Een muismodel om de structurele en functionele resultaten op lange termijn te evalueren na de omkering van langdurige unilaterale ureterobstructie

Summary

Dit artikel bevat gedetailleerde instructies om onderzoekers in staat te stellen omkeerbare unilaterale ureterobstructie bij muizen uit te voeren met behulp van een gestandaardiseerd model dat analyse mogelijk maakt van de structurele en functionele resultaten op lange termijn na de omkering van langdurige ureterobstructie.

Abstract

Klinische behandeling van patiënten met urinewegobstructie (UTO) vereist vroege interventie om de oorzaak van de obstructie om te keren, maar desondanks lopen patiënten met langdurige UTO een verhoogd risico op chronische nierziekte (CKD) en recidiverend acuut nierletsel (AKI). Afgezien van een vroege omkering van de obstructie en generieke therapie om de progressie van CKD te vertragen, hebben geen therapieën de nierresultaten op de lange termijn significant verbeterd na de omkering van UTO. Om dit aan te pakken, hebben een aantal laboratoria modellen van omkeerbare UUO (R-UUO) ontwikkeld, maar deze zijn technisch uitdagend en zijn niet op grote schaal toegepast. Hoewel muismodellen van R-UUO aantrekkelijk zijn omdat ze kunnen worden gebruikt om de kracht van muizengenetica te benutten om de pathofysiologie van ziekten te bestuderen, waren deze bovendien bijzonder uitdagend omdat de gebruikte methoden vaak leiden tot onomkeerbare UUO als de obstructie >3 dagen aanhoudt. Bovendien hebben vanwege de aard van deze modellen maar weinig studies de functionele langetermijnresultaten van het omkeren van ureterobstructie geëvalueerd. Om dit aan te pakken, hebben we onlangs een muismodel van R-UUO met vertraagde contralaterale nefrectomie ontwikkeld dat de analyse mogelijk maakt van de langetermijneffecten van het omkeren van langdurige UTO op structurele en functionele resultaten van de nieren op de lange termijn. Deze studies tonen aan dat ondanks bijna volledig histologisch herstel 3 maanden na omkering, er een permanente vermindering van de nierfunctie was en een duidelijk en aanhoudend defect in het urineconcentratievermogen, wat wijst op een defect in de niermergfunctie. Het model vereist drie grote overlevingsoperaties, maar resulteert in een robuuste en reproduceerbare vermindering van de nierfunctie op lange termijn die kan worden gereproduceerd in verschillende muizenstammen door de periode van obstructie aan te passen. In dit artikel geven we gedetailleerde instructies voor het uitvoeren van deze operaties, het optimaliseren van de omstandigheden voor gebruik in verschillende muizenstammen, het evalueren van nierfunctionele resultaten en het oogsten van nierweefsel.

Introduction

Urinewegobstructie (UTO) kan unilateraal zijn, wat vaak asymptomatisch is, zich laat presenteert met chronische obstructieve uropathie¹, of acuut met nierkoliek en/of hematurie; acute pyelonefritis of postrenale acute nierbeschadiging (AKI)². De sleutel tot het beheer van UTO is het vroegtijdig omkeren van obstructie². Ondanks effectieve omkering en het gebruik van generieke therapieën om de progressie van chronische nierziekte (CKD) te vertragen, blijven getroffen patiënten echter een verhoogd risico lopen op progressieve CKD en hypertensie ^3,4. Bovendien is het urineconcentrerend vermogen (UCC) op lange termijn vaak aangetast⁵, wat vatbare patiënten vatbaar kan maken voor uitdroging en recidiverende AKI, waardoor de progressieve achteruitgang van de nierfunctie na UTO wordt versneld.

Voor een deel is dit falen om therapeutische benaderingen te identificeren om de langetermijnresultaten bij patiënten met UTO te verbeteren, het gevolg van onze afhankelijkheid van het gebruik van onomkeerbare unilaterale ureterische obstructie (UUO)-modellen om de pathobiologie van UTO te onderzoeken. Deze modellen repliceren echter niet de klinische situatie waarin patiënten kort na de diagnose een omkering ondergaan en kunnen niet worden gebruikt om de mechanismen en therapeutische benaderingen te onderzoeken die kunnen worden gebruikt om het herstel op lange termijn te verbeteren nadat de obstructie is omgekeerd. Om dit aan te pakken zijn omkeerbare UUO (R-UUO)-modellen ontwikkeld, maar deze zijn technisch uitdagender dan de onomkeerbare UUO-modellen, moeilijker te reproduceren door verschillende laboratoria en zijn als gevolg daarvan niet zo breed overgenomen door de wetenschappelijke gemeenschap. Muismodellen zijn aantrekkelijk omdat ze kunnen worden gebruikt om de kracht van muizengenetica te benutten om de pathofysiologie van ziekten te bestuderen, maar ze waren bijzonder uitdagend om te optimaliseren omdat de methoden vaak leiden tot onomkeerbare UUO als de obstructie langer dan 3 dagen aanhoudt⁶. Er zijn verschillende benaderingen ingezet om dit aan te pakken, waaronder multi-operatie, sequentiële plaatsing van klemmen langs de urineleider om de 2 dagen ^6,7; UUO gevolgd door reïmplantatie van de blaas 8,9,10,11; en gebruik niet-beschadigende klemmen en slangen om de urineleider te belemmeren 12,13,14. Langetermijnuitkomststudies bij ratten en muizen hebben een verbeterde nierfunctie, verminderde fibrose en/of glomerulaire beschadiging aangetoond na omkering van de obstructie, maar slechts gedeeltelijk herstel als UUO langer dan 2 dagen duurt 6,7,8,9,12,14,15,16,17,18,19 . Bovendien, hoewel het niermerg (RM) tot voor kort bijzonder gevoelig is voor schade veroorzaakt door UTO ^20,21, zijn er geen langetermijnstudies bij knaagdieren geweest waarin de effecten van langdurige R-UUO op de structuur en functie van RM zijn bestudeerd. Dit is belangrijk omdat UCC en het vermogen om zoutladingen uit te scheiden zonder de bloeddruk te verhogen (de zogenaamde druknatriurese-respons) afhankelijk zijn van het behoud van de anatomische integriteit van de RM ^22,23,24, zodat onvolledig herstel van de RM na omkering van UTO kan verklaren waarom patiënten een verhoogde vatbaarheid hebben voor recidiverende AKI en hypertensie na omkering van UTO. Veel van de technieken die nodig zijn om dit te evalueren, vereisen echter meerdere operatierondes (vijf grote operaties gedurende 6 dagen obstructie ^6,7), vereisen chirurgische expertise die moeilijk aan te leren is (bijv. chirurgische reïntegratie van de urineleider in de blaas ^8,9,10,11), en omdat obstructie eenzijdig is, is het voor onderzoekers een uitdaging om veranderingen in de nierfunctie te evalueren na omkering van de obstructie.

