Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68482

⸱

15 juli 2025

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Schepens Eye Research Institute of Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Hier bieden we een gedetailleerde methodologie voor het isoleren van het netvlies van het oog van de muis voor uitgebreide ex vivo experimenten. Dit protocol benadrukt het toegankelijk maken van deze technisch veeleisende benadering voor onderzoekers die willen profiteren van de onderzoeksmogelijkheden die worden geboden door retinale glia in situ te houden in levend weefsel.

Samenvatting

De rol van glia bij glaucoom is een steeds prominenter onderzoeksonderwerp, maar er is nog veel onbekend over hoe populaties van deze ondersteunende cellen - namelijk astrocyten en microglia - de overleving van retinale ganglioncellen beïnvloeden. Hoewel in vivo en in vitro modellen een zekere mate van inzicht bieden, hebben beide benaderingen aanzienlijke beperkingen, zoals de impact van perifere immuunrespons in de eerste en veranderingen in de fysiologische functie geïnduceerd door celisolatie en -cultuur in het geval van de laatste. Om deze verstorende factoren te minimaliseren, hebben we een ex vivo retinaal explantatiesysteem ontwikkeld waarin astrocyten, microglia en andere retinale celtypen gedurende perioden van ten minste 3 dagen in situ kunnen worden gehouden, waardoor gericht onderzoek mogelijk is met een hogere doorvoer dan doorgaans haalbaar is met in vivo modellen. Cruciaal is dat deze benadering zeer vatbaar is voor methodologieën die uitdagend of onhaalbaar zouden zijn in een levend dier, maar toch compatibel blijft met gemeenschappelijke stroomafwaartse testen van intact zenuwweefsel. Hier presenteren we een protocol dat geschikt is voor de isolatie en kweek van intacte retinale explantaten, samen met representatieve resultaten van immunofluorescentiemicroscopie die de veranderingen documenteert die glia- en retinale ganglioncellen in het ex vivo netvlies ondergaan.

Inleiding

Het lichtgevoelige netvlies, een verlengstuk van het centrale zenuwstelsel (CZS) aan de achterkant van het oog, is essentieel voor het gezichtsvermogen, maar kwetsbaar voor zowel acuut letsel als chronische ziekten. Net als bij andere CZS-regio's worden neuronen in het volwassen netvlies niet vervangen wanneer ze verloren gaan, en de retinale ganglioncellen (RGC's) die visuele informatie verzamelen en doorgeven aan de hersenen zijn bijzonder kwetsbaar voor disfunctie en overlijden bij glaucoom, wat resulteert in onomkeerbaar verlies van het gezichtsvermogen 1,2. Glaucoom is wereldwijd een belangrijke oorzaak van blindheid3, maar ondanks de verwoestende impact op getroffen personen en de totale kosten voor de samenleving, blijft er nog veel onbekend over hoe de vroege stadia van de ziekte bijdragen aan RGC-verlies4. De rol van glia is een belangrijk onderzoeksgebied in de pathofysiologie van glaucoom, aangezien deze niet-neuronale ondersteunende cellen essentieel zijn voor de overleving van RGC5 maar fenotypische veranderingen ondergaan bij de ziekte die gunstig gedrag kunnen verminderen6 of zelfs de acceptatie van schadelijke fenotypes kunnen stimuleren7. Hoewel de term glia een reeks gespecialiseerde celtypen in het CZS omvat8, kunnen deze grofweg worden onderverdeeld in twee categorieën: die welke een ontwikkelingslijn delen met neuronen en trofische, energetische en structurele ondersteuning bieden9, en die met een myeloïde oorsprong, die gespecialiseerde immuunbewakings- en responstaken uitvoeren10. Vertegenwoordigers van beide categorieën - astrocyten en Müller-cellen in de eerste, microglia in de laatste - bevolken het netvlies5 en ondergaan grote veranderingen in glaucoom die belangrijke vragen oproepen over hun rol in ziekteprogressie en RGC-overleving11.

Pogingen om deze vragen te beantwoorden worden gedeeltelijk belemmerd door intrinsieke kenmerken van retinale glia die een uitdaging vormen voor zowel in vivo als in vitro onderzoek. In tegenstelling tot neuronen zijn ze elektrisch relatief stil, waardoor benaderingen zoals ERG die functionele beoordeling van RGC's en fotoreceptoren in vivo mogelijk maken, ongeschikt zijn voor het onderzoeken van veranderingen in gliafunctie en gedrag. En hoewel induceerbare12 en spontane13 modellen van glaucoom beschikbaar zijn, blijft er nog veel onbekend over veranderingen in glia op de vroegste tijdstippen van de ziekte, die kunnen voorafgaan aan detecteerbaar RGC-verlies, een probleem dat wordt verergerd door de variabele penetrantie van de ziektetoestand in veel van deze modellen. Bovendien suggereert bewijs van zowel klinisch als experimenteel glaucoom bijdragen van perifere immuuncellen die moeilijk te onderscheiden zijn van die van microglia, ondanks indicatoren dat ze in verschillende 'richtingen' kunnen werken om de ziekteprogressie te beïnvloeden14,15.

