Methodenartikel

Beeldgeleide in vivo tracking van getransplanteerde distale longepitheliale voorlopercellen voor longfibrose met behulp van magnetische beeldvorming

766 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68477

⸱

27 juni 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Precision Health Program, Michigan State University, 2Department of Radiology, College of Human Medicine, Michigan State University, 3Department of Pediatrics and Human Development, Michigan State University, 4Lyman Briggs College, Michigan State University, 5College of Social Science, Michigan State University, 6Department of Chemistry, Hunter College, 7Corewell Health Medical Group, 8Institute for Quantitative Health Science and Engineering (IQ), Michigan State University, 9Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Michigan State University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Celtherapie biedt een veelbelovende interventie voor longfibrose door voorlopercellen te gebruiken om beschadigd weefsel te herstellen en de longfunctie te verbeteren. Aangezien beeldvorming een cruciale rol speelt bij het volgen van celintegratie, beschrijven we hierin magnetische beeldvorming-geleide in vivo tracking van celtherapie voor longfibrose in een muismodel.

Samenvatting

Longfibrose (PF) is een progressieve en chronische longziekte die wordt gekenmerkt door herhaald alveolair epitheelletsel dat leidt tot overmatige afzetting van de extracellulaire matrix, resulterend in weefselverdikking, littekenvorming en verminderde gasuitwisseling, wat leidt tot respiratoire disfunctie. In de Verenigde Staten worden jaarlijks ongeveer 50.000 nieuwe gevallen gemeld, waarbij patiënten te maken krijgen met ernstige complicaties zoals pneumothorax, pulmonale hypertensie, ademhalingsfalen en een verhoogd risico op longkanker. De huidige therapeutische opties zijn beperkt in werkzaamheid en zijn voornamelijk gericht op het vertragen van de ziekteprogressie. Celtherapie is naar voren gekomen als een veelbelovende interventie, die het potentieel biedt om beschadigd longweefsel te regenereren, ontstekingen te moduleren en de longfunctie te verbeteren. De effectiviteit van deze therapieën hangt echter sterk af van het vermogen om de distributie, overleving en integratie van getransplanteerde cellen in de gastheerlongen te volgen.

Magnetic Particle Imaging (MPI) is een nieuwe, niet-invasieve, preklinische beeldvormingsmodaliteit die gebruik maakt van superparamagnetische ijzeroxide-nanodeeltjes (SPION's) als tracers. MPI biedt een hoge gevoeligheid, specificiteit en geen achtergrondsignaal, waardoor real-time en kwantitatief volgen van gelabelde cellen in vivo mogelijk is. In deze studie onderzochten we het gebruik van MPI voor het monitoren van menselijke distale longepitheliale voorlopercellen die in de longen van immuungecompromitteerde muizen zijn getransplanteerd. Cellen werden gelabeld met variërende SPION-concentraties om het signaal te optimaliseren, bevestigd door immunokleuring en ijzerkwantificering. Na intratracheale instillatie werden 2D MPI-scans verkregen om de ruimtelijke verdeling van getransplanteerde cellen te volgen. Longitudinale beeldvorming gedurende 2 weken maakte visualisatie van celintegratie en -retentie in longweefsel mogelijk. Succesvolle instillatie vertoonde MPI-signalen in zowel de linker- als de rechterlong, die in de loop van de tijd afnamen (~65%). Muizen werden vervolgens geofferd voor histologische validatie. Deze studie toont het nut van MPI aan voor niet-invasieve, longitudinale tracking van celtherapie bij longfibrose, en draait om de ingewikkelde technieken die tijdens de procedures worden gebruikt.

Inleiding

Celtherapie 1,2 biedt regeneratief potentieel, bevordert weefselherstel, vermindert ontstekingen en verbetert de resultaten bij chronische ziekten zoals leukemie en lymfoom 3,4 (hematopoëtische stamcellen), artrose 5,6 (mesenchymale stamcellen), diabetes type 17 (eilandceltransplantatie), ruggenmergletsels 8,9, neurodegeneratieve ziekten10,11,12 (neurale stamcellen) en longfibrose 13,14,15,16 (pulmonale voorlopercellen). Deze therapieën bieden een aanzienlijk potentieel, hoewel uitdagingen zoals immuunafstoting en werkzaamheid op de lange termijn nog steeds bestaan17,18. Longfibrose (PF) is een chronische en progressieve longziekte die wordt gekenmerkt door overmatige littekenvorming van longweefsel, wat leidt tot een verminderde longfunctie19. Celtherapie voor PF heeft tot doel beschadigd longweefsel te regenereren en fibrose te verminderen door regeneratieve cellen, zoals mesenchymale stamcellen of distale longvoorlopercellen, in de aangetaste longente introduceren 20. Distale longvoorlopercellen, waaronder populaties zoals basale cellen, alveolaire type II-cellen, bronchioalveolaire stamcellen en andere multipotente voorlopercellen, hebben het vermogen om weefselherstel te bevorderen, ontstekingen te verminderen, mogelijk beschadigd longweefsel te regenereren en een deel van de longschade om te keren terwijl de normale longfunctie wordt hersteld21. Verschillende preklinische en klinische onderzoeken in een vroeg stadium hebben aangetoond dat het transplanteren van longvoorlopercellen in fibrotische longen kan helpen bij het regenereren van alveolaire structuren, het bevorderen van weefselremodellering en het verminderen van ontstekingen 13,22,23. Bovendien kunnen deze cellen verschillende groeifactoren en cytokinen afscheiden die de fibrotische omgeving moduleren, waardoor herstel verder wordt bevorderd. Ondanks de bemoedigende resultaten bij het verbeteren van de longfunctie, blijven er uitdagingen bij het optimaliseren van de celafgifte, waaronder efficiënte isolatie, expansie en integratie van deze cellen in het beschadigde longweefsel, waardoor de veiligheid op lange termijn wordt gegarandeerd en ongewenste bijwerkingen worden voorkomen. Voortgezet onderzoek is nodig om protocollen te verfijnen en de veiligheid en werkzaamheid op lange termijn van voorloperceltherapieën voor longfibrose te beoordelen.

Het transplanteren van cellen in de longen voor longfibrose omvat verschillende technieken, elk ontworpen om de celafgifte, overleving en integratie in het beschadigde longweefsel te verbeteren. Veelgebruikte methoden zijn onder meer intraveneuze injectie24,25, endobronchiale toediening26,27 en intratracheale instillatie 28,29,30,31, elk met specifieke voordelen en uitdagingen. Intraveneuze toediening van stamcellen wordt belemmerd door suboptimale pulmonale homing, sekwestratie in organen buiten het doelwit, beperkte levensvatbaarheid na infusie en het risico op immunogene responsen. Endobronchiale toediening, hoewel meer gelokaliseerd, wordt beperkt door heterogene celdistributie, mogelijke occlusie van de luchtwegen, ontstekingsreacties en procedurele uitdagingen binnen de fibrotische longarchitectuur. Evenzo kan intratracheale instillatie, ondanks het feit dat directe longafzetting mogelijk is, leiden tot inconsistente celdispersie, onvoldoende distale longpenetratie, plaatselijke irritatie en variabiliteit in dosisuniformiteit tussen longcompartimenten. Hoewel al deze technieken gericht zijn op het verbeteren van de overleving, integratie en werkzaamheid van cellen bij het regenereren van longweefsel, hangt de keuze van de optimale techniek af van factoren zoals het type cellen dat wordt getransplanteerd, het stadium van fibrose en de algehele gezondheid van de patiënt.

Ondanks de uitdagingen blijft intratracheale instillatie een van de meest gebruikte methoden om cellen rechtstreeks in de longen af te leveren, vooral in de context van longfibrose. Bij deze techniek worden cellen in de long ingebracht via een katheter die in de luchtpijp32 wordt ingebracht. De cellen worden vervolgens afgezet in de alveolaire ruimte, waar ze mogelijk het beschadigde longweefsel kunnen herstellen. Deze methode is minimaal invasief en relatief eenvoudig uit te voeren in vergelijking met andere toedieningsbenaderingen zoals ex vivo longperfusie. Omdat de cellen rechtstreeks in de longen worden afgezet, kan dit de kans op effectieve integratie en herstel vergroten. In tegenstelling tot intraveneuze injectie, vermijdt intratracheale instillatie systemische circulatie, waardoor het risico wordt verminderd dat cellen vast komen te zitten in andere organen zoals de lever of milt, wat leidt tot een meer gericht therapeutisch effect in de longen. Ondanks deze voordelen wordt de methode nog steeds geconfronteerd met uitdagingen op het gebied van suboptimale celdistributie en -retentie en overleving in de longen, wat de therapeutische effectiviteit kan beperken. Lopend onderzoek werkt aan het verfijnen van deze aanpak voor effectievere klinische resultaten. Onderzoekers kunnen bepalen of intratracheale instillatie geschikt is voor hun toepassingen door verschillende factoren te evalueren. Deze omvatten het type cellen dat wordt afgeleverd, hun vermogen om te overleven en te integreren in longweefsel, en de ernst van het ziektemodel (d.w.z. longfibrose).