Om dit aan te pakken, hebben we een muismodel van R-UUO ontwikkeld dat relatief eenvoudig uit te voeren en aan te leren is, een beperkter aantal operaties vereist dan andere technieken (twee operaties voor 5 tot 7 dagen obstructie), en waarmee het herstel van nierfuncties kan worden geanalyseerd zonder de noodzaak van invasieve en/of dure onderzoeken naar gespleten nierfuncties²⁵. Hiervoor ondergaan muizen drie grote operaties: 1) plaatsing van een niet-traumatische vasculaire klem op de proximale linker urineleider; 2) verwijdering van de vaatklem 5 tot 7 dagen later, afhankelijk van de belasting van de muis; en 3) verwijdering van de contralaterale nier 10 dagen later om de nierfunctie te evalueren. Ongeveer 20 tot 40% van de muizen sterft binnen 2-3 dagen na de nefrectomie, wat aangeeft dat de UUO niet bij alle muizen omkeert. Langdurige follow-up van de overlevende muizen toont aan dat ondanks het bijna volledige histologische herstel van het niermerg (RM) 3 maanden na R-UUO. Er is sprake van een verminderde nierfunctie, gemeten aan de hand van de transdermale glomerulaire filtratiesnelheid (tGFR)²⁶. Bovendien is er een duidelijke vermindering van UCC, bepaald door het meten van de osmolaliteit van de urine na waterbeperking, wat suggereert dat er een permanent defect is in de RM-functie. Tijdverloopstudies tonen aan dat er weliswaar verbetering is in tGFR tussen dag 28 en 56 na RUUO, maar dat dit stabiliseert tussen dag 56 en 84. Daarentegen is er geen verbetering in UCC tussen dag 28 en 84 na R-UUO²⁵. Met behulp van scRNA-Seq van geïsoleerde RM's, gevalideerd door celafstamming en immunohistochemische studies, identificeerden we sterke regeneratieve responsen die de RM-dimensies herstelden na R-UUO, maar dat alle belangrijke cellulaire compartimenten in de RM permanente veranderingen in celaantallen en gensignaturen vertoonden die waarschijnlijk van invloed zijn op functioneel herstel na R-UUO. Dit omvatte aanhoudende pro-inflammatoire reacties in het RM-verzamelkanaal en de lus van Henle-celpopulaties 84 dagen na R-UUO, vergelijkbaar met de ontstekings- en senescentiesignaturen van mislukte reparatie proximale tubulaire epitheelcellen na AKI en UUO 27,28,29,30. Soortgelijke veranderingen werden ook gezien bij RM-verzamelkanalen van patiënten met recidiverende niersteenziekte³¹, wat suggereert dat er een gemeenschappelijke letselreactie is op RM-schade bij zowel mensen als muizen. In dit artikel geven we gedetailleerde instructies over hoe we deze operaties uitvoeren, hoe we de omstandigheden voor het gebruik ervan in verschillende muizenstammen optimaliseren, hoe we bepalen of de urineleider nog steeds geblokkeerd is na omkering, hoe we de belangrijkste functionele resultaten evalueren en hoe we nierweefsels oogsten om de niermergstructuren te beoordelen.

Protocol

Hier wordt het vierstappenprotocol beschreven dat wordt gebruikt voor langetermijnstudies (Figuur 1). Zoals besproken aan het einde van dit manuscript, kunnen onderzoekers ervoor kiezen om slechts drie van deze uit te voeren (secties 1, 2 en 4) of alle vier als ze geïnteresseerd zijn in het bestuderen van langetermijnresultaten. Alle muisexperimenten in dit manuscript zijn goedgekeurd door de Vanderbilt Institutional Animal Care and Use Committee en voldoen aan de richtlijnen voor diergebruik.

1. Plaatsing van de ureterklem (10 - 15 min/muis)

OPMERKING: Vertrouw op de kennis van de nieranatomie van de muis om de urineleider te lokaliseren, aangezien het niet mogelijk is om deze direct te zien zonder het omringende bindweefsel. De urineleider loopt langs het onderste achterste deel van het hilaire weefsel terwijl de nier wordt blootgesteld (Figuur 2). De keuze van de vaatklem is belangrijk. Deze kunnen duur zijn, maar kunnen meerdere keren worden schoongemaakt, geautoclaveerd en hergebruikt. Deze klemmen kunnen zonder problemen minstens 100 keer worden hergebruikt.