Er zijn ook uitdagingen in overvloed bij het bestuderen van retinale glia in vitro. Hoewel isolatie en kweek van astrocyten16,17 en microglia18 uit de hersenen goed ingeburgerd zijn, wijst recent werk op uitgebreide gliale heterogeniteit tussen CZS-regio's, vooral in astrocyten19, en fenotypes die in de ene regio aanwezig zijn, zijn mogelijk niet aanwezig in glia uit een andere, zoals het netvlies20,21. Het direct isoleren van retinale astrocyten en microglia voor studie is echter bijzonder uitdagend, aangezien beide celtypen relatief schaars zijn - elk vormt minder dan 1% van de geschatte 6,5 miljoen cellen in het netvlies van de muis 22,23,24. Bovendien zijn glia, in tegenstelling tot neuronen, zeer plastisch en passen ze zich snel aan dramatische veranderingen in hun omgevingaan 16,18,25; Als gevolg hiervan kan het gedrag dat in vitro in deze cellen wordt waargenomen, specifieke aanpassingen aan hun nieuwe omgeving vertegenwoordigen in plaats van fenotypische patronen die typisch zouden worden gezien bij gezondheid of ziekte. Gezien de beperkingen van zowel in vivo experimenten als primaire cultuur van retinale glia, hebben we gezocht naar een tussenliggende benadering - retinale explantaten - waarbij glia, RGC's en andere elementen van het netvlies in situ worden bewaard in een ex vivo context. In vergelijking met in vivo modellen biedt deze benadering een verkort experimenteel tijdsverloop26, maakt directe experimentele manipulatie van retinale glia27 mogelijk en vermijdt de mogelijk verstorende invloed van infiltratie van perifere immuuncellen14. Omgekeerd is er, in tegenstelling tot de primaire celcultuur, een minimale verstoring van de extracellulaire omgeving en blijven glia intact en morfologisch herkenbaar, waardoor de uitdagingen worden vermeden die gepaard gaan met het in wezen opnieuw groeien en identificeren van deze cellen na enzymatische en mechanische verstoring16,25.

Ten opzichte van eerder beschreven methodologieën voor retinale explantatie, legt deze benadering de nadruk op technische betrouwbaarheid, reproduceerbaarheid en het maximaliseren van de 'gebruiksvriendelijkheid' van de aanpak om de toegankelijkheid te verbeteren26,28. In persoonlijke communicatie met andere onderzoekers ontdekten we dat de technische uitdagingen die gepaard gaan met het omgaan met het levende netvlies een grote hindernis vormen voor velen die explantaten willen gebruiken, terwijl het onderhoud van het geëxplanteerde netvlies in cultuur relatief eenvoudig was voor groepen met de juiste celkweekfaciliteiten. Daarom bevat dit protocol een aantal innovaties die bedoeld zijn om de leercurve die gepaard gaat met netvliesisolatie te verminderen en onderzoekers in staat te stellen sneller te beginnen met het verzamelen van experimentele gegevens. Ten slotte, hoewel we speciale nadruk hebben gelegd op het potentieel van dit explantatiemodel voor het onderzoeken van het gedrag van retinale glia en het voornamelijk karakteriseren met immunofluorescentiemicroscopie, zijn andere retinale celtypen en structuren ook grotendeels geconserveerd, en blijven de geëxplanteerde netvliezen vatbaar voor een breed scala aan aanvullende onderzoekstechnieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij dieren betrokken zijn, werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Schepens Eye Research Institute (Protocol # 2022N000030, goedgekeurd op 3/4/2025). Dieren werden behandeld in overeenstemming met de Verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) voor het gebruik van dieren in oogheelkundig en gezichtsonderzoek.

OPMERKING: Figuur 1 toont de belangrijkste stappen in de isolatie van het levende netvlies van het ontkernde muizenoog.

figure-protocol-1
Figuur 1: Een schematische weergave van de belangrijkste stappen in de isolatie van het levende netvlies van het ontkernde muizenoog. De bijbehorende stapnummers van de belangrijkste stappen worden in cirkels weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Voorbereiding