Beeldvorming is een onmisbaar hulpmiddel voor het volgen van cellen, het beoordelen van hun levensvatbaarheid, distributie en effecten, het verbeteren van de monitoring van celtherapie en het optimaliseren van behandelingsstrategieën33. Onderzoekers hebben de efficiëntie van de toediening beoordeeld door middel van beeldvorming en analyse na de bevalling om de distributie en retentie van cellen te volgen. Verschillende technieken zoals fluorescentie, magnetische resonantiebeeldvorming (MRI), computertomografie (CT), positronemissietomografie (PET), computertomografie met enkelvoudige fotonemissie (SPECT) en echografie zijn gebruikt om gelabelde stamcellen op longfibrose te volgen. Ze hebben echter te maken met beperkingen zoals lage dieptepenetratie (fluorescentie), slechte gevoeligheid (MRI), blootstelling aan straling (CT, PET, SPECT) en lage resolutie (echografie)34. Hoewel het optimaliseren van beeldvormingscontrast, resolutie en biocompatibiliteit tot op zekere hoogte kan helpen deze uitdagingen te overwinnen, kan het verkennen van nieuwere beeldvormingstechnieken ook essentieel zijn voor het nauwkeurig volgen van stamcellen in de longen. In de afgelopen jaren is Magnetic Particle Imaging (MPI) naar voren gekomen als een veelbelovende, stralingsvrije beeldvormingsmodaliteit, die een hoge gevoeligheid, realtime, kwantitatieve beeldvorming biedt met een hoog contrast zonder achtergrondinterferentie.

MPI gebruikt superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes (SPION's) voor directe visualisatie, en het werkingsprincipe is gebaseerd op de niet-lineaire magnetisatierespons van deze SPION's wanneer ze worden blootgesteld aan een in de tijd variërend magnetisch veld35,36. Elektromagneten worden gebruikt om een veldvrij gebied (FFR) te creëren, waar alleen deeltjes in dit gebied niet-lineaire magnetisatie vertonen en een signaal genereren wanneer ze worden opgewonden door een oscillerend magnetisch veld. Aan de andere kant is de magnetisatie van deeltjes buiten deze FFR verzadigd en nemen ze niet deel aan de signaalproductie. Door de FFR systematisch door het beeldvormingsvolume te verplaatsen, construeert MPI ruimtelijke kaarten van de verdeling van nanodeeltjes en de daaropvolgende beelden. MPI biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele beeldvormingsmodaliteiten37,38. In tegenstelling tot MRI of CT levert MPI alleen een signaal van de tracer, wat resulteert in nul achtergrondruis en een uitzonderlijk contrast. Het biedt real-time beeldvorming met een hoge temporele resolutie, waardoor het ideaal is voor het volgen van dynamische processen zoals celmigratie of perfusie. Bovendien is MPI zeer gevoelig, waardoor kleine hoeveelheden SPION's zonder ioniserende straling kunnen worden gedetecteerd, in tegenstelling tot PET of CT. Bovendien vertoont het ook een uitstekende lineaire kwantificering, waardoor een nauwkeurige beoordeling van de tracerconcentratie mogelijk is. Over het algemeen combineert MPI de sterke punten van gevoeligheid, veiligheid en kwantificering, waardoor het een krachtig hulpmiddel is voor biomedische beeldvorming. MPI is veelbelovend voor het volgen van stamcellen in de longen, waardoor nauwkeurige monitoring van celmigratie, retentie en therapeutische effecten mogelijk is. Het biedt een uitstekend contrast zonder interferentie van weefselsignalen, waardoor nauwkeurige lokalisatie van gelabelde stamcellen mogelijk is 39,40,41,42. In de volgende paragrafen worden de protocollen beschreven die voor deze onderzoeken zijn uitgevoerd, waarbij het gebruik van intratracheale instillatie wordt aangetoond om de gelabelde cellen aan de longen van muizen af te leveren en bevestiging via MPI.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij proefpersonen betrokken zijn, zijn goedgekeurd door de Michigan State University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en waarbij menselijke proefpersonen betrokken zijn, zijn goedgekeurd door Corewell Health IRB nr. 2017-198. Alle patiënten gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan deelname aan het onderzoek.