1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten vóór de operatie bij 121 °C gedurende 30 minuten. Als u operaties uitvoert op meerdere muizen, verwijder dan bloed en vuil van instrumenten tussen gebruik en steriliseer gedurende 10-15 s met behulp van de sterilisator met hete kralen. Laat de instrumenten afkoelen voordat u ze weer gebruikt.
2. Weeg de muis.
3. Verdoof de muis met 5-10 mg/kg xylazine met 90-120 mg/kg ketamine door middel van intraperitoneale injectie (zie materiaaltabel). Dit duurt meestal 3-5 minuten voordat het effect heeft.
4. Dien preoperatieve analgesie toe als u een ander anestheticum gebruikt, zoals isofluraan, omdat dit, in tegenstelling tot Xylazine, geen pijnstillende effecten heeft.
5. Scheer de operatieplaats van de heupen tot de ribbenkast en langs de zijkant, met voldoende rand om te voorkomen dat het haar de incisieplaats besmet. Voer uit in een voorbereidend gebied, niet waar de operatie wordt uitgevoerd.
6. Bedek het verwarmde operatieveld met een steriel chirurgisch laken. Het helpt voorkomen dat verdwaalde haren het operatieveld binnendringen en biedt een ruimte om steriele instrumenten te leggen.
7. Breng oogheelkundige smeerzalf aan op de ogen.
8. Breng aseptisch prep aan met behulp van met betadine doordrenkt gaasje: schrob 3 tot 4 keer vanuit het midden van de site naar de periferie, elke keer gevolgd door één keer afvegen met een alcoholdoekje. Verwijder alle betadine uit het operatieveld voorafgaand aan de incisie.
9. Maak met een schaar en een tang een dorsale incisie van 1,5 cm in de lengterichting door de huid en de onderhuidse lagen.
10. Maak een kleine incisie door de linkerflankspier en fascia boven de nier en exteterrariseer de linkernier.
11. Ontleed voorzichtig het vet van de onderpool en een deel van het bindweefsel rond de plek waar de urineleider zou moeten zijn. Het is niet mogelijk om de urineleider direct te zien zonder het omliggende bindweefsel. Scheid vervolgens de urineleider met het omliggende bindweefsel van de niersteel, die de nierader en slagader bevat, zodat de niersteel niet wordt meegeleverd met de ureterklem (Figuur 2).
12. Gebruik de klemappliers om hem te openen en plaats hem op de urineleider direct onder het bekken. Gebruik de markeringen op de vasculaire klem om ervoor te zorgen dat ze voor elke muis met dezelfde druk op de urineleider worden geplaatst (Figuur 3). Niet aanbrengen en vervolgens de klem verwijderen om te verplaatsen, omdat dit de urineleider kan beschadigen.
13. Nadat de klem is geplaatst, duwt u de nier voorzichtig met de klem terug in de retroperitoneale ruimte met behulp van een met zoutoplossing doordrenkt steriel wattenstaafje.
14. Sluit de spierlaag af met behulp van een resorbeerbare hechtdraad.
15. Sluit de huidlaag af met behulp van huidclips.
16. Dien Buprenorfine 3,25 mg/kg analgesie toe, zoals beschreven in de rubriek geneesmiddelen, en dien 0,5 ml steriele normale zoutoplossing subcutaan toe om de muizen te hydrateren.
17. Laat de muis op het verwarmde operatieveld van het harde kussen liggen of breng hem over naar zijn thuiskooi met een verwarmd isotherm kussen onder de helft van de kooi totdat de muis wakker wordt.
18. Breng de muis terug naar de dierenkamer.
19. Houd de muis nauwlettend in de gaten en geef gedurende 48 tot 72 uur extra doses buprenorfine bij pijn of ongemak. Klinische tekenen van pijn en angst die erop wijzen dat de muizen extra analgesie nodig hebben, zijn onder meer depressie of andere gedragsveranderingen, abnormaal uiterlijk of houdingen zoals pilo-erectie, gebogen houding, gebrek aan verzorging en eten, of immobiliteit.