  1. Desinfecteer een pipet van 1 ml en een hoektang en plaats ze in de bioveiligheidskast. Deze zullen nodig zijn in sectie 3 van het protocol.
  2. Wijzig een transferpipet door loodrecht over de as te snijden, ongeveer 2 cm onder het reservoir, waar de boring het breedst is, om de pipet in te korten en de opening te verbreden. Zorg voor een zuivere snede waarbij het netvlies niet blijft haken.
    OPMERKING: Dit gereedschap kan worden bewaard voor hergebruik als het tussen gebruik schoon is en wordt afgespoeld met steriel water.
  3. Bereid 50 ml explanteerbare media aseptisch in een bioveiligheidskast door 47,5 ml neurobasale media aan te vullen met 500 μl N-2-supplement, 1 ml B-27-supplement, 500 μl glutamax en 500 μl penicilline-streptomycinemix (eindconcentratie van 100 E/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine).
    OPMERKING: Bereid nieuwe explantatiemedia voor voor elke reeks isolaties; overtollige media kunnen tot 1 week op 4 °C worden bewaard en indien nodig worden gebruikt voor mediawisselingen. Vervang na opening ongebruikt Neurobasal medium na 1 maand. N-2 en B-27 moeten ingevroren worden bewaard als aliquots voor eenmalig gebruik, waarbij vries-dooicycli worden vermeden.
  4. Bereid in een bioveiligheidskast aseptisch kweekplaat(en) voor door een inzetstuk toe te voegen aan elk te gebruiken putje, te hanteren via de 'uitsteeksels' die uit de rand van het inzetstuk komen om te voorkomen dat u oppervlakken aanraakt die in contact komen met kweekmedia.
    1. Voeg 1 ml explantatiemedia toe aan de insert, gevolgd door een extra 3 ml die aan de put zelf wordt toegevoegd. Voeg 2-3 ml steriel water toe aan ongebruikte putjes om de verdamping tegen te gaan.
    2. Breng de plaat(en) ongeveer 30 minuten voor weefselisolatie over naar de broedmachine bij 37 °C met 5% CO2 om in evenwicht te zijn.
  5. Bereid filtervierkanten voor om een substraat te creëren voor weefselstabilisatie en -overdracht. Haal het filter uit een filterkit met flessendop door met een scheermes of scalpel rond de omtrek van het materiaal te snijden. Zorg ervoor dat u geen letsel oploopt of het filter beschadigt door vouwen of scheuren.
    NOTITIE: Het verwijderen van het doorzichtige plastic reservoir met een stevig scheermes om het meer kneedbare ondoorzichtige plastic te snijden waar de schroefdraadadapter het reservoir raakt, vereenvoudigt het extractieproces, maar extra voorzichtigheid is geboden om letsel te voorkomen.
    1. Nadat het filter is losgemaakt door te snijden, gebruikt u een tang om het te verwijderen. Let op de oriëntatie van het filter tijdens en na het afzuigen; De matte kant (die naar het reservoir is gericht) moet rechtop staan voor het monteren van het netvlies in stap 2.16 voor overdracht.
    2. Snijd het filter in kleine vierkantjes van ongeveer 7 mm × 7 mm; Voor elke retinale explantatie is één vierkant nodig. Week de vierkantjes minimaal 20 minuten voor in steriel water in een petrischaaltje van 100 mm.
      OPMERKING: Filtervierkanten kunnen tot 1 week voor gebruik ondergedompeld blijven in steriel water. Vanwege de neiging van de filtervierkanten om voorafgaand aan het onderdompelen een hoge mate van statische lading te ontwikkelen, moet u slechts zoveel vierkanten voorbereiden als nodig is. Het resterende droge filtermateriaal kan voor onbepaalde tijd in een steriel petrischaaltje van 100 mm worden bewaard voor later gebruik.

2. Isolatie en montage

  1. Euthanaseer de muis via een goedgekeurde methode alvorens te bevestigen met een secundaire benadering; deze studie maakte gebruik van CO2-verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Ontpit beide ogen met een gebogen, stompe tang en plaats ze in steriel PBS.
  2. Bereid de werkruimte voor door een petrischaal van 100 mm te vullen met steriel PBS en deze op het podium van de verrekijkerdissectiescoop te plaatsen.
    1. Knip een 1 cm brede strook laboratoriumdoekje af en dompel het onder in de schaal om als stabiliserend substraat te fungeren.
    2. Breng het ene oog over naar de dissectieschaal, laat het andere in PBS en plaats het op ijs of in de koelkast bij 4 °C.
      OPMERKING: Vanwege de gevoeligheid van het netvlies voor een langdurig postmortaal interval, wordt aanbevolen om één muis tegelijk te euthanaseren.
  3. Positioneer en immobiliseer het oog. Gebruik een tang om het oog op het ondergedompelde laboratoriumdoekje te manoeuvreren, wat de stabilisatie zal bevorderen.
    1. Identificeer een geschikt vasthoudpunt, pak het vast met een schuine tang en rol het oog voorzichtig zodat het van opzij of, idealiter, van onderaf wordt vastgehouden. Zorg ervoor dat de anterieure-posterieure as (d.w.z. van het hoornvlies naar de oogzenuw) horizontaal is. Deze oriëntatie verbetert het zicht en minimaliseert de druk op het oog tijdens dissectie.
      OPMERKING: Pak indien mogelijk extraorbitaal weefsel vast om te voorkomen dat het oog wordt doorboord of samengeknepen, waarbij de voorkeur wordt gegeven aan spieren of bindvlies boven oogzenuw of vet.
  4. Terwijl u de schuine tang vasthoudt, moet u ervoor zorgen dat het oog volledig ondergedompeld is en veilig geïmmobiliseerd is. Maak een incisie met de punt van het #11 scalpel evenwijdig en ongeveer 0,5 mm achter de limbus, waar het hoornvlies overgaat naar de sclera.
    OPMERKING: Deze incisie moet net groot genoeg zijn om op de punt van één blad van de veerschaar te passen. Omdat de scherpte van de scalpelpunt essentieel is om de wereld netjes te doorboren, vervang je het mesje na elke twee netvliezen.
    1. Steek een mes van de veerschaar in de wereldbol en begin circumlimbally rond het oog te knippen, waarbij u het oog indien nodig voorzichtig verplaatst met behulp van een tang.
      OPMERKING: Deze snede moet zo recht en evenwijdig mogelijk aan de limbus zijn; Het verplaatsen van het oog kan vereisen dat u de schaar neerlegt en een tang met elke hand gebruikt. Eenmaal blootgesteld, houd het netvlies tijdens de dissectie ondergedompeld.
  5. Zodra de snede het oog heeft omschreven, verwijdert u voorzichtig het voorste segment en de lens en draait u de oogschelp vervolgens naar boven om visuele inspectie en verwijdering van glasvocht te vergemakkelijken. Als er een verlengd stuk oogzenuw blijft zitten, knip het dan af tot een kortere (1-2 mm) lengte om dit te vergemakkelijken.
  6. Inspecteer het netvlies op zichtbare schade en de vitrealische kamer op vuil, zoals gepigmenteerde cellen van de RPE of het vaatvlies die mogelijk zijn binnengedrongen tijdens het verwijderen van het voorste segment. Gebruik een schuine tang om de oogschelp in deze positie te immobiliseren.
    OPMERKING: Voor een optimaal resultaat moet vuil in de glashof worden verwijderd en moeten resterende glasvocht- en aanhangende restanten van het ciliaire lichaam aan de rand van het netvlies tot een minimum worden beperkt. Dit kan een uitdagend proces zijn en aanvullende opmerkingen zijn te vinden in de secties 'Mechanisch letsel herkennen en oplossen' en 'Metabolisch letsel' van de representatieve resultaten.
    1. Gebruik de aangepaste transferpipet om de glasvochtkamer door te spoelen met PBS om kleine deeltjes te verwijderen, vermijd luchtbellen door de pipetpunt onder het oppervlak van de vloeistof te houden en een voldoende hoeveelheid PBS in de reservoirbol te houden.
    2. Verwijder groter vuil met een fijn aquarelpenseel, waardoor contact met het netvliesoppervlak tot een minimum wordt beperkt. Verwijder indien nodig meer hardnekkig vuil met een tang met een fijne punt; Vermijd echter direct contact van metalen gereedschapspunten met het netvlies om schade te voorkomen.
  7. Na het verwijderen van zichtbaar vuil, spoelt u de glaskamer herhaaldelijk (3-5 keer) door met PBS uit de transferpijp, zoals hierboven beschreven. Hiermee wordt losjes aanhangend glasvocht verwijderd dat kan achterblijven na het verwijderen van vuil. Gebruik de fijne borstel om de kamer voorzichtig te onderzoeken, vooral in de buurt van de periferie als er nog elementen van het corpus ciliare achterblijven. Hoewel het glasvocht optisch transparant is, zal het fungeren als een rem op borstelvezels en kan het op deze manier worden gedetecteerd.
    OPMERKING: Een dunne restlaag glasvocht op het netvlies lijkt geen negatieve invloed te hebben op de isolatie of het ex vivo houden van het netvlies, maar de aanwezigheid van aanzienlijke hoeveelheden aan de periferie van het netvlies, vaak geassocieerd met resterende structuren van het corpus ciliary, kan netvliesvouwing en monsterverlies veroorzaken als het niet wordt verwijderd.
    1. Als er aanzienlijke zakken glasvocht achterblijven, gebruik dan de borstel om deze te verwijderen door voorzichtig naar buiten te vegen in de richting van de periferie, en zorg ervoor dat als de vezels van de borstel in contact komen met het netvlies, ze dit vanuit een ondiepe hoek doen en de borstel volgen, trekkend in plaats van duwend glasvocht uit de kamer.
      OPMERKING: Het verwijderen van glasvocht vereist een bijzonder zorgvuldige behandeling om schade aan het netvlies te voorkomen die mogelijk niet macroscopisch zichtbaar is; advies over het herkennen en vermijden van deze schade is te vinden in de secties 'Mechanisch letsel herkennen en oplossen' en 'Metabool letsel' van de Representatieve resultaten.
  8. Zodra het glasvocht is ontdaan van vuil en er nog maar een minimaal glasvocht overblijft, scheidt u voorzichtig het buitenste netvlies van de oogschelp terwijl u het monster blijft stabiliseren met een schuine tang. Vermijd beschadiging van de kop van de oogzenuw en laat deze structuur intact om het netvlies te verankeren.
    1. Neem een tang, houd ze in gesloten positie met de uiteinden tegen elkaar, en steek ze voorzichtig tussen het netvlies en het vaatvlies, indien mogelijk met behulp van een reeds bestaande opening van eerdere behandeling. Gebruik de platte armen van de tang, in plaats van de uiteinden, om de zak tussen het netvlies en het vaatvlies te vergroten totdat deze structuren volledig kunnen worden gescheiden.
      OPMERKING: Benadruk zijwaartse bewegingen, in plaats van op de uiteinden te duwen, om de opening tussen het netvlies en het vaatvlies te vergroten. Door de tang tijdens deze bewegingen voorzichtig te draaien, kan de scheiding worden verbeterd en tegelijkertijd de pure stress door wrijving tussen de tang en het weefsel worden verminderd.
  9. Nadat u het buitenste netvlies van het vaatvlies hebt gescheiden, gaat u verder met het stabiliseren van het monster terwijl u een tweede tang gebruikt om de oogschelp - sclera, choroïd, enz. - naar beneden te trekken. Als het netvlies met succes is gescheiden, moet het op zijn plaats blijven, vastgemaakt aan de kop van de oogzenuw, terwijl de oogschelp kan worden vastgehouden door een enkele tang. Als het netvlies met de oogschelp naar beneden drukt, ga dan voorzichtig door met het onderzoeken en scheiden van andere verbindingspunten dan de oogzenuwkop.
  10. Met het netvlies verankerd aan de oogzenuwkop, gaat u door met het immobiliseren van het weefsel en gebruikt u de tweede tang om de oogschelp onder de oogzenuwkop op te rollen.
    1. Controleer of geen van de periferie van het netvlies vastzit in een omgevouwen positie als gevolg van overtollig glasvocht in de hoek tussen het netvlies en een eventueel achtergebleven ciliair lichaam. Spoel indien nodig de kamer met PBS met behulp van de transferpipet om eventueel extra vuil te verwijderen, en gebruik de borstel voorzichtig om het weefsel te ontkrullen en overtollig glasvocht te verwijderen, terwijl u ervoor zorgt dat u niet te veel aan het weefsel trekt.
  11. Met het netvlies aan beide kanten blootgelegd, gebruikt u de veerschaar om een reeks ontlastende sneden te maken, op een afstand van ongeveer 90° van elkaar, die zich in een rechte lijn uitstrekt van de periferie naar de kop van de oogzenuw en ongeveer 1 mm van het midden stopt. Dit minimaliseert de doorsnijding van axonen van retinale ganglioncellen in het netvlies, waardoor de kwaliteit van gekweekte explantaten wordt verbeterd.
  12. Terwijl u het ondergedompelde weefsel op zijn plaats houdt, verwijdert u het laboratoriumdoekje voorzichtig met een tang om het zijdelings van het weefsel weg te trekken voordat u het uit de schaal haalt. Vermijd contact met het netvlies om hechting aan het doekje en mogelijk verlies van het monster te voorkomen.
  13. Blijf vervolgens het weefsel vasthouden en gebruik de veerschaar om de oogzenuw direct onder het netvlies door te snijden en verwijder vervolgens de rest van de oogschelp uit de schaal.
  14. Zodra het netvlies is geïsoleerd van de rest van het oog, vult u een petrischaaltje van 35 mm met PBS en gebruikt u een tang om een filtervierkant aan de onderkant te plaatsen met de ruwere matte kant naar boven. Zorg ervoor dat het filter niet kreukt, omdat dit het gebruik van het filter als substraat voor het bewegen van het netvlies kan belemmeren.
  15. Zuig het netvlies voorzichtig op met de transferpipet en breng het voorzichtig over naar de schaal van 35 mm. Manoeuvreer het netvlies met de borstel om ervoor te zorgen dat het binnenoppervlak van het netvlies rechtop staat en dat het weefsel direct boven het filtervierkant rust.
  16. Zuig PBS langzaam op uit de schaal met de transferpipet om het netvlies op het filter te laten zakken. Pauzeer indien nodig om het weefsel opnieuw aan te passen voordat u verder gaat totdat het netvlies zich op het filter heeft genesteld.
    OPMERKING: Snelle aspiratie kan een plotselinge zijwaartse beweging van het netvlies veroorzaken, wat kan leiden tot schade of weefselverlies. Het hele netvlies moet op het vierkant rusten om schade te voorkomen; als het netvlies zich echter in een problematische positie nestelt, kan PBS weer aan de schotel worden toegevoegd totdat het netvlies opnieuw is gesuspendeerd en opnieuw kan worden geprobeerd te monteren.
  17. Zodra het netvlies zich op het filter heeft genesteld, gebruikt u de borstel om het perifere netvlies dat mogelijk is omgevouwen uit te rollen. Breng het PBS-niveau zorgvuldig in evenwicht, zodat het netvlies niet gemakkelijk van het filter beweegt, terwijl er voldoende overblijft zodat het monster niet uitdroogt en het penseel soepel kan bewegen zonder het binnenste netvlies te beschadigen.
  18. Inspecteer nogmaals het netvlies op vuil. Om schade te voorkomen, reinigt u het netvlies zonder direct te hanteren met behulp van de transferpipet om PBS op het netvlies te druppelen vanaf ongeveer 1 cm boven het weefsel. Dit zou al het resterende vuil moeten wegspoelen, maar als er te veel PBS aan de schotel wordt toegevoegd, kan het netvlies weer omhoog drijven. Als dit gebeurt, voer dan opnieuw aspiratie uit om het weefsel opnieuw te monteren.
    OPMERKING: 'Sham'-monsters kunnen worden gegenereerd door het netvlies over te brengen naar een plaat met 24 putjes voor fixatie, blokkering/permeabilisatie en antilichaamkleuring zoals elders beschreven21. Deze schijncontroles zijn nuttig voor het oplossen van mechanische schade aan het netvlies die tijdens isolatie kan optreden.