Monsters van menselijke longexplantaten van patiënten met idiopathische longfibrose (IPF) die een longtransplantatie ondergaan, werden verzameld bij Corewell Health. Voorafgaand aan de transplantatieprocedure voldeden alle patiënten aan de diagnostische criteria voor idiopathische longfibrose (IPF), gekenmerkt door hypoxemie, kortademigheid en verminderd longvolume43. Pathologische analyse van weefsel uit het distale uiteinde van de longkwab bevestigde de aanwezigheid van fibrose.

Mannelijke NOD/SCID-muizen werden gekocht op de leeftijd van 8 weken en mochten 1 week acclimatiseren en vervolgens tot 12 weken voorafgaand aan de procedure oud worden.

1. Isolatie en uitzetting van menselijke luchtwegepitheelcellen

  1. Plaats het geëxplanteerde longmonster op ijs om de celintegriteit tijdens dissectie te behouden. Identificeer de bronchiën/grote luchtwegen die in het monster aanwezig zijn; De kleine luchtwegen bevinden zich in de distale delen van het longmonster, het verst verwijderd van de grote luchtwegen. Gebruik gesteriliseerde instrumenten om het distale deel van het longmonster weg te snijden en in kleinere porties te verwerken om te helpen bij de vertering van het weefsel. Spoel het monster in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) om overtollig bloed en vocht te verwijderen en verteer vervolgens het geëxplanteerde longweefsel met de kleine luchtwegen in een buffer bestaande uit protease van Streptomyces griseus, 1x penicilline/streptomycine, DNase I en 1x Gentamicine in een tube van 50 ml. Plaats het weefsel ongeveer 4 uur in een waterbad van 37 °C op rotsen, of totdat het weefsel voldoende is verteerd.
  2. Haal de inhoud van de buis van 50 ml door een steriele celzeef van 100 μm. Spoel de tissue 3x af met DPBS en haal de wasbeurten door de zeef. Pellet de cellen door centrifugeren bij 400 × g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml kweekmedium door de celsuspensie 50x te pipetteren met een pipet ingesteld op 500 μl.
  3. Voeg de celsuspensie toe aan een kweekkolf van 75cm2 die het groeimedium van het luchtwegepitheel bevat. Kweek de cellen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende ongeveer 2 weken.

2. Labelen van luchtwegepitheelcellen met nanodeeltjes (ijzeroxidetracer)

  1. Wanneer epitheelculturen voor 80% samenvloeien, labelt u de cellen met ijzeroxidetracer in een eindconcentratie van 250 μg/ml. Voeg het juiste volume ijzeroxidetracer toe aan 10 ml kweekmedium per kolf epitheelcellen en incubeer gedurende 48 uur.
    OPMERKING: Verschillende concentraties ijzeroxidetracer (50, 100, 200 en 250 μg/ml) werden geëvalueerd voor cellabeling, gevolgd door hun 2D MPI-scans (Figuur 1A). De concentratie van 250 μg/ml, samen met 50.000 cellen voor transplantatie, werd voor deze studie afgerond.
  2. Was de cellen na 48 uur 3x met DPBS om overtollige nanodeeltjes te verwijderen.
  3. Maak de cellen los met behulp van een cellosmakend reagens en incubeer de cellen gedurende 15 minuten bij 37 °C, of totdat de cellen van het oppervlak van de kolf beginnen op te stijgen.
  4. Verzamel de cellen in een buisje van 50 ml met 1 ml foetaal runderserum. Spoel de kolf 3x met 5 ml DPBS en voeg de wasbeurten toe aan de tube van 50 ml met de cellen.
  5. Pellet de cellen door centrifugeren bij 400 × g gedurende 5 minuten. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de cellen opnieuw in 1 ml kweekmedium door de celsuspensie 50x te pipetteren met een pipet ingesteld op 500 μl.
  6. Gebruik een hemocytometer om de celconcentratie te bepalen en het volume celsuspensie te bepalen dat nodig is voor de in vivo transplantatie.
  7. Aliquot 100 μL van de cel suspensie en fixatie in 4% paraformaldehyde.

3. In vitro immunokleuring en microscopie

  1. Laad het aliquot van 100 μl celsuspensie in een cytospinpatroon met een schuifje en filter en draai gedurende 5 minuten met 1.000 tpm.
  2. Omlijn de cellen op het glaasje met een hydrofobe pen.
  3. Was de dia's 2 x 15 minuten met DPBS.
  4. Permeabiliseer de cellen op het objectglaasje door 5 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 0,1% Triton X-100 in DPBS.
  5. Was de cellen 2 x 2 minuten met DPBS.
  6. Blokkeer de objectglaasjes met 5% runderserumalbumine (BSA)/1% geitenserum in DPBS gedurende 2 uur.
  7. Incubeer de objectglaasjes in primair antilichaam (anti-dextran) in 2,5% BSA/0,5% geitenserum in DPBS 's nachts bij 4 °C.
  8. Verwijder het primaire antilichaam en was de dia's 3 x 5 minuten in 1x Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (TBST).
  9. Incubeer de objectglaasjes met 1:1.000 secundair antilichaam in 2,5% BSA/0,5% geitenserum in DPBS gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.
  10. Was de dia's 3 x 5 minuten met 1x TBST.
  11. Voeg een nucleair kleuringsmiddel, 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), toe aan het objectglaasje met een concentratie van 1:1,000 in DPBS en laat 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  12. Was de dia's 2 x 5 min met 1x TBST. Verwijder overtollig 1x TBST van de dia.
  13. Voeg montagemedium toe met DAPI en plaats een glazen dekglaasje over de dia, zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan.
  14. Nadat het glaasje is uitgehard, sluit u de randen van het dekglaasje af met een doorzichtige nagellak.
  15. Beeld de dia's af op een confocale microscoop.

4. Celtransplantatie met behulp van intratracheale instillatie

  1. Voorbereiding
    1. Weeg de muis om de dosis bleomycine (BLM) te berekenen die voor elke muis nodig is.
    2. Bereid in een microcentrifugebuis van 1,7 ml de gewenste BLM-oplossing (verdund in gesteriliseerde zoutoplossing) in een volume van niet meer dan 50 μl.
      OPMERKING: De geneesmiddelconcentratie is afhankelijk van de experimentele doelen. Voor deze procedure werd BLM van 0,6 E/kg gebruikt.
    3. Doe de BLM-oplossing in een pipet. Vul bovendien een spuit voor met 200 μL lucht om ervoor te zorgen dat al het vloeistofvolume in de luchtpijp wordt uitgestoten.
      OPMERKING: Na 72 uur BLM-behandeling wordt de gelabelde celsuspensie op een vergelijkbare manier toegediend.
    4. Gebruik het celgetal verkregen uit stap 2.6 om het volume van de toe te dienen celsuspensie, die 50.000 cellen bevat, te berekenen.
    5. Verdoof de muis door hem in een inductiebox te plaatsen die is aangesloten op de anesthesie-eenheid die isofluraan (2,5-3%) levert totdat hij verdoofd is.
      OPMERKING: De muizen worden tijdens de hele procedure twee keer verdoofd: (1) op de dag van BLM-toediening en (2) op de dag van intratracheale instillatie van cellen, dat is 72 uur na de BLM-dosis.
    6. Stel de intubatiekit voor vezellicht in zoals weergegeven in afbeelding 2A met de optische vezelsonde die door de laryngoscoop en de katheter gaat.
      OPMERKING: Het verlichte uiteinde van de vezel moet net buiten (1-2 mm) van de katheterslang worden geplaatst.
  2. Intratracheale instillatie
    1. Bevestig de verdoving door de pedaalreflex te controleren door de teen in een van de achterpoten samen te knijpen. Zodra voldoende anesthesie is bevestigd, hangt u de muis aan de snijtanden in rugligging op een schuine intubatiestandaard voor knaagdieren (Figuur 2B-D).
    2. Pak met een stompe tang de tong voorzichtig vast en positioneer de tong in een opwaartse en linkse beweging om een adequate visualisatie van het strottenhoofd te krijgen.
    3. Zet de glasvezelsonde aan en ga de mond binnen om de luchtpijp te naderen. Gebruik het vergrootglas van de laryngoscoop voor een betere visualisatie van het strottenhoofd en lokaliseer de stembanden bij de tracheale opening.
    4. Steek de katheter in de tracheale opening en maak de laryngoscoop heel voorzichtig los en trek hem eruit. Plaats een klein druppeltje zoutoplossing (20 μl) aan het bovenste uiteinde van de katheter.
      OPMERKING: Het vloeistofniveau beweegt op en neer, uitgelijnd met de ademhalingsfrequentie van de muis. Dit bevestigt de plaatsing van de katheter in de luchtpijp en niet ten onrechte in de slokdarm.
    5. Bevestig een spuit met voorgeladen 200 μL lucht en duw de druppel naar binnen. Plaats de celsuspensie (≤50 μl) in de katheter en druppel deze in met behulp van de luchtspuit zoals eerder.
    6. Om te voorkomen dat de ingedruppelde vloeistof uit de luchtpijp ontsnapt, laat u de katheter 5-7 seconden op zijn plaats. Trek vervolgens de katheter voorzichtig naar buiten.
    7. Houd de muis minimaal 30 seconden in dezelfde positie op de intubatiestandaard.
    8. Verwijder de muis en plaats deze in een herstelkooi die op een verwarmingskussen is geplaatst. Monitor totdat hij volledig hersteld is van de anesthesie.

5. Magnetische beeldvorming van deeltjes

  1. Verdoof de muis door hem in een inductiebox te plaatsen die is aangesloten op de anesthesie-eenheid die isofluraan (2-2,5%) toedient totdat hij verdoofd is.
  2. Stel het muisbed in een MPI-scanner in met de anesthesielijn die via de juiste aansluitingen onder het bed loopt.
  3. Terwijl de muis wordt verdoofd, bereidt u de MPI-scanner voor op beeldvorming. Start de gekoppelde software en definieer een mapnaam in Project en de scan in Examennaamdomein voor identificatie, en stel de scanparameters in op basis van de vereisten. Gebruik deze scanparameters om deze procedure te volgen: Scantype: 2D-scan; Scanmodus: Standaard; zendkanalen: Meerkanaals (isotroop); Gemiddelden per projectie: 2.
  4. Controleer de verdoving zoals beschreven in stap 4.2.1. Plaats de muis stevig op het MPI-bed zoals weergegeven in afbeelding 2E.
    NOTITIE: Zorg ervoor dat de snuit goed is uitgelijnd met de ingebouwde neuskegel van het bed voor een goed onderhoud van de anesthesie tijdens het scannen.
    LET OP: Onvoldoende anesthesie tijdens de scan kan ertoe leiden dat de muis wakker wordt terwijl de scan wordt uitgevoerd.
  5. Zodra de muis in de scanner is geplaatst, duwt u het bed in de boring en klikt u op Scan starten.
  6. Nadat de scan is voltooid, verwijdert u de muis uit het MPI-bed en plaatst u deze in een herstelkooi die op een verwarmingskussen is geplaatst. Monitor totdat hij volledig hersteld is van de anesthesie.
  7. Analyseer de afbeeldingen met behulp van beeldanalysesoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De pilotstudie werd uitgevoerd met zes muizen. Hiervan stierf slechts één muis vóór de voltooiing van het onderzoek, op dag 10. 2D MPI-signaalintensiteiten voor verschillende labelconcentraties werden beoordeeld als functie van het aantal cellen (Figuur 1A). Er werd waargenomen dat de signaalintensiteit recht evenredig was met de concentratie van de ijzeroxidetracer. Daarom werd de concentratie van 250 μg/ml beschouwd als de optimale etiketteringsconcentrati...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Intratracheale instillatie bij muizen is een nauwkeurige techniek om stoffen rechtstreeks in de longen af te geven. Zorgvuldige aandacht is vereist tijdens meerdere kritieke stappen tijdens deze procedure. Te beginnen met het zorgen voor de juiste diepte van de anesthesie om ongemak en beweging te voorkomen en het positioneren van de muis in rugligging met de nek gestrekt om de luchtweg uit te lijnen voor duidelijke toegang tot de tracheale opening. Het gebruik van een tongspatel kan hel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De financiering voor deze studie werd mede mogelijk gemaakt door de subsidie van R01HL153165-01A1 aan X.P.L. en R21AI159928-01 aan P.W.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL microcentrifuge tubeDOT ScientificRN1700-GMTVoor celcollectie en het bereiden van BLM-verdunningen
Anti-Dextran antilichaamSTEMCELL Technologies60026Primair antilichaam
BD Luer-Lok SpuitBecton, Dickinson309628Voor luchtinjecties tijdens intratracheale instillatie
Cytospin 3Thermo Shandon74010121GB
DNase IMillipore-Sigma10104159001
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS -/-) Gibco14190250
Fetaal runder serum ThermoFisher ScientificA5670701
Gentamicine Gibco15750060
Geit anti-Muis IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secundair Antilichaam, Alexa Fluor™ 568ThermoFisher ScientificA-11004Secundair antilichaam
Geit serumMillipore-SigmaG9023
IsofluraanCovetrus11695067772Gasanesthesie
IsofluraanverdamperSOMNI ScientificVS6002Anesthesie apparaat
MomentumMagnetic Insight IncPreklinische Magnetische Deeltjes Beeldvorming (MPI) scanner
Muis intubatiekitOHANOhan-201Complete intubatiekit met alle benodigde accessoires
NOD/SCID MuizenJackson LaboratoryRRID:IMSR_JAX:001303Immunodeficiënte muismodel
Penicilline/Streptomycine Gibco15140122
PneumaCult-Ex Plus Medium STEMCELL Technologies5040
ProLong Diamond Antifade Mountant met DAPI InvitrogenP36962Montage medium voor immunogeverfde slides
Protease uit Streptomyces griseus Millipore-SigmaP5147
Chirurgische kitBlunt-end pincetten gebruikt voor het vasthouden van de tong van de muis
Tris-Buffered Saline met Tween20 (TBST)ThermoFisher Scientific28360
TrypLE Express Enzym ThermoFisher Scientific12604021
VivoTrax PlusMagnetic InsightMIVTP01IJzeroxide tracer voor cellabeling in vitro en daaropvolgende MPI