2. Verwijderen van de ureterklem (10 - 15 min/muis)

1. Volg de stappen 1.1-1.10 van de klemplaatsingsprocedure met behulp van de originele huid- en spierincisies om te beginnen met het verwijderen van de klem. Verwijder de wondclips voordat u het operatiegebied schoonmaakt. Opnieuw scheren is meestal niet nodig omdat het haar niet is teruggegroeid.
2. Vanwege ontwikkelde weefselverklevingen, gebruik een tang om de klem voorzichtig in de retroperitoneale ruimte te lokaliseren zonder eerst de nier te exterioriseren. Gebruik de klemappliers om de klem voorzichtig te openen terwijl u de tang gebruikt om het weefsel rond de klemkop naar beneden te trekken om de klem te verwijderen.
3. Exteïriseer nu de nier zodat het nierbekken kan worden gevisualiseerd om obstructie vast te stellen. Het nierbekken moet gezwollen zijn, wat wijst op hydronefrose.
4. Zodra de nier is geïnspecteerd, duwt u de nier voorzichtig terug in de retroperitoneale ruimte met behulp van een met zoutoplossing doordrenkt steriel wattenstaafje.
5. Volg de stappen 1.13-1.18, zoals hierboven beschreven.

3. Contralaterale nefrectomie (10 - 15 min/muis)

1. Scheer het gebied als er haargroei is.
2. Gebruik 1-5% isofluraan/luchtmengsel voor anesthesie om een gemakkelijker herstel mogelijk te maken als gevolg van eerdere anesthesie. Verwijder de wondklemmen voordat u het operatiegebied schoonmaakt.
3. Dien buprenorfine-analgesie preoperatief toe (zie tabel met materialen).
4. Volg procedurestappen 1.1-1.9 met behulp van de originele huidincisie om te beginnen.
5. Maak een kleine incisie door de rechterflankspier en fascia boven de nier en exteïriseer de rechternier.
6. Houd de nier voorzichtig vast met een gladde, gebogen tang en ontleed voorzichtig de bovenste en onderste pool van de nier vrij van het omliggende weefsel.
   OPMERKING: Weefsel rond de bovenpool bevat de bijnier, die zijn eigen bloedtoevoer draagt, die van de nier kan worden getrokken, maar uiteraard niet van de muis mag worden verwijderd (zie afbeelding 2).
7. Nadat u de nier hebt bevrijd van het omliggende weefsel, bindt u de 4-0 zijden hechtdraad volledig rond de niervaten en urineleider met behulp van een dubbele chirurgische knoop. Als je ~30 s blijft staan, wordt de nier donker. Houd de nier vast met een gladde, gebogen tang en verwijder de nier door distaal naar de knoop te knippen met een gebogen schaar.
8. Duw de resterende niersteel voorzichtig terug in de retroperitoneale ruimte met behulp van een met zoutoplossing doordrenkt steriel wattenstaafje.
9. Volg de stappen 1.13-1.18, zoals hierboven beschreven.

4. Weefselafname

1. Verdoving met 5% isofluraan/luchtmengsel om een stabiel vlak van chirurgische anesthesie te bereiken voorafgaand aan de terminale procedure.
2. Open de buikholte om de linkernier bloot te leggen
3. Inspecteer de nier om eventuele zwelling van het nierbekken te zien (zie stap 2.3).
4. Als het erop lijkt dat het nierbekken nog steeds gezwollen is, breng dan een vlindernaald met een kleine dikte in die is aangesloten op een spuit met 0,5 ml van een verdunning van 1:5000 methyleenblauw in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Als de urineleider patent heeft, zal de blauwe oplossing zichtbaar zijn als deze van het nierbekken naar de blaas gaat. Als dit niet het geval is, zal het nierbekken opzwellen met blauwe oplossing en zal het niet in de blaas verschijnen.
5. Om de nieren te perfusie te fixeren, opent u de borstholte en legt u het hart bloot.
   1. Terwijl het hart nog klopt, steekt u een vlindernaald van 23-25 G in de linkerhartkamer, start u een infusie met normale zoutoplossing en snijdt u het rechteratrium of ventrikel door om het bloedvolume te vervangen door zoutoplossing.
   2. Zorg er na ongeveer een minuut voor dat de nieren wit zijn. Ga nog een minuut door met de infusie met zoutoplossing of verwissel deze met een infusie van 10% formalineoplossing gedurende nog eens 1-2 minuten om de weefsels te fixeren.
   3. Op dit punt is de muis dood; Oogst de weefsels. Als de weefsels worden verzameld voor RNA- of eiwitstudies, fixeer ze dan niet door perfusie.
6. Na verwijdering van de nieren van het dier (of ze nu gefixeerd zijn of niet), gebruik een scheermesje om tot drie 2-3 mm dikke sagittale plakjes door het midden van de nier te snijden (Figuur 4). Dit geeft representatieve secties die het niermerg en de cortex omvatten en biedt voldoende weefsel voor histologie-, eiwit- of RNA-testen.
7. Ga verder met het repareren/bevriezen van monsters volgens de onderzoeksvereisten.