3. Overdracht naar culturele media en onderhoud

  1. Sluit het deksel van de 35 mm schaal voor transport naar de bioveiligheidskast en houd de schaal waterpas om te voorkomen dat het netvlies van het filter losraakt. Als dit gebeurt, monteer dan opnieuw zoals hierboven.
  2. Plaats de gesloten schaal van 35 mm met het netvlies in de bioveiligheidskast en zorg ervoor dat u geen apparatuur of oppervlakken in de kast aanraakt voordat u handschoenen desinfecteert of verwisselt.
  3. Ontsmet handschoenen met ethanol en/of vervang ze en verplaats vervolgens de plaat met 6 putjes die vooraf is geladen met explantaire media van de broedmachine naar de bioveiligheidskast. Voer stap 3.4 en 3.5 uit in de bioveiligheidskast en gebruik de gereedschappen die daar tijdens stap 1.1 zijn geplaatst.
  4. Verwijder het deksel van de 35 mm schaal met het netvlies en gebruik een hoektang om het filtervierkant voorzichtig op te tillen zonder het netvlies direct aan te raken. Verwijder het deksel van de plaat met 6 putjes en plaats het filter over het midden van het inzetstuk van een geschikte put, en laat het vervolgens langzaam in het medium zakken. Het netvlies komt tijdens deze stap los van het filter en zweeft net onder de lucht-vloeistofinterface.
  5. Zodra het netvlies en het filter zijn gescheiden, beweegt u het filter langzaam weg van het netvlies en verwijdert u het van de media. Gebruik de pipet van 1 ml om 500 μL media uit het inzetstuk te verwijderen om ervoor te zorgen dat het netvlies plat ligt door het tussen de bodem van het inzetstuk en de lucht-vloeistofinterface te klemmen.
  6. Plaats het deksel terug op de plaat en plaats deze terug in de couveuse bij 37 °C met 5% CO2, waarbij u ervoor zorgt dat het netvlies in de buurt van het midden van de put blijft. Er kunnen maximaal 6 netvliezen in een enkele plaat worden bewaard.
    OPMERKING: Als explantaten 24 uur of minder worden bewaard, kunnen ze tot het einde van het experiment in de broedmachine blijven staan. Bij langere tijd bewaren wordt aanbevolen 50% van de mediaveranderingen na 1 dag in vitro en op afwisselende dagen daarna.

4. Fixatie voor immunokleuring (optioneel)

  1. Als u immunokleuring uitvoert, raadpleeg dan de volgende stappen voor fixatie; Hoewel immunokleuring kan worden uitgevoerd met behulp van parameters die eerder zijn beschreven voor plat gemonteerde netvliezen21, vereist fixatie van het geëxplanteerde netvlies specifieke overwegingen.
  2. Verwijder celkweekinzetstukken met explantaten en media van de kweekplaat met 6 putjes en plaats ze op een niet-poreus oppervlak (zoals het plastic deksel van de kweekplaat) dat na fixatie op de juiste manier kan worden weggegooid, aangezien de inzetstukken enigszins poreus zijn en kleine hoeveelheden fixatief naar dit onderliggende oppervlak zullen gaan.
  3. Verwijder voorzichtig kweekmedia uit de inlegvellen en voeg vervolgens 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe. Laat het netvlies 15 minuten fixeren in een zuurkast, verwijder vervolgens PFA en gooi het weg in overeenstemming met het institutionele beleid.
    LET OP: Paraformaldehyde is gevaarlijk en een voorloper van formaldehyde, een bekend carcinogeen. Wees voorzichtig en voer fixatie uit in een zuurkast met de juiste voorzorgsmaatregelen.
  4. Was het netvlies 3 keer (elk gedurende 5 minuten) met PBS om PFA te verwijderen en gebruik vervolgens een aangepaste transferpipet om het netvlies in PBS over te brengen naar individuele putjes in een plaat met 24 putjes voor blokkering, permeabilisatie en immunokleuring zoals elders beschreven21. Gooi met PFA verontreinigde kunststoffen (pipetpunten, inzetstukken en het niet-poreuze oppervlak dat tijdens de fixatie wordt gebruikt) weg in overeenstemming met het institutionele beleid.
    OPMERKING: De transferpipet kan worden bewaard om gefixeerde en gekleurde netvliezen over te brengen naar een objectglaasje voor montage en beeldvorming. Hoewel het geen direct contact met PFA mag hebben gehad, wordt het gebruik van verschillende transferpipetten aanbevolen voor het hanteren van levend en gefixeerd weefsel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Op macroscopische schaal blijven geëxplanteerde netvliezen in wezen onveranderd op zowel 1- als 3-daagse tijdstippen, hoewel ze tegen de laatste tijd relatief kwetsbaar worden, waardoor een zorgvuldige behandeling voorafgaand aan fixatie of andere experimentele eindpunten nodig is. Netvliezen moeten relatief vlak zijn, zonder vouwen (wat kan leiden tot plaatselijke verstoring van de diffusie van zuurstof en voedingsstoffen) en moeten worden gesuspendeerd in de media tussen de lucht-vloei...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Organotypische cultuur32-benaderingen zoals retinale explantaten maken gebruik van de experimentele flexibiliteit en snelle doorlooptijd van celcultuur, terwijl veel van de in situ context van in vivo studies behouden blijft, waardoor ze een krachtige manier zijn om complexe interacties tussen celtypen te onderzoeken. We presenteren dit protocol als een startpunt voor onderzoekers die mogelijk veel ervaring hebben met het oog en zich op hun gemak...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

