzerland). 29 (2), 546(2024).
  29. Osuchowski, M., et al. Photodynamic therapy-adjunctive therapy in the treatment of prostate cancer. Diagnostics (Basel, Switzerland. 12 (5), 1113(2022).
  30. Lefebvre, A., et al. Photodynamic therapy using a Rose-Bengal photosensitizer for hepatocellular carcinoma treatment: Proposition for a novel green LED-based device for in vitro investigation. Biomedicines. 12 (9), 2120(2024).
  31. Bounds, A. D., Bailey, R. D., Adams, C. T., Callaghan, D. C., Girkin, J. M. LightBox: A multi-well plate illumination system for photoactive molecule characterization. J Biophotonics. 14 (5), e202000481(2021).
  32. Zhang, K., Timilsina, S., Waguespack, M., Kercher, E. M., Spring, B. Q. An open-source LED array illumination system for automated multi-well plate cell culture photodynamic therapy experiments. Sci Rep. 12 (1), 1-10 (2022).
  33. optoWELL. , opto biolabs. at https://optobiolabs.com/products/optowell/ (2025).
  34. Repina, N. A., et al. Engineered illumination devices for optogenetic control of cellular signaling dynamics. Cell Rep. 31 (10), 107737(2020).
  35. Hopkins, S. L., et al. An in vitro cell irradiation protocol for testing photopharmaceuticals and the effect of blue, green, and red light on human cancer cell lines. Photochem Photobiol Sci. 15 (5), 644-653 (2016).
  36. Hadis, M. A., et al. Development and application of LED arrays for use in phototherapy research. J Biophotonics. 10 (11), 1514-1525 (2017).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

LED Illumination DeviceIn Vitro PDTHepG2 CellsCell Viability Assay96 Well PlatePhotosensitizer ApplicationGreen Light IrradiationCancer Cell Treatment

Gerelateerde artikelen