High-density Multielectrode Array Opnames van retinale golven met behulp van een elektrofysiologisch platform

Summary

High-density multi-elektrode arrays (HD-MEA's) worden gebruikt om spontane retinale golven te bestuderen, die een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van neurale circuits. Dit protocol schetst de stappen voor het voorbereiden van retinaal weefsel van muizen en het uitvoeren van elektrofysiologische opnames met behulp van HD-MEA's op een elektrofysiologisch platform.

Abstract

Spontane retinale golven zijn een kenmerk van de activiteit van het retinale netwerk tijdens de ontwikkeling en spelen een cruciale rol bij de vorming van het visuele systeem door de verfijning van axonen, de permeabiliteit van het vaatstelsel en de algehele rijping van neurale circuits te beïnvloeden. Deze golven worden gewoonlijk bestudeerd in ex vivo retinale preparaten met behulp van multi-elektrode-arrays (MEA's), die elektrofysiologische opnames mogelijk maken van grote populaties van retinale ganglioncelactiviteit (RGC). Op MEA gebaseerde elektrofysiologie is een krachtig hulpmiddel geworden vanwege het gebruiksgemak om snel gegevens met een hoge doorvoer te verzamelen, waardoor het bij uitstek geschikt is om de activiteit van het netvlies in verschillende experimentele omstandigheden te bestuderen.

In dit protocol schetsen we de cruciale stappen voor het voorbereiden van netvliesweefsel op het verkrijgen van elektrofysiologische gegevens met behulp van een High-Density MEA (HD-MEA) op een elektrofysiologisch platform. Het proces begint met de zorgvuldige isolatie van intacte netvliezen van neonatale dieren onder fysiologische omstandigheden. Eenmaal voorbereid, wordt het netvlies zorgvuