Methodenartikel

Ookluc: een Plasmodium berghei-lijn voor het identificeren van transmissieblokkerende verbindingen

716 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68466

⸱

11 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Parasitology, Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo

In dit artikel

Samenvatting

De seksuele ontwikkeling van Plasmodium vindt plaats in de middendarm van de mug. Het richten op de seksuele stadia van de parasiet is een veelbelovende strategie om de overdracht te blokkeren. We ontwikkelden Ookluc, een transgene P. berghei die nanoluciferase tot expressie brengt na de vorming van zygoten, waardoor high-throughput screening van transmissieblokkerende verbindingen mogelijk is. In dit artikel worden de methoden voor screening met Ookluc beschreven.

Samenvatting

Malaria blijft een wereldwijde uitdaging voor de gezondheid; In 2023 werden wereldwijd 263 miljoen gevallen en 597.000 doden gemeld. De levenscyclus van de parasiet is complex en gerichte interventies in kritieke ontwikkelingsstadia zijn nodig om de ziekte effectief onder controle te krijgen. Transmissie-blokkerende (TB) strategieën zijn gericht op het onderbreken van de overdracht van Plasmodium door zich te richten op de muggenvector of de seksuele stadia van de parasiet door middel van vaccins en medicijnen. Tbc-interventies kunnen zich richten op gametocyten in de menselijke gastheer of andere vormen in de middendarm van de mug, zoals gameten, zygoten, ookineten en oöcysten.

De ontwikkeling van nieuwe tbc-benaderingen staat voor grote uitdagingen. Het bestuderen van de seksuele stadia van de parasiet is inherent moeilijk, en high-throughput screening (HTS) voor gametocytocide verbindingen is voornamelijk gebaseerd op P. falciparum culturen. Robuuste in vitro instrumenten voor het beoordelen van interventies tegen latere seksuele stadia blijven echter beperkt. Om de ontdekking van tbc-verbindingen te versnellen, ontwikkelde onze groep een nieuwe HTS-test voor activering en bevruchting van gametocyten met behulp van P. berghei, een muizenmodel van Plasmodium-infectie . De transgene parasiet, Ookluc, brengt nanoluciferase uitsluitend tot expressie na de vorming van zygote, met piekluminescentie tijdens de ontwikkeling van ookinetes. Deze op luminescentie gebaseerde test biedt een kwantitatieve uitlezing van gamet naar zygote en zygote naar ookinete differentiatie, waarbij verhoogde luminescentie direct correleert met ookinete vorming. Dit video-artikel presenteert de methoden voor het screenen van malaria-tbc-verbindingen met behulp van Ookluc.

Inleiding

Malaria is een oude ziekte die de menselijke geschiedenis diepgaand heeft gevormd. Alleen al in 2023 werden 263 miljoen gevallen gemeld in 85 endemische landen, met 597.000 doden totgevolg1. De ziekte wordt veroorzaakt door protozoaire parasieten van het geslacht Plasmodium, behorend tot de phylum Apicomplexa. Van de vijf soorten die mensen infecteren - P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale en P. malariae - P. falciparum en P. vivax zijn goed voor de meerderheid van de gevallen. P. falciparum wordt geassocieerd met ernstige malaria en komt vooral voor in Afrika, terwijl P. vivax de breedste geografische verspreiding heeft en vaker voorkomt in Zuid-Amerika en Azië2.

