Modellering van persistente Pseudomonas aeruginosa-infectie bij gewonde zebravislarven

Samenvatting

Er is momenteel een gebrek aan in vivo modellen die geschikt zijn voor screening van geneesmiddelen tegen chronische bacteriële infecties. Hier beschrijven we een protocol voor wondinfectie door een Pseudomonas aeruginosa klinisch isolaat om een persisterende infectie bij zebravislarven te genereren.

Samenvatting

Pseudomonas aeruginosa is een belangrijke ziekteverwekker bij de mens, vooral bij chronische wondinfecties en chronische longinfecties (vooral bij patiënten met cystische fibrose (CF)). Chronische bacteriële infecties zijn ongevoelig voor antibioticabehandelingen en er is dringend behoefte aan in vivo modellen voor chronische infecties die vatbaar zijn voor screening op geneesmiddelen om efficiënte therapieën te ontwikkelen. Hier beschrijven we een protocol van infectie door een klinisch isolaat van P . aeruginosa van een CF-patiënt, dat constitutief het groene fluorescerende eiwit (GFP) tot expressie brengt, voor het genereren van een aanhoudende wondinfectie bij zebravislarven. Embryo's met staartvinnen worden gedurende 1,5 uur ondergedompeld in een bacteriële suspensie, gewassen en gedurende 3 dagen gecontroleerd op bacteriële belasting. De bacteriële belasting werd dagelijks gekwantificeerd door fluorescerende kolonievormende eenheden (CFU) te tellen van gelyseerde geïnfecteerde larven, wat een aanhoudende infectie mogelijk maakte. Bovendien waren persistente P. aeruginosa-bacteriën ongevoelig voor antibioticabehandeling. Dit nieuwe in vivo model van persistente P. aeruginosa-infectie biedt mogelijkheden om de werkzaamheid van innovatieve behandelingen tegen chronische infecties te evalueren.

Inleiding

Pseudomonas aeruginosa is een Gram-negatieve pathogene bacterie die verantwoordelijk is voor chronische kolonisatie bij patiënten met cystische fibrose (CF) en wonden ^1,2. P. aeruginosa behoort tot de groep van ESKAPEE-pathogenen en wordt door de Wereldgezondheidsorganisatie erkend als een cruciale prioriteit voor nieuwe therapieën³. Chronische bacteriële infecties zijn moeilijk te behandelen met antibiotica vanwege adaptieve resistentie tegen geneesmiddelen, die verband houdt met meerdere factoren, waaronder biofilmlevensstijl, verminderde groei, lage metabolische activiteit⁴ en intracellulaire levenscyclus⁵. In vivo modellen zijn essentieel om P. aeruginosa chronische infectie beter te begrijpen en te behandelen.

Hoewel er verschillende in vivo modellen zijn gebruikt om de virulentie van P. aeruginosa te beoordelen, zijn er maar heel weinig modellen die het mogelijk maakten om aanhoudende kolonisatie na te bootsen en de werkzaamheid van behandelingen op chronische infectie te testen⁶. Diermodellen om de chronische pathogenese van P. aeruginosa te bestuderen, zijn voornamelijk gebaseerd op de toediening van de bacteriën ingebed in agarkorrels in de longen⁷. Er is ook een model voor chronische huidinfectie bij muizen ontwikkeld⁸. Zebravis (Danio rerio), die tal van voordelen heeft (matige ethische kwesties, lage kosten, hoge eierproductie), is een aantrekkelijk in vivo gewerveld model voor het testen van geneesmiddelen, dat ook real-time visualisatie met hoge resolutie van P. aeruginosa en gastheercellen mogelijk maakt dankzij embryotransparantie⁹.

Zoals gerapporteerd in een review, werden in eerdere studies P. aeruginosa laboratoriumstammen (PAO1, PA14 en PAK) voornamelijk gebruikt in het zebravisinfectiemodel, waar ze een acute infectie^{veroorzaakten 9}. We hebben onlangs een wondinfectieprotocol ontwikkeld op basis van de onderdompeling van met staartvinnen geamputeerde embryo's met P. aeruginosa PAO1-stam, die een acute infectie veroorzaakte¹⁰. De infectie door onderdompeling van gewonde embryo's, die een natuurlijke infectiewijze van P. aeruginosa weerspiegelt, is een infectiewijze die reproduceerbaar en gemakkelijker is dan micro-injectie.

Ons doel was om een protocol op te stellen voor persistente P. aeruginosa-infectie in zebravissen. Voor dit doel was onze strategie om P. aeruginosa klinische stammen te gebruiken, die zelden zijn overwogen in het zebravismodel^11,12, in combinatie met de wondroute van infectie. Hier beschrijven we het protocol dat we hebben ontwikkeld om de persistente kolonisatie van zebravisembryo's te modelleren op basis van een wondinfectie door P. aeruginosa CF klinische isolaten. Dit nieuwe in vivo model voldoet aan onze verwachtingen en biedt nieuwe mogelijkheden om de werkzaamheid van therapieën in de context van aanhoudende kolonisatie te beoordelen, zoals hier en in een begeleidend artikel¹³ beschreven.

Protocol

Alle zebravisexperimenten die in deze studie worden beschreven, werden uitgevoerd aan de Universiteit van Montpellier volgens de 3V's -Vervanging, Vermindering en Verfijning- principes volgens de richtlijnen van de Europese Unie voor het omgaan met proefdieren en werden goedgekeurd door de Direction Sanitaire et Vétérinaire de l'Hérault en het Comité d'Ethique pour l'utilisation d'animaux à des fins scientifiques onder referentie CEEA-LR-B4-172-37. Alle infectie-experimenten werden tot 5 dagen na de bevruchting uitgevoerd op embryo's. De kweek van volwassen zebravissen (Danio rerio) uit de AB of Golden Lines vissen voldeed aan de internationale richtlijnen van de EU Dierenbeschermingsrichtlijn 2010/63/EU. Zebravisfaciliteit van de Universiteit van Montpellier met standaardvoorwaarden ingesteld als een 12 uur: 12 uur licht: donkercyclus, 3,5 L polycarbonaat tank (maximaal 22 vissen per tank) aangesloten op een recirculerend systeem met 4% zoutgehalte/400 μS geleidbaarheid en watertemperatuur van 28 °C. De vissen werden 2x per dag gevoerd met visvoer.

1. Bereiding van oplossingen

1. Bereid een 1x werkende oplossing voor viswater met of zonder methyleenblauw voor het kweken van zebravisembryo's (zie Tabel 1).
2. Bereid 20x bouillon (0,4%) en 1x werkende tricaïne anesthesieoplossing zoals beschreven in tabel 1. Om herhaald invriezen en ontdooien van de stockoplossing te voorkomen, moet u 10 ml 20x tricaïne bereiden en bewaren bij -20 °C.
3. Bereid 2% Triton-oplossing verdund in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Tabel 1).

2. Preparaat van het entmateriaal van fluorescerende  P. aeruginosa dat GFP constitutief tot expressie brengt

OPMERKING: Al het werk met P. aeruginosa wordt gedaan met BSL-2-voorzorgsmaatregelen in een bioveiligheidskast. P. aeruginosa-stammen moeten genetisch gemodificeerd zijn om constitutief een fluorescerende reporter tot expressie te brengen, zoals GFP (zoals hier gebruikt en beschreven in¹³). Het gebruik van stammen met een chromosomaal gecodeerde fluorescerende reporter wordt sterk aanbevolen om het verlies van plasmide te voorkomen in het geval van een plasmide-gecodeerde fluorescerende reporter.

1. Veeg 2 dagen vóór de infectie vanaf -80 °C een voorraad genetisch gemodificeerde P. aeruginosa die GFP tot expressie brengt uit op LB-agarplaten (tabel 1) en incubeer deze 's nachts bij 37 °C.
2. Controleer de fluorescentie van de kolonies met behulp van een fluorescerende microscoop (vergroting 6x) om een GFP⁺P. aeruginosa-kolonie te inoculeren in 1 ml LB-bouillon (tabel 1) en laat een nacht groeien bij 37 °C met schudden (180 rpm).
3. Verdun op de dag van de infectie de bovenstaande nachtcultuur van P. aeruginosa om 1:20 in 5 ml verse LB-bouillon. Kweek de bacteriën bij 37 °C door te schudden (180 rpm) tot de cultuur een OD₆₀₀ = 0,8 bereikt. Dit duurt ongeveer 2-3 uur.
4. Centrifugeer de bacteriecultuur gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) bij 3584 x g. Verwijder het bovenstaande middel en suspendeer de korrel opnieuw in 4 ml viswater zonder methyleenblauw.
5. Pas het volume van de cultuur met viswater aan om 7 x 10⁷ tot 1 x 10⁸ CFU/ml te hebben. Dit komt overeen met een OD₆₀₀ van ongeveer 0,15 (aan te passen voor elke stam).
6. Om het entmateriaal te kwantificeren, voert u een seriële verdunning van de bacteriële suspensie uit, plaat 20 μL van de 10-4 verdunning op een ^LB-agarplaat en incubeert u een nacht bij 37 °C.
7. Tel GFP⁺ -kolonies onder een fluorescerende microscoop om de CFU's van het inoculum te bepalen.