M.A.M. werd ondersteund door NIH/NEI R01EY035312, de Glaucoma Research Foundation Catalyst for a Cure Award, de Melza M. en Frank Theodore Barr Foundation, de Robert M. Sinskey, MD, Foundation, de Ruettgers Family Charitable Foundation en de B.L. Manger Foundation. P.F.C. werd ondersteund door NIH/NEI 2T32EY007145. Dit werk werd ook mogelijk gemaakt door een NIH Core Grant voor Vision Research P30 EY003176.  Figuur 1 is gegenereerd met Biorender. De auteurs willen Dr. Nasir Uddin bedanken voor feedback op het manuscript en Dr. Qiurong Zhu voor hulp en ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#11 Scalpel bladesBard-Parker3,71,311
1 mL pipet ('Pipetman P1000')GilsonF144059M
100 mm Petri dishFalcon351029
16% ParaformaldehydeTed Pella Inc18,505Verdund tot 4% voor fixatie
24 Well PlateFalcon353047Voor fixatie, blocking en antilichaam incubatie
35 mm Petri dishFalcon351008
6-well plate and insert kitGreiner bio-one657641
Alexa Fluor 488-Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 711-545-1521:800 verdunning
Alexa Fluor 594 Donkey anti-Rat IgG (H+L) Highly Cross-AdsorbedInvitrogenA-212091:800 verdunning
Alexa Fluor 594-F(ab')2 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 715-586-1501:800 verdunning
Alexa Fluor 647-Donkey Anti-Guinea Pig IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 706-605-1481:800 verdunning
Alexa Fluor 647-F(ab')2 Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 703-606-1551:800 verdunning
Angled forceps ('5/45')FST / Dumont11251-35
Anti-Brn3a antibody (mouse)ChemiconMAB15851:200 verdunning
Anti-CD206 antibody (rat)BioradMCA22351:200 verdunning
Anti-GFAP antibody (chicken)Abcamab46741:1000 verdunning
Anti-Iba1 antibody (rabbit)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation019-197411:500 verdunning
Anti-Tmem119 antibody (guinea pig)Synaptic Systems400 0041:500 verdunning
B-27, 50xGibco (Thermofisher)17504044
Blunt curved forceps ('Extra Fine Graefe)FST11152-10
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647Gebruik 1% w/v voor blocking en antilichaam incubatie
Filter kit (0.2 µm aPES membrane, 150 mL Bottle Top Filter) fisherscientificFB12566508
fine brush, size 3/0princeton art & brush co.06435-1030
GlutaMaxGibco (Thermofisher)35050061
Lab wipes (Kim wipes) KIMTECH34155
N-2, 100xGibco (Thermofisher)17502048
Neurobasal-A Medium, minus phenol redGibco (Thermofisher)12349015
Normal Donkey SerumJackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. 017-000-121Gebruik bij 10% voor blocking en antilichaam incubatie
Penicillin-StreptomycinGibco (Thermofisher)15140122
Pipet Tips, 1000 µLTipOne1126-7810
Spring Scissors ('Cohan-Vannas')FST15000-11
Sterile water ('Dnase, Rnase free')Invitrogen10977-015
Sterile-filtered PBSGibco10010-023
Straight forceps ('mini')FST / Dumont11200-14
Transfer Pipet, 5.8 mLfisherscientific13-711-9AMMD
Triton X-100Thermo Scientific ChemicalsA16046.APGebruik bij 0,5% voor blocking en antilichaam incubatie