De complexiteit van de levenscyclus van Plasmodium , die meerdere ontwikkelingsstadia over twee gastheren omvat, vergemakkelijkt de overdracht en persistentie ervan in endemische regio's3. Een cruciale stap in deze cyclus is de overgang van mensen naar de muggenvector, waardoor het een belangrijk doelwit voor interventie is. De overdracht begint binnen de menselijke gastheer, waar de seksuele stadia van Plasmodium zich ontwikkelen naarmate merozoïeten differentiëren in mannelijke en vrouwelijke gametocyten. Bij inname door een mug veroorzaken omgevingssignalen activering van gametocyten en vorming van gameten, wat leidt tot bevruchting in het lumen van de middendarm. De resulterende zygote differentieert zich in een beweeglijke ookinete, die actief het epitheel van de middendarm binnendringt en zich ontwikkelt tot een oöcyst in de basale lamina. In de oöcyst worden duizenden sporozoïeten gegenereerd en vervolgens vrijgegeven in de hemolymfe, waardoor ze naar de speekselklieren kunnen migreren. Daar dringen sporozoïeten de acinaire cellen binnen en gaan ze naar het klierlumen, waar ze blijven totdat de mug zijn volgende bloedmaaltijd neemt en de parasiet overbrengt op de menselijke huid4.

De zoektocht naar nieuwe strategieën voor het blokkeren van transmissie (tbc) is van cruciaal belang gezien de beperkingen van beschikbare medicijnen en de toenemende resistentie tegen antimalariamiddelen5. Traditionele screeningmethoden, zoals muggeninfecties, handmatige microscopische analyse of opname van radioactieve hypoxanthine, zijn arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren en ongeschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer 6,7. Recentere benaderingen met behulp van op fluorescentie gebaseerde detectie (bijv. DNA-kleuring of GFP-reporters) hebben de efficiëntie verbeterd, maar er blijven aanzienlijke uitdagingen bij het beoordelen van verbindingen die gericht zijn op de seksuele stadia van de parasiet 6,7,8.

Om deze uitdagingen aan te gaan, werd een transgene P. berghei-lijn ontwikkeld die nanoluciferase (nLuc) tot expressie brengt, Ookluc genaamd,8. In dit systeem wordt het nLuc-gen onder controle geplaatst van de ookinete-specifieke P. berghei Circumsporozoite- and TRAP-related protein (CTRP) -promotor, die wordt geactiveerd in zygoten, wat leidt tot de productie van nLuc die ongeveer 6 uur na activering van de gameten begint en 24 uur na de conversietest piekt8. Dit ontwerp maakt geautomatiseerde, op luminescentie gebaseerde kwantificering van de levensvatbaarheid van parasieten kort na bevruchting mogelijk - waardoor directe vectormanipulatie niet meer nodig is - en vergemakkelijkt high-throughput screening van duizenden verbindingen8.

Hoewel nLuc-expressie optreedt ongeacht de levensvatbaarheid van ookineet, waardoor de detectie van verbindingen die specifiek van invloed zijn op latere stadia, zoals ookinete morfogenese, wordt beperkt, blijft Ookluc zeer effectief voor het identificeren van tbc-verbindingen die gericht zijn op gametogenese, seksuele recombinatie of overleving van parasieten in de mug, inclusief middelen die de productie van reactieve zuurstofsoorten induceren. Eerdere studies hebben dit systeem gevalideerd door met succes verbindingen te identificeren waarvan bekend is dat ze de seksuele stadia van Plasmodium 9,10,11,12,13,14,15 remmen. Ookluc vertegenwoordigt dus een robuust en innovatief platform voor high-throughput screening van Plasmodium seksuele stadia, waardoor de ontdekking van nieuwe tbc-verbindingen wordt vergemakkelijkt en de inspanningen voor de eliminatie van malaria in de komende jaren worden bevorderd8. Dit protocol schetst de toepassing van het Ookluc-systeem voor geneesmiddelenscreening en bepaling van remmende concentratie 50% (IC50).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in strikte overeenstemming met ethische richtlijnen en werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Diergebruik van het Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo (CEUA-ICB/USP). Dieren werden gehuisvest en onderhouden in overeenstemming met de normen die door deze commissie zijn vastgesteld. Experimenten met genetisch gemodificeerde Plasmodium-parasieten , evenals hun gecryopreserveerde opslag bij -80 °C, werden uitgevoerd in overeenstemming met de voorschriften die zijn opgesteld door het Institutional Biosafety Committee van het Institute of Biomedical Sciences, University of São Paulo (CIBio-ICB/USP). In totaal werden drie vrouwelijke BALB/c-muizen in de leeftijd van 3-5 weken gebruikt in deze studie: twee geïnfecteerde en één niet-geïnfecteerde.