Results

Voor langetermijnstudies evalueren we over het algemeen de nierfunctie door sequentiële bloedureumstikstof (BUN) en transdermale glomerulaire filtratiesnelheden (tGFR) te meten bij bewuste muizen (zie een eerder gepubliceerd artikel dat dit²⁶ beschrijft), naast het meten van het urineconcentratievermogen (UCC) door de urine-osmolariteit te evalueren van spoturinemonsters die zijn verzameld na 18 uur watertekort. Hoewel we altijd BUN-onderzoeken uitvoeren, zijn dez...

Discussion

Vergeleken met sommige van de benaderingen die zijn gebruikt om omkering van langdurige UUO bij muizen te bestuderen^{6,7,8,9,10,11,12,13,14}, is het hier beschreven protocol relatief eenvoud...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride	VUMC apotheek	meerdere
Absorbable suture Vicryl 6-0	Med Vet International- ETHICON	J492G
Alcohol Swabs	BD Merk Isopropyl Alcohol Swabs	BD 326895
Betadine oplossing	Hanna Pharmaceutical Supply Co., Inc	67618015017
Klemapplicerende pincet: S&T CAF-4	Fine Science Tools	00071-14
Deltaphase Isothermische Pad	Braintree Scientific	DPIP
Elektrische trimmer	Oster	meerdere
ENCORE Latex Textured Chirurgische Handschoenen	Ansell	5785003
Ethiqa XR Buprofenor (CIII) VI 1.3 mg/mL	Patterson Veterinary- Ethiqa	86084010030
EZ Clip 9 mm	Braintree Scientific	EZC-CS	of 7 mm
EZ Clip applier 9 mm	Braintree Scientific	EZC-APL	of 7 mm
EZ Clip verwijderaar 9 mm	Braintree Scientific	EZC-RMV	of 7 mm
Gaas 2 ' 2	Fisher Scientific	22-362178
Graefe hoekige of gebogen gekartelde punt	Fine Science Tools	11049-10
Graefe rechte gekartelde punt	Fine Science Tools	11050-10
Verwarmde harde pad 15 ' 24	Braintree Scientific	HHP 2
Verwarmde harde pad pompconnectoren	Braintree Scientific	HHP Gaymar connector
Hete parel sterilisator	Fine Science Tools	18000-45
Insulinspuit 0,5 mL 29 G	Exel International	26028
Isoflurane	Patterson Veterinary- Pivetal	78949580
Ketamine 100 mg/mL	VUMC apotheek
Niet-absorbeerbare hechtdraad Zijde 4-0	Med Vet International- ETHICON	683G
Olsen Hegar naaldhouder: met draadsnijder	Fine Science Tools	12002-12
Optixcare Eye Lube 20 g	Med Vet International	PHOPTIXCARE
Schaar-Blunt Lexer-Baby	Fine Science Tools	14078-10
Schaar-Sharp gebogen	Fine Science Tools	14005-12
Steriele katoenen applicators	Puritan	25806 2WC
Steriele gaas 4 ' 4	Fisher Scientific	22-415-469
Steriele chirurgische wegwerpdoek 18 ' 26	Med Vet International	20001
Sterilisatie instrument zak 5 ' 10	Fisher Scientific	01-812-54
T/pomp verwarmingskoelpomp	Braintree Scientific	TP-700
Taylor pincet gebogen, glad	Fine Science Tools	11017-17
Vasculair klem: S&T 5 tot 15 g druk	Fine Science Tools	00396-01
Xylazin 100 mg/mL	Patterson Veterinary- Cronus	CR04305