Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De rol van glia bij glaucoom is een steeds prominenter onderzoeksonderwerp, maar er is nog veel onbekend over hoe populaties van deze ondersteunende cellen - namelijk astrocyten en microglia - de overleving van retinale ganglioncellen beïnvloeden. Hoewel in vivo en in vitro modellen een zekere mate van inzicht bieden, hebben beide benaderingen aanzienlijke beperkingen, zoals de impact van perifere immuunrespons in de eerste en veranderingen in de fysiologische functie geïnduceerd door celisolatie en -cultuur in het geval van de laatste. Om deze verstorende factoren te minimaliseren, hebben we een ex vivo retinaal explantatiesysteem ontwikkeld waarin astrocyten, microglia en andere retinale celtypen gedurende perioden van ten minste 3 dagen in situ kunnen worden gehouden, waardoor gericht onderzoek mogelijk is met een hogere doorvoer dan doorgaans haalbaar is met in vivo modellen. Cruciaal is dat deze benadering zeer vatbaar is voor methodologieën die uitdagend of onhaalbaar zouden zijn in een levend dier, maar toch compatibel blijft met gemeenschappelijke stroomafwaartse testen van intact zenuwweefsel. Hier presenteren we een protocol dat geschikt is voor de isolatie en kweek van intacte retinale explantaten, samen met representatieve resultaten van immunofluorescentiemicroscopie die de veranderingen documenteert die glia- en retinale ganglioncellen in het ex vivo netvlies ondergaan.
Inleiding
Het lichtgevoelige netvlies, een verlengstuk van het centrale zenuwstelsel (CZS) aan de achterkant van het oog, is essentieel voor het gezichtsvermogen, maar kwetsbaar voor zowel acuut letsel als chronische ziekten. Net als bij andere CZS-regio's worden neuronen in het volwassen netvlies niet vervangen wanneer ze verloren gaan, en de retinale ganglioncellen (RGC's) die visuele informatie verzamelen en doorgeven aan de hersenen zijn bijzonder kwetsbaar voor disfunctie en overlijden bij glaucoom, wat resulteert in onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen 1,2. Glaucoom is we....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Schepens Eye Research Institute (Protocol # 2022N000030, goedgekeurd op 3/4/2025). Dieren werden behandeld in overeenstemming met de Verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek.
OPMERKING: Figuur 1 toont de belangrijkste stappen in de isolatie van het levende netvlies van het ontkernde muizenoog.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Op macroscopische schaal blijven geëxplanteerde netvliezen in wezen onveranderd op zowel 1- als 3-daagse tijdstippen, hoewel ze tegen de laatste tijd relatief kwetsbaar worden, waardoor een zorgvuldige behandeling voorafgaand aan fixatie of andere experimentele eindpunten nodig is. Netvliezen moeten relatief vlak zijn, zonder vouwen (wat kan leiden tot plaatselijke verstoring van de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen) en moeten worden gesuspendeerd in de media tussen de lucht-vloei.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Organotypische cultuur32-benaderingen zoals retinale explantaten maken gebruik van de experimentele flexibiliteit en snelle doorlooptijd van celcultuur, terwijl veel van de in situ context van in vivo studies behouden blijft, waardoor ze een krachtige manier zijn om complexe interacties tussen celtypen te onderzoeken. We presenteren dit protocol als een startpunt voor onderzoekers die mogelijk veel ervaring hebben met het oog en zich op hun gemak.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
M.A.M. werd ondersteund door NIH/NEI R01EY035312, de Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award, de Melza M. en Frank Theodore Barr Foundation, de Robert M. Sinskey, MD, Foundation, de Ruettgers Family Charitable Foundation en de B.L. Manger Foundation. P.F.C. werd ondersteund door NIH/NEI 2T32EY007145. Dit werk werd ook mogelijk gemaakt door een NIH Core Grant voor Vision Research P30 EY003176. Figuur 1 is gegenereerd met Biorender. De auteurs willen Dr. Nasir Uddin bedanken voor feedback op het manuscript en Dr. Qiurong Zhu voor hulp en ondersteuning.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| #11 Scalpel blades | Bard-Parker | 3,71,311 | |
| 1 mL pipet ('Pipetman P1000') | Gilson | F144059M | |
| 100 mm Petri dish | Falcon | 351029 | |
| 16% Paraformaldehyde | Ted Pella Inc | 18,505 | Verdund tot 4% voor fixatie |
| 24 Well Plate | Falcon | 353047 | Voor fixatie, blocking en antilichaam incubatie |
| 35 mm Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 6-well plate and insert kit | Greiner bio-one | 657641 | |
| Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 711-545-152 | 1:800 verdunning |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed | Invitrogen | A-21209 | 1:800 verdunning |
| Alexa Fluor 594-F(ab')2 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 715-586-150 | 1:800 verdunning |
| Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 706-605-148 | 1:800 verdunning |
| Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 703-606-155 | 1:800 verdunning |
| Angled forceps ('5/45') | FST / Dumont | 11251-35 | |
| Anti-Brn3a antibody (mouse) | Chemicon | MAB1585 | 1:200 verdunning |
| Anti-CD206 antibody (rat) | Biorad | MCA2235 | 1:200 verdunning |
| Anti-GFAP antibody (chicken) | Abcam | ab4674 | 1:1000 verdunning |
| Anti-Iba1 antibody (rabbit) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 019-19741 | 1:500 verdunning |
| Anti-Tmem119 antibody (guinea pig) | Synaptic Systems | 400 004 | 1:500 verdunning |
| B-27, 50x | Gibco (Thermofisher) | 17504044 | |
| Blunt curved forceps ('Extra Fine Graefe) | FST | 11152-10 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9647 | Gebruik 1% w/v voor blocking en antilichaam incubatie |
| Filter kit (0.2 µm aPES membrane, 150 mL Bottle Top Filter) | fisherscientific | FB12566508 | |
| fine brush, size 3/0 | princeton art & brush co. | 06435-1030 | |
| GlutaMax | Gibco (Thermofisher) | 35050061 | |
| Lab wipes (Kim wipes) | KIMTECH | 34155 | |
| N-2, 100x | Gibco (Thermofisher) | 17502048 | |
| Neurobasal-A Medium, minus phenol red | Gibco (Thermofisher) | 12349015 | |
| Normal Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 017-000-121 | Gebruik bij 10% voor blocking en antilichaam incubatie |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco (Thermofisher) | 15140122 | |
| Pipet Tips, 1000 µL | TipOne | 1126-7810 | |
| Spring Scissors ('Cohan-Vannas') | FST | 15000-11 | |
| Sterile water ('Dnase, Rnase free') | Invitrogen | 10977-015 | |
| Sterile-filtered PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Straight forceps ('mini') | FST / Dumont | 11200-14 | |
| Transfer Pipet, 5.8 mL | fisherscientific | 13-711-9AMMD | |
| Triton X-100 | Thermo Scientific Chemicals | A16046.AP | Gebruik bij 0,5% voor blocking en antilichaam incubatie |
Referenties
- Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
- Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