1. Materialen en reagentia

  1. Bereid het ookinete medium voor door RPMI 1640 aan te vullen met 0,025 M HEPES, penicilline-streptomycine-neomycine (PSN), 50 mg/L hypoxanthine en 100 μM xanthureninezuur. Stel de pH in op 8,3 8,16.
  2. Bereid de werkoplossing voor de luminescentietest voor door 1 volume substraat te mengen met 50 volumes van de lysisbuffer die in het luciferase-assaysysteem is voorzien.
  3. Stel een broedmachine in op 21 °C.

2. Infectie en geparasiteerde bloedafname

  1. Infecteer twee vrouwelijke BALB/c-muizen (4-6 weken oud) met 150 μL gecryopreserveerde Ookluc-stam via intraperitoneale (IP) injectie (dag 0).
    OPMERKING: In dit protocol raden we het gebruik van BALB/c-muizen aan vanwege hun gemakkelijke beschikbaarheid en wijdverbreid gebruik in dierenfaciliteiten. Elke wildtype muizenstam die vatbaar is voor P. berghei-infectie en gametocytogenese ondersteunt, moet echter geschikt zijn voor gebruik.
  2. Beoordeel vanaf dag 3 parasitemie en gametocytemie door microscopisch onderzoek van met Giemsa bevlekte bloeduitstrijkjes.
  3. Wanneer parasitemie en gametocytemie respectievelijk ongeveer 5% en 0,5% bereiken (meestal op dag 4), verzamel dan bloed via een hartpunctie met behulp van gehepariniseerde spuiten en verzamel het bloed van beide geïnfecteerde muizen.
    OPMERKING: Hoewel dit een transgene lijn van P. berghei is, zijn de groei en het gametocytemieprofiel vergelijkbaar met die waargenomen bij de ANKA-stam. In deze context is het aandeel gametocyten ten opzichte van de totale parasitemie ongeveer 10x lager.
    OPMERKING: Idealiter wordt de samengestelde plaat (zie hieronder) bereid vóór de afname van geparasiteerd bloed, zodat het bloed onmiddellijk na afname naar de plaat wordt gepipetteerd. Als het bloed van de muis in een andere ruimte moet worden afgenomen of als het om een andere reden niet onmiddellijk naar de samengestelde plaat kan worden gepipetteerd, moet het afgenomen bloed niet langer dan 30 minuten op 37 °C worden bewaard.

3. Conversietest - zeven in platen met 96 putjes

OPMERKING: Om consistente resultaten te garanderen, moet het hele experiment drie keer op verschillende dagen worden herhaald om de bevindingen te bevestigen.

  1. Bereid de monsters van de verbinding voor met behulp van ookinete medium als verdunningsmiddel (een uiteindelijke concentratie van 10 μM). Verdun de samengestelde voorraad tot 1 mM en bereid werkmonsters voor door de 1 mM voorraad 1:100 v:v te verdunnen in Ookinete Medium. Bereid voor één test in tweevoud een eindvolume van 200 μl werkmonster voor.
  2. Als de verbinding is verdund in een ander oplosmiddel dan water, voeg dan een controlemonster toe dat het oplosmiddel verdund in ookinete medium bevat in dezelfde verhouding als in het testmonster om er zeker van te zijn dat de waargenomen remming toe te schrijven is aan de verbinding en niet aan het oplosmiddel.
    LET OP: Als voorbeeld zullen we 90 verbindingen screenen.
  3. Plaats met behulp van twee platen met 96 putjes 80 μl van de monsters in elk putje, als volgt en geïllustreerd in figuur 1, in tweevoud (twee platen): Positieve controle: 80 μl ookinete medium; Negatieve controle: 80 μL ookinete medium; Oplosmiddelcontrole: 80 μL ookinete medium met 1% DMSO; Monsters: 80 μL van 10 μM van elke verbinding in ookinete medium.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematische weergave van een plaatlay-out met 96 putjes, ontworpen voor het screenen van verbindingen. De lay-out van de plaat omvat positieve controle (C+), negatieve controle (C-), controle plus verdunningsoplosmiddel (C+S) en 90 teststoffen (S1-S90). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voeg 4 μL geparasiteerd muizenbloed toe aan elk putje van de plaat met 96 putjes in een verhouding van 1:20 v:v, behalve aan de negatieve controle (C-). Homogeniseer voorzichtig door te pipetteren.
    OPMERKING: Rekening houdend met verliezen, berekenen we de behoefte van ~400 μL geparasiteerd bloed voor elke plaat.
  2. Voeg voor de negatieve controle niet-geïnfecteerd muizenbloed toe in een verhouding van 1:20 (v:v, bloed:monster). Voorzichtig homogeniseren.
  3. Incubeer bij 21 °C gedurende 6 uur of 24 uur.
    OPMERKING: nLuc-activiteit is detecteerbaar met 6 uur incubatie en piekt na 24 uur van de test8. De test is niet in staat om verbindingen te identificeren met activiteit na de vorming van zygote, zoals verbindingen die de morfogenese van ookinete remmen, omdat gevormde zygoten nLuc zullen accumuleren, ongeacht de voltooiing van de morfogenese. Daarom is een incubatie van 6 uur voldoende om alle verbindingen te detecteren die de nLuc-activiteit blokkeren door gametogenese, seksuele recombinatie te remmen of vroege cytotoxiciteit te hebben. Normaal gesproken geven we echter de voorkeur aan incubaties van 24 uur om sterkere signalen en een betere signaal-ruisverhouding te hebben.

4. Luminescentie-test

  1. Na de incubatietijd homogeniseren van monsters door op en neer te pipetteren om een grondige vermenging van bloed en medium te garanderen.
  2. Bereid het lysisbuffer/luciferase-substraatmengsel direct voor gebruik voor in een verhouding van 1:50 (v:v, substraat:lysisbuffer).
  3. Meng het substraatmengsel met monsters in een verhouding van 1:1 (v:v) en zorg voor een zachte menging om luchtbellen te voorkomen. Incubeer 3-5 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: In dit voorbeeld hebben we 84 μL substraat:lysis-buffer aan elk putje toegevoegd.
  4. Breng de monsters over op een witte plaat met 96 putjes met platte bodem. Meet de luminescentie met behulp van een plaatlezer. Gebruik de volgende parameterconfiguratie: emissiefilter: lens; meetintervaltijd: 1 s per putje.

5. Gegevensanalyse - screening

  1. Noteer na de luminescentietest de onbewerkte gegevens die verschijnen (Figuur 2).
    OPMERKING: De verkregen Relative Light Units (RLU) zijn afhankelijk van de gebruikte lichtmeter. In ons geval varieerden de RLU-waarden voor de positieve controle van 10.000 tot 500.000 in een 24-uurs incubatietest. Kortere incubatietijden (6 uur) resulteren in lagere RLU-waarden.

figure-protocol-2
Figuur 2: Resultaten verkregen uit een gesimuleerde lezing van een conversietest voor screening van verbindingen. De afbeelding toont gesimuleerde luminescentiemetingen van een test die is uitgevoerd na de conversie van ookinetes in aanwezigheid van een panel van 90 verbindingen. Lagere waarden van de Relative Light Unit duiden op een verminderde vorming van ookinite. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Bereken met behulp van een spreadsheet het gemiddelde van elke meting met behulp van de onderstaande formule. Vervang XX door het adres van de eerste meetcel en YY door het adres van de tweede meetcel. Herhaal de formule voor alle monsters.
    =(GEMIDDELDE(XX:JJ)
  2. Zet de data om in % remming voor een betere analyse van de resultaten. Gebruik in de spreadsheet de onderstaande formule. Vervang A door de RLU-waarde van het monster en B door de RLU-waarde van het besturingssysteem. Herhaal de formule voor alle geteste verbindingen:
    = 1 - (A/B) x 100
    OPMERKING: De gegevens worden weergegeven zoals weergegeven in afbeelding 3.

figure-protocol-3
Figuur 3: Resultaten verkregen uit een gesimuleerde lezing van een conversietest voor screening van verbindingen, weergegeven als % remming voor elke verbinding. Percentage van de remming van de omzetting voor elke geteste verbinding, berekend zoals hierboven beschreven. De gemarkeerde vierkanten geven verbindingen aan die meer dan 95% remming van de conversie bevorderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Identificeer de verbindingen die meer dan 95% remming vertonen.
    OPMERKING: Deze verbindingen vertonen een hoge activiteit tegen seksuele stadia bij een concentratie van 10 μM. In ons voorbeeld vonden we vijf verbindingen met een hoge activiteit tegen seksuele stadia.
  2. Voer voor de geïdentificeerde verbindingen een IC50-bepaling uit zoals hieronder beschreven.

6. Omzettingstest - bepaling van IC 50

  1. Infecteer muizen met Ookluc en verzamel geparasiteerd bloed, zoals beschreven in rubriek 2.
  2. Bereid de monsters voor met behulp van ookinete medium als verdunningsmiddel. Gebruik een beginconcentratie waarbij 100% remming van de omzetting door de verbinding wordt waargenomen.
    OPMERKING: Aangezien de actieve verbindingen werden geïdentificeerd in een screening met een concentratie van 10 μM, gebruiken we 20 μM als beginconcentratie voor de eerste dosis-responscurve. Voor een nauwkeurige dosis-responscurve is het belangrijk dat uw test beginconcentraties bevat die resulteren in 100% remming van de conversie en eindconcentraties die leiden tot 0% remming. Deze aanpak zorgt voor een nauwkeurige IC50-berekening . De eerste dosis-responscurve informeert de laagste concentraties van de verbinding met ~100% remming. In dit protocol gebruiken we PyAz90, onlangs geïdentificeerd aan de hand van Ookluc13, als voorbeeld.
  3. Voeg in een plaat met 96 putjes in drievoud toe (zie figuur 4): Positieve controle (C+): 80 μL ookinete medium; Negatieve controle (C-): 80 μL ookinete medium; Monster eerste verdunning (Cpd D1): 160 μL verbinding bij een initiële concentratie in ookinete medium die resulteert in 100% remming van de omzetting; D2 tot D12 putjes: 80 μL ookinete medium.
  4. Maak tweevoudige seriële verdunningen door 80 μl putje D1 in D2 te pipetteren, te homogeniseren en 80 μl putje D2 in D3 te pipetteren, enzovoort. Zorg ervoor dat alle putjes een totaal volume van 80 μL hebben, dus gooi de laatste 80 μL weg die uit putje D12 is verwijderd.
    OPMERKING: Voer het experiment uit met ten minste drie replicaten voor alle monsters, zoals aangegeven in afbeelding 4. Om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van uw resultaten te garanderen, moet het hele experiment op drie afzonderlijke dagen worden herhaald met telkens nieuw geïnfecteerde dieren.
    OPMERKING: Als in de eerste zeef de resultaten geen invloed van het oplosmiddel op de conversie laten zien, is het niet nodig om deze controles in seriële verdunningen op te nemen. Anders moeten ook seriële verdunningen van het oplosmiddel worden opgenomen.

figure-protocol-4
Figuur 4: Plaatlay-out met 96 putjes ontworpen voor bepaling van de verbinding IC50 . De lay-out van de platen omvat positieve controle (C+), negatieve controle (C-) en samengestelde (Cpd) verdunningen (D1 tot D12). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voeg geparasiteerd muizenbloed toe aan de plaat met 96 putjes met een v:v van 1:20. Homogeniseer voorzichtig door te pipetteren.
    OPMERKING: In totaal wordt 4 μL geparasiteerd bloed aan elk putje toegevoegd, behalve aan de negatieve controle (C-). Rekening houdend met verliezen, berekenen we de behoefte van ~200 μL geparasiteerd bloed voor elke te testen verbinding.
  2. Voeg in negatieve controleputjes niet-geïnfecteerd muizenbloed toe in een verhouding van 1:20 (v:v, bloed:monster). Voorzichtig homogeniseren.
  3. Incubeer bij 21 °C gedurende 6 uur of 24 uur.
  4. Voer de luminescentietest uit, zoals beschreven in rubriek 4.

7. Gegevensanalyse - bepaling van IC 50

OPMERKING: IC50 wordt gedefinieerd als de concentratie van een verbinding die nodig is om 50% van de biologische activiteit/remming te remmen. In deze test verwijst remming naar de vermindering van de omzetting van ookinet. Gegevens worden weergegeven als een sigmoïdale dosis-responscurve, waarbij de X-as de concentratie van de verbinding weergeeft (log-getransformeerd) en de Y-as % remming.

  1. Bereken het percentage remming zoals beschreven in rubriek 5, stap 5.3.
  2. Open de software en maak een XY-tabel.
  3. Stel de opties voor de Y-as in op Voer 3 repliceerwaarden in subkolommen naast elkaar in.
  4. Plakgegevens, waarbij X staat voor de concentratie van de verbinding en Y voor % remming (Figuur 5A).
  5. Klik in de menubalk op Analyseren en selecteer Niet-lineaire regressie (curve-fit) en vervolgens Dosis-responscurves - Remming en [remmer] vs. genormaliseerde respons - variabele helling; klik op OK.
  6. Bekijk in het linkerdeelvenster de dosis-responscurve van de gegevens. Pas de gewenste personalisatie toe, zoals kleurveranderingen en puntopmaak.
  7. Zoek de Nonlin-fittabel om het berekende IC50 en 95% betrouwbaarheidsinterval (95% BI) te vinden (Figuur 5B).

figure-protocol-5
Figuur 5: Dosis-responscurve van PyAz90. De %-remming werd gemeten als functie van de PyAz90-concentratie (μM) op een logaritmische schaal. De sigmoïdale curve vertegenwoordigt de aangepaste gegevens die zijn gebruikt om het IC50 te bepalen, dat 0,013 μM was (95% betrouwbaarheidsinterval: 0,012-0,014 μM). Gegevenspunten vertegenwoordigen het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van experimentele replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De generatie van Ookluc-parasieten maakt de evaluatie van nieuwe tbc-kandidaat-geneesmiddelen mogelijk vanuit een perspectief dat niet wordt geboden door bestaande tests, met name bij het beoordelen van de effecten van verbindingen op gametenactivering, bevruchting en zygotevorming8. Figuur 2 en Figuur 3 illustreren het vermogen van de methode om een panel van ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De meeste HTS-methoden die worden gebruikt om nieuwe tbc-verbindingen te ontwikkelen, zijn gericht op gametocytogenese-remming of gametocytocide activiteit. Tot op heden zijn er slechts twee P. berghei-modellen ontwikkeld die de beoordeling van de gametocytfunctie, gametogenese, zygotevorming en ookinete morfogenese5 mogelijk maken.

Een van deze modellen is vergelijkbaar met Ookluc, omdat het gebruik maakt van een fluo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit project werd ondersteund door subsidies van de Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2021/06769-0) en het Instituto Serrapilheira (subsidie G-1709-16618).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418
GraphPad Prism version 10.0.0 for WindowsGraphPad Software, Boston, Massachusetts, USA
Heparine natriumzout uit varkens darmmucosaSigma-AldrichH3393
HEPES (1 M)Thermo Scientific15630106
HypoxanthineSigma-AldrichH9636
Muizen------Vrouwelijke BALB/c muizen, 3 tot 5 weken oud
Nano-Glo Luciferase Assay SystemPromegaN1110
Penicilline − Streptomycine − Neomycine oplossing gestabiliseerdSigma-AldrichP4083
POLARStar Omega Microplate Reader BMG Labtech----
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX SupplementThermo Scientific61870036
XanthurenezuurSigma-AldrichD120804