Referenties

  1. Biehl, J. K., Russell, B. Introduction to Stem Cell Therapy. J Cardiovasc Nurs. 24 (2), 98-103 (2009).
  2. Herberts, C. A., Kwa, M. S. G., Hermsen, H. P. H. Risk factors in the development of stem cell therapy. J Transl Med. 9 (1), 29(2011).
  3. Bair, S. M., Brandstadter, J. D., Ayers, E. C., Stadtmauer, E. A. Hematopoietic stem cell transplantation for blood cancers in the era of precision medicine and immunotherapy. Cancer. 126 (9), 1837-1855 (2020).
  4. Xuan, L., Liu, Q. Maintenance therapy in acute myeloid leukemia after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. J Hematol Oncol. 14 (1), 4(2021).
  5. Zhu, C., Wu, W., Qu, X. Mesenchymal stem cells in osteoarthritis therapy: a review. Am J Transl Res. 13 (2), 448-461 (2021).
  6. Giorgino, R., et al. Knee osteoarthritis: Epidemiology, pathogenesis, and mesenchymal stem cells: What else is new? An update. Int J Mol Sci. 24 (7), 6405(2023).
  7. Jeyagaran, A., et al. Type 1 diabetes and engineering enhanced islet transplantation. Adv Drug Deliv Rev. 189, 114481(2022).
  8. Shinozaki, M., Nagoshi, N., Nakamura, M., Okano, H. Mechanisms of stem cell therapy in spinal cord injuries. Cells. 10 (10), 2676(2021).
  9. Zipser, C. M., et al. Cell-based and stem-cell-based treatments for spinal cord injury: evidence from clinical trials. Lancet Neurol. 21 (7), 659-670 (2022).
  10. Kim, S. W., et al. Neural stem cells derived from human midbrain organoids as a stable source for treating Parkinson's disease: Midbrain organoid-NSCs (Og-NSC) as a stable source for PD treatment. Prog Neurobiol. 204, 102086(2021).
  11. Nie, L., et al. Directional induction of neural stem cells, a new therapy for neurodegenerative diseases and ischemic stroke. Cell Death Discov. 9 (1), 215(2023).
  12. Yue, C., Feng, S., Chen, Y., Jing, N. The therapeutic prospects and challenges of human neural stem cells for the treatment of Alzheimer's Disease. Cell Regen. 11 (1), 28(2022).
  13. Kim, J. -H., et al. Human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids for modeling pulmonary fibrosis and drug testing. Cell Death Discov. 7 (1), 48(2021).
  14. Cheng, W., Zeng, Y., Wang, D. Stem cell-based therapy for pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 492(2022).
  15. Milman Krentsis, I., et al. Lung cell transplantation for pulmonary fibrosis. Sci Adv. 10 (34), eadk2524(2024).
  16. Suezawa, T., et al. Disease modeling of pulmonary fibrosis using human pluripotent stem cell-derived alveolar organoids. Stem Cell Rep. 16 (12), 2973-2987 (2021).
  17. Madrid, M., Sumen, C., Aivio, S., Saklayen, N. Autologous induced pluripotent stem cell-based cell therapies: Promise, progress, and challenges. Curr Protoc. 1 (3), e88(2021).
  18. Balistreri, C. R., et al. Stem cell therapy: old challenges and new solutions. Mol Biol Rep. 47 (4), 3117-3131 (2020).
  19. Richeldi, L., Collard, H. R., Jones, M. G. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 389 (10082), 1941-1952 (2017).
  20. Tzouvelekis, A., Antoniadis, A., Bouros, D. Stem cell therapy in pulmonary fibrosis. Curr Opin Pulm Med. 17 (5), 368-373 (2011).
  21. Rawlins, E. L. Lung epithelial progenitor cells. Proc Am Thorac Soc. 5 (6), 675-681 (2008).
  22. Han, M. -M., et al. Nanoengineered mesenchymal stem cell therapy for pulmonary fibrosis in young and aged mice. Sci Adv. 9 (29), eadg5358(2023).
  23. Averyanov, A., et al. First-in-human high-cumulative-dose stem cell therapy in idiopathic pulmonary fibrosis with rapid lung function decline. Stem Cells Transl Med. 9 (1), 6-16 (2019).
  24. Glassberg, M. K., et al. Allogeneic human mesenchymal stem cells in patients with idiopathic pulmonary fibrosis via intravenous delivery (AETHER): A phase I safety clinical trial. Chest. 151 (5), 971-981 (2017).
  25. Zhao, X., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cell therapy for reverse bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Sci Rep. 13 (1), 13183(2023).
  26. Tzouvelekis, A., et al. A prospective, non-randomized, no placebo-controlled, phase Ib clinical trial to study the safety of the adipose derived stromal cells-stromal vascular fraction in idiopathic pulmonary fibrosis. J Transl Med. 11 (1), 171(2013).
  27. Tzouvelekis, A., et al. Stem cell therapy for idiopathic pulmonary fibrosis: a protocol proposal. J Transl Med. 9 (1), 182(2011).
  28. Choi, S. M., et al. Classical monocyte-derived macrophages as therapeutic targets of umbilical cord mesenchymal stem cells: comparison of intratracheal and intravenous administration in a mouse model of pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 68(2023).
  29. Llontop, P., et al. Airway transplantation of adipose stem cells protects against bleomycin-induced pulmonary fibrosis. J Investig Med. 66 (4), 739-746 (2018).
  30. Gad, E. S., et al. The anti-fibrotic and anti-inflammatory potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells and nintedanib in bleomycin-induced lung fibrosis in rats. Inflammation. 43 (1), 123-134 (2020).
  31. Aal Porzionato,, et al. Intratracheal administration of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles reduces lung injuries in a chronic rat model of bronchopulmonary dysplasia. Am Jl Physiol Lung Cell Mol Physiol. 320 (5), L688-L704 (2021).
  32. Ortiz-Muñoz, G., Looney, M. R. Non-invasive Intratracheal Instillation in Mice. Bio Protoc. 5 (12), e1504(2015).
  33. Srinivas, M., et al. Imaging of cellular therapies. Adv Drug Deliv Rev. 62 (11), 1080-1093 (2010).
  34. Li, Z., Tong, L., Zhao, H., He, Z. Medical Imaging in Clinical Practice. Erondu, F. O. , IntechOpen. (2013).
  35. Knopp, T., Gdaniec, N., Möddel, M. Magnetic particle imaging: from proof of principle to preclinical applications. Phys Med Biol. 62 (14), R124-R178 (2017).
  36. Borgert, J., et al. Fundamentals and applications of magnetic particle imaging. J Cardiovasc Computed Tomogr. 6 (3), 149-153 (2012).
  37. Mohapatra, J., et al. Principles and applications of magnetic nanomaterials in magnetically guided bioimaging. Mater Today Phys. 32, 101003(2023).
  38. Pablico-Lansigan, M. H., Situ, S. F., Samia, A. C. S. Magnetic particle imaging: advancements and perspectives for real-time in vivo monitoring and image-guided therapy. Nanoscale. 5 (10), 4040-4055 (2013).
  39. Bulte, J. W. M., et al. Quantitative "hot-spot" imaging of transplanted stem cells using superparamagnetic tracers and magnetic particle imaging. Tomography. 1 (2), 91-97 (2015).
  40. Lemaster, J. E., Chen, F., Kim, T., Hariri, A., Jokerst, J. V. Development of a trimodal contrast agent for acoustic and magnetic particle imaging of stem cells. ACS Appl Nano Mater. 1 (3), 1321-1331 (2018).
  41. Shalaby, N., et al. Complementary early-phase magnetic particle imaging and late-phase positron emission tomography reporter imaging of mesenchymal stem cells in vivo. Nanoscale. 15 (7), 3408-3418 (2023).
  42. Wang, Q., et al. Artificially engineered cubic iron oxide nanoparticle as a high-performance magnetic particle imaging tracer for stem cell tracking. ACS Nano. 14 (2), 2053-2062 (2020).
  43. Li, X., et al. Extravascular sources of lung angiotensin peptide synthesis in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 291 (5), L887-L895 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CeltherapieSPION labelingceltransplantatielongitudinale beeldvormingimmunokleuringhistologische validatie

Gerelateerde artikelen