Methodenartikel

Snelle dissectie en dissociatie van het reukepitheel van de muis voor suspensies met één kern

DOI:

10.3791/68472

⸱

1 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Genetics and Genomics Graduate Program, Baylor College of Medicine, 2Department of Molecular and Human Genetics, Baylor College of Medicine, 3Jan and Dan Duncan Neurological Research Institute, Texas Children's Hospital, 4Medical Scientist Training Program, Baylor College of Medicine, 5Cytometry and Cell Sorting Core, Baylor College of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel biedt een gestroomlijnd protocol voor de dissectie en dissociatie van muizen olfactorisch epitheel met het oog op single-nucleus RNA-sequencing.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het reukepitheel van muizen is het eerste toegangspunt van het reuksysteem en herbergt verschillende celtypen, waaronder olfactorische sensorische neuronen, hun regenererende voorlopers en ondersteunende cellen. Olfactorische sensorische neuronen zetten chemische geurstoffen om in neurale signalen, maar de mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling en omzetting van deze cellen, creëren synapsen met de bulbus olfactorius en reguleren hun geurreceptoren blijven gebieden van intensieve studie. Het olfactorische epitheel bevindt zich aan het dorsale aspect van de neusholte en hecht zich aan ingewikkelde benige structuren die bekend staan als neusschelpen. Deze anatomie brengt unieke uitdagingen met zich mee voor de extractie en dissociatie ervan, vooral in de context van het bereiden van levensvatbare eencellige suspensies. Omdat protocollen voor eencellige suspensie vaak voorbereidende stappen omvatten (bijv. papaïnedissociatie, FACS) die de levensvatbaarheid van de cel kunnen benadrukken en/of de voorbereiding van de bibliotheek kunnen vertragen, is het minimaliseren van de weefselextractietijd cruciaal. Dit artikel presenteert een gestroomlijnde methode voor de snelle dissectie van het olfactorische epitheel en een protocol voor het genereren van hoogwaardige single-nucleus suspensies.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het reukepitheel (OE) van muizen is een essentieel onderdeel van het reuksysteem en is verantwoordelijk voor het detecteren en transduceren van geursignalen naar het centrale zenuwstelsel. De meest oppervlakkige laag bevat de geurstoffendetecterende trilharen van de olfactorische sensorische neuronen, die bedekt zijn met een laag slijm en omgeven door de ondersteunende sustentaculaire en microvillarische cellen 1,2. OSN's zijn bipolair en strekken hun trilharen apicaal uit om een rooster te vormen in de slijmlaag en hun axonen basaal door de benige cribriforme plaat om samen t....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven in deze studie zijn goedgekeurd door en uitgevoerd in overeenstemming met het Baylor College of Medicine IACUC. Vrouwelijke C57BL/6J (JAX:000664) muizen werden gebruikt. Details van de reagentia en apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Dissectie van het olfactorisch epitheel

  1. Begin met het diep verdoven van de muis met behulp van een voorkeursmethode (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen). Bevestig het chirurgische anesthesievlak door stevig in de teen te knijpen en ga verder met transcardiale perfusie van ten minste 10 ml ....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om een anatomische context te bieden voor dissectie en analyse, werden de hechtingen en botten van de C57BL/6-muizenschedel, evenals het centrale deel van het reukepitheel (OE), gevisualiseerd en voorzien van een kleurcode (Figuur 1). De ene kant van elke afbeelding werd geannoteerd om relevante hechtingen, botten en neusschelpen te markeren, terwijl de andere kant ongemarkeerd bleef voor referentie. De OE-doorsnede werd opgesteld volgens vastgestelde protoc.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven procedure maakt de consistente verwijdering van een intacte OE mogelijk na intracardiale 1x PBS-perfusie. Dit betekent een opmerkelijke verbetering in snelheid in vergelijking met eerdere methoden16 en is van bijzonder belang gezien het feit dat OSN's beginnen te degenereren na axotomie2, wat gebeurt tijdens het verwijderen van de hersenen.

Zorgvuldige verwijdering van de frontale, premaxillair.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat dit onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag de Single Cell Genomics Core van het Baylor College of Medicine erkennen. Dit project werd ondersteund door de Cytometry and Cell Sorting Core van het Baylor College of Medicine met financiering van de NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 en SS10 RR024574) en de deskundige hulp van Joel M. Sederstrom. Dit project werd gedeeltelijk gefinancierd door de NIH/NICHD [P50HD103555], de NIH/NINDS [5R01NS078294] en de NIH/NIA [5F30AG076265]. Figuur 3 is gemaakt in BioRender. https://BioRender.com/5418352.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL Centrifuge TubeCelltreat229411
Bone Nipper Fine Science Tools16102-11
Bonn Miniature Iris Scissors Miltex 18-1392
Bovine Serum Albumin SolutionSigma-AldrichA1595
Dumont #3 Forceps Fine Science Tools11231-30
Female C57BL/6J miceThe Jackson LaboratoryJAX:000664
gentleMACS C tubes Miltenyi Biotec130-093-237
gentleMACS Octo Dissociator Miltenyi Biotec130-096-427
MACS SmartStrainers 30 um Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers 70 um Miltenyi Biotec130-098-462
Micro Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16220-14
Nuclei Extraction Buffer Miltenyi Biotec130-128-024
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x zonder calcium en magnesium, PH 7,4 ± 0,1Corning21-040-CV
Protector RNAse Inhibitor Millipore Sigma3335402001
Sorvall Legend XTR Gekoelde CentrifugeThermo Scientific50119927-5

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graziadei, P. P. C., Graziadei, G. A. M. Neurogenesis and neuron regeneration in the olfactory system of mammals. I. Morphological aspects of differentiation and structural organization of the olfactory sensory neurons. J Neurocytol. 8 (1), 1-18 (1979).
  2. Monti Graziadei, G. A., Graziadei, P. P. C.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Muisdissectieenkelkernsuspensiesingle cell sequencingolfactorische sensorische neuronenweefseldissociatieflowcytometriemarkergenenneusholteprogenitorcellen

Gerelateerde artikelen