Referenties

  1. World malaria report 2024: addressing inequity in the global malaria response. , World Health Organization. https://www.who.int/teams/global-malaria-programme/reports/world-malaria-report-2024 (2025).
  2. Miller, L. H., Ackerman, H. C., Su, X., Wellems, T. E. Malaria biology and disease pathogenesis: insights for new treatments. Nature Med. 19 (2), 156-167 (2013).
  3. Tsoumani, M. E., Voyiatzaki, C., Efstathiou, A. Malaria Vaccines: From the Past towards the mRNA Vaccine Era. Vaccines. 11 (9), 1452(2023).
  4. Ménard, R., et al. Looking under the skin: the first steps in malarial infection and immunity. Nature Rev. Microbiol. 11 (10), 701-712 (2013).
  5. Appetecchia, F., et al. Transmission-blocking strategies for malaria eradication: Recent advances in small-molecule drug development. Pharmaceuticals. 17 (7), 962(2024).
  6. Baniecki, M. L., Wirth, D. F., Clardy, J. High-throughput Plasmodium falciparum growth assay for malaria drug discovery. Antimicrob Agents Chemother. 51 (2), 716-723 (2007).
  7. Delves, M., et al. The activities of current antimalarial drugs on the life cycle stages of Plasmodium: A comparative study with human and rodent parasites. PLoS Med. 9 (2), e1001169(2012).
  8. Calit, J., et al. Screening the pathogen box for molecules active against Plasmodium sexual stages using a new nanoluciferase-based transgenic line of P. berghei identifies transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 62 (11), e01053-e01118 (2018).
  9. Calit, J., et al. Novel transmission-blocking antimalarials identified by high-throughput screening of Plasmodium berghei Ookluc. Antimicrob Agents Chemother. 67 (4), e0146522(2023).
  10. Lima, M. N. N., et al. Integrative multi-kinase approach for the identification of potent antiplasmodial hits. Front Chem. 7, 773(2019).
  11. Ferreira, L. T., et al. Computational chemogenomics drug repositioning strategy enables the discovery of epirubicin as a new repurposed hit for Plasmodium falciparum and P. vivax. Antimicrob Agents Chemother. 64 (9), aac.02041-aac.02119 (2020).
  12. Krishnan, K., et al. Torin 2 derivative, NCATS-SM3710, has potent multistage antimalarial activity through inhibition of P. falciparum phosphatidylinositol 4-kinase (Pf ACS Pharmacol). Transl Sci. 3 (5), 948-964 (2020).
  13. Calit, J., et al. Pyrimidine azepine targets the Plasmodium bc1 complex and displays multistage antimalarial activity. JACS Au. 4 (10), 3942-3952 (2024).
  14. Lima, M. N., et al. Chalcones as a basis for computer-aided drug design: Innovative approaches to tackle malaria. Future Med Chem. 11 (20), 2635-2646 (2019).
  15. Ferreira, L. T., et al. A novel 4-aminoquinoline chemotype with multistage antimalarial activity and lack of cross-resistance with PfCRT and PfMDR1 mutants. PLoS Pathog. 20 (10), e1012627(2024).
  16. Blagborough, A. M., et al. Assessing transmission blockade in Plasmodium spp. Methods Mol Biol. 923, 577-600 (2013).
  17. Azevedo, R., et al. Bioluminescence method for in vitro screening of Plasmodium transmission-blocking compounds. Antimicrob Agents Chemother. 61 (6), aac.02699-aac.02616 (2017).
  18. Gaitán, X. A., et al. Characterisation of the merozoite thrombospondin related anonymous protein (MTRAP) of Plasmodium berghei as a transmission-blocking antigen. Mem Inst Oswaldo Cruz. , 119(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High throughput screeningseksuele stadiaactivatie van gametocytenluminescentie assayontwikkeling van ookinetenIC50 bepalingdosis responscurveplatenlezer

Gerelateerde artikelen