Referenties

  1. Quigley, H. A. Understanding glaucomatous optic neuropathy: the synergy between clinical observation and investigation. Annu Rev Vis Sci. 2, 235-254 (2016).
  2. Alqawlaq, S., Flanagan, J. G., Sivak, J. M. All roads lead to glaucoma: induced retinal injury cascades contribute to a common neurodegenerative outcome. Exp Eye Res. 183, 88-97 (2019).
  3. Tham, Y. C., et al. Global prevalence of glaucoma and projections of glaucoma burden through 2040: a systematic review and meta-analysis. Ophthalmology. 121 (11), 2081-2090 (2014).
  4. Margeta, M. A., et al. Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma. Immunity. 55 (9), 1627-1644 (2022).
  5. Vecino, E., Rodriguez, F. D., Ruzafa, N., Pereiro, X., Sharma, S. C. Glia-neuron interactions in the mammalian retina. Prog Retin Eye Res. 51, 1-40 (2016).
  6. Livne-Bar, I., et al. Astrocyte-derived lipoxins A4 and B4 promote neuroprotection from acute and chronic injury. J Clin Invest. 127 (12), 4403-4414 (2017).
  7. Liddelow, S. A., et al. Neurotoxic reactive astrocytes are induced by activated microglia. Nature. 541 (7638), 481-487 (2017).
  8. Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
  9. Verkhratsky, A., Nedergaard, M. Physiology of astroglia. Physiol Rev. 98 (1), 239-389 (2018).
  10. Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annu Rev Immunol. 35, 441-468 (2017).
  11. Tezel, G. Molecular regulation of neuroinflammation in glaucoma: current knowledge and the ongoing search for new treatment targets. Prog Retin Eye Res. 87, 100998(2022).
  12. Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (1), 207-216 (2010).
  13. Schlamp, C. L., Li, Y., Dietz, J. A., Janssen, K. T., Nickells, R. W. Progressive ganglion cell loss and optic nerve degeneration in DBA/2J mice is variable and asymmetric. BMC Neurosci. 7, 66(2006).
  14. Paschalis, E. I., et al. Permanent neuroglial remodeling of the retina following infiltration of CSF1R inhibition-resistant peripheral monocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (48), E11359-E11368 (2018).
  15. Rutigliani, C., et al. Widespread retina and optic nerve neuroinflammation in enucleated eyes from glaucoma patients. Acta Neuropathol Commun. 10 (1), 118(2022).
  16. Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
  17. Batiuk, M. Y., et al. An immunoaffinity-based method for isolating ultrapure adult astrocytes based on ATP1B2 targeting by the ACSA-2 antibody. J Biol Chem. 292 (21), 8874-8891 (2017).
  18. Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. An overview of in vitro methods to study microglia. Front Cell Neurosci. 12, 242(2018).
  19. Batiuk, M. Y., et al. Identification of region-specific astrocyte subtypes at single cell resolution. Nat Commun. 11 (1), 1220(2020).
  20. Cullen, P. F., Sun, D. Astrocytes of the eye and optic nerve: heterogeneous populations with unique functions mediate axonal resilience and vulnerability to glaucoma. Front Ophthalmol (Lausanne). 3, 1217137(2023).
  21. Cullen, P. F., Gammerdinger, W. J., Ho Sui, S. J., Mazumder, A. G., Sun, D. Transcriptional profiling of retinal astrocytes identifies a specific marker and points to functional specialization. Glia. 72 (9), 1604-1628 (2024).
  22. Cullen, P. F., Mazumder, A. G., Sun, D., Flanagan, J. G. Rapid isolation of intact retinal astrocytes: a novel approach. Acta Neuropathol Commun. 11 (1), 154(2023).
  23. Li, F., Jiang, D., Samuel, M. A. Microglia in the developing retina. Neural Dev. 14 (1), 12(2019).
  24. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  25. Wolfes, A. C., et al. A novel method for culturing stellate astrocytes reveals spatially distinct Ca2+ signaling and vesicle recycling in astrocytic processes. J Gen Physiol. 149 (1), 149-170 (2017).
  26. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  27. Tao, C., Zhang, X. Retinal proteoglycans act as cellular receptors for basement membrane assembly to control astrocyte migration and angiogenesis. Cell Rep. 17 (7), 1832-1842 (2016).
  28. Schaeffer, J., Delpech, C., Albert, F., Belin, S., Nawabi, H. Adult mouse retina explants: from ex vivo to in vivo model of central nervous system injuries. Front Mol Neurosci. 13, 599948(2020).
  29. Vagaja, N. N., et al. Changes in murine hyalocytes are valuable early indicators of ocular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (3), 1445-1451 (2012).
  30. Alarautalahti, V., et al. Viability of mouse retinal explant cultures assessed by preservation of functionality and morphology. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (6), 1914-1927 (2019).
  31. Rodrigues, E. B., et al. The use of vital dyes in ocular surgery. Surv Ophthalmol. 54 (5), 576-617 (2009).
  32. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  33. Antonetti, D. A., Silva, P. S., Stitt, A. W. Current understanding of the molecular and cellular pathology of diabetic retinopathy. Nat Rev Endocrinol. 17 (4), 195-206 (2021).
  34. Kinuthia, U. M., Wolf, A., Langmann, T. Microglia and inflammatory responses in diabetic retinopathy. Front Immunol. 11, 564077(2020).
  35. Reboussin, E., et al. Evaluation of neuroprotective and immunomodulatory properties of mesenchymal stem cells in an ex vivo retinal explant model. J Neuroinflammation. 19 (1), 63(2022).
  36. Do, M. T. H. Melanopsin and the intrinsically photosensitive retinal ganglion cells: biophysics to behavior. Neuron. 104 (2), 205-226 (2019).
  37. Yu, A., et al. Microglia target synaptic sites early during excitatory circuit disassembly in neurodegeneration. iScience. 28 (4), 112201(2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Retina explantmodelNeuro inflammatie GlaucoomRetinale GanglioncellenAstrocyten MicrogliaImmunofluorescentiemicroscopieIsolatie van Retinale CellenEx Vivo RetinaGFAP expressie
Een ex vivo explantatiemodel voor het bestuderen van gliale interacties in het netvlies van de muis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.