3. Verzameling en preparatie van zebravisembryo's

1. Zet 3 dagen voor het experiment met bacteriële onderdompeling zebravissen op. Plaats een broedmannetje en -vrouwtje in een kruisingsbak.
2. Verzamel de eieren de volgende ochtend na de bevruchting met behulp van een fijnmazige zeef. Leg de verzamelde eieren in een petrischaaltje met viswater met methyleenblauw.
3. Om besmetting te voorkomen, voeg je 1 druppel bleekmiddel toe aan het petrischaaltje. Ververs na 5 minuten het viswater met methyleenblauw om het bleekmiddel te verwijderen.
4. Gooi eieren weg met een abnormale embryonale ontwikkeling (onbevruchte eieren zijn vergelijkbaar met een 1-cellig eistadium) of dode eieren (wit uiterlijk).
5. Op de ochtend van de infectie (bij 2 dpf) dechorioneer de embryo's met twee zeer dunne tangen onder de stereomicroscoop (vergroting 11x). Scheur het chorion met een tang zonder in het embryo te knijpen om het vrij te maken.
6. Plaats de gedechorioneerde embryo's in een petrischaaltje met vis met methyleenblauw. Incubeer de schaaltjes bij 28 °C tot de infectie.

4. Embryo letsel

1. Verdoof zebravisembryo's in viswater zonder methyleenblauw, dat 0,02% tricaïne bevat, ongeveer 5 minuten voor verwonding in een celkweekschaaltje (35 mm x 10 mm). De embryo's bewegen niet meer en reageren niet op prikkels.
2. Plaats naalden van 25 G op de bovenkant van twee eetstokjes om het hanteren van naalden te vergemakkelijken.
3. Elimineer onder een stereomicroscoop embryo's met een abnormale ontwikkeling of dode embryo's. Gebruik een cirkelvormige beweging van de schaal om alle embryo's in het midden te verzamelen.
4. Isoleer embryo's één voor één met behulp van twee naalden in een verticale positie (kop naar beneden - staart omhoog) en plaats de linkernaald bij de staart om deze recht te houden. Knip de vin aan de rand van het notochord af met de rechternaald. Maak de snede in één keer. Niet langer dan 10 minuten tussen het snijden en onderdompelen in de bacteriële oplossing.

5. Infectie van gewonde embryo's

1. Onder de biologische veiligheidskast type II, vortex en voeg de P. aeruginosa-oplossing toe met ongeveer 1 x 10⁷ CFU/ml op een plaat met 6 putjes.
2. Verzamel de gewonde embryo's met een wegwerp Pasteur glazen pipet en voeg ze toe aan de bacteriële oplossing onder de microbiologische veiligheidspaal. Incubeer de plaat gedurende 1,5 uur bij 28 °C.
   OPMERKING: Als er een groot aantal geïnfecteerde larven nodig is, maak dan groepen van ongeveer 50 larven, maak de wond, dompel ze onder en herhaal dit voor de volgende groep.
3. Was de embryo's na infectie onder de microbiologische veiligheidspaal zoals hieronder beschreven.
   1. Breng de embryo's met een glazen pipet voor een wasbeurt over in 10 ml viswater zonder methyleenblauw, voeg zo min mogelijk vloeistof toe, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
   2. Breng de geïnfecteerde embryo's opnieuw over met behulp van een glazen pipet voor een tweede wasbeurt in 4 ml viswater zonder methyleenblauw gedurende een paar minuten.
   3. Breng 24 geïnfecteerde embryo's afzonderlijk over in een plaat met meerdere putjes met 1 ml viswater zonder methyleenblauw.
4. Plaats de platen in een plastic doos in de broedmachine bij 28 °C. Bevochtig de doos (bijvoorbeeld met vochtig keukenpapier) om verdamping te beperken.

6. Overleving van geïnfecteerde embryo's

1. Controleer voor embryooverlevingsstudies de levensvatbaarheid onder een stereomicroscoop 18 uur, 24 uur en 48 uur na infectie (hpi). Een embryo wordt als dood beschouwd wanneer het hart en de bloedcirculatie stoppen.
2. Geef sterfte-/overlevingspercentages weer met behulp van Kaplan-Meier grafische weergaven van de trap (GraphPad Prism 8.3.0) en analyseer de gegevens met een log-rank of andere geschikte statistische tests.

7. Tellen van de bacteriële belasting in geïnfecteerde embryo's (Figuur 1)

1. Voer CFU-bepaling uit van geïnfecteerde embryo's op vier verschillende tijdstippen: 1,5 hpi, d.w.z. direct na infectie, en na elke wasbeurt op 24, 48 en 72 hpi met 5 embryo's/tijdstip. Voer alle stappen onder de microbiologische veiligheidspaal uit.
2. Bereid voor elke geïnfecteerde larve 1,5 ml microcentrifugebuisjes voor die 95 μL 1x PBS bevatten. Het volume van de larven is ongeveer 5 μL.
3. Breng de larven over naar een plaat met 6 putjes met 4 ml viswater zonder methyleenblauw om een wasbeurt uit te voeren en planktonbacteriën te elimineren.
4. Plaats elk embryo in een microcentrifugebuisje met PBS en voeg zo min mogelijk vloeistof toe. Raak gewoon de glazen pipet met de larven op het oppervlak van de PBS aan om de larven in de microcentrifugebuis te laten zinken zonder vloeistof toe te voegen.
5. Plet de embryo's afzonderlijk met behulp van een stamper aan de zijkant van de microcentrifugebuis. Bewaar de stamper in de buis. Bepaal het eindpunt als er geen intact embryo meer over is.
6. Til de stamper op en voeg 100 μL PBS-Triton 2% toe om eventuele resterende bacteriën van de stamper te spoelen (de uiteindelijke concentratie is 1%). Vortex en wacht 10 min. Verwerk niet meer dan vijf embryo's tegelijkertijd.
7. Druppel 3x, 10 μL niet-verdunde lysaten op LB-agarplaten voor elk embryo. Voer een seriële verdunning uit van de lysaten in een plaat met 96 putjes totdat een verdunning van ^10-3 is bereikt met behulp van een meerkanaalspipet. Druppel 3x, 10 μL verdunning 10-1, ^10-2 en ^10-3 naast de onverdunde verdunnen op ^{LB-agarplaten} en incubeer de platen een nacht bij 37 °C.
8. Tel fluorescerende kolonies van elke verdunning onder de microscoop en bereken de CFU per geïnfecteerd embryo.

Figuur 1: Experimentele tijdlijn om bacteriële virulentie en persistentie in zebravisembryo's te beoordelen. Afkortingen: CFU = Kolonievormende eenheden, hpi = uren na infectie. De tekening is gemaakt met BioRender.com. Het cijfer is gewijzigd van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Behandeling testen tegen aanhoudende infectie (Figuur 2)

1. Bereid antibiotische oplossingen bij 40x de minimale remmende concentratie (MIC) voor de P. aeruginosa-stam . Controleer vóór het experiment of de gekozen concentratie antibioticum niet giftig is voor het embryo.
2. Volg stap 7.1 en 7.2. Doe 1 ml viswater met antibiotica in een bord met 24 putjes en voer een controle uit zonder antibiotica.
3. Breng per behandeling vijf embryo's van de wasstap over in de plaat met 24 putjes en voeg zo min mogelijk vloeistof toe.
4. Incubeer met de antibiotica gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Keer terug naar stap 7.3. om de bacteriële belasting na behandeling te kwantificeren.

Figuur 2: Experimentele procedure die wordt gebruikt om de werkzaamheid van antibioticabehandelingen op geïnfecteerde embryo's te beoordelen. Afkortingen: ATB 30' = antibioticabehandeling gedurende 30 min, CFU = kolonievormende eenheden, hpi = uur na infectie. De tekening is gemaakt met BioRender.com. Het cijfer is gewijzigd van¹³. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Het zebravisembryo is een geschikt model om een aanhoudende infectie met P. aeruginosa CF-isolaten te monitoren
We gebruikten de onderdompeling van gewonde embryo's om in vivo de virulentie van drie CF-isolaten (A6520, B6513 en C6490)⁹ te evalueren. We hebben ook het gedrag beoordeeld van een goed gekarakteriseerd laat CF-isolaat, RP73, bekend om langdurige kolonisatie in de luchtwegen van mui...

Discussie

Het modelleren van bacteriële chronische infectie in vivo is essentieel om de pathogenese te begrijpen en de werkzaamheid van de behandeling te evalueren. Hier hebben we een persistent wondinfectiemodel in zebravissen opgesteld dat geschikt is voor het testen van medicijnen tegen P. aeruginosa. Dit vult de leemte van de huidige methodologie met een gebrek aan in vivo modellen die geschikt zijn voor screening van geneesmiddelen tegen chronische bacteriële infect...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ethyl-3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma	E50521
Piston pellet	Eppendorf, Dutscher	33522
zeezouten	Instant Ocean, Aquarium systemen	218035
Triton	Euromedex	2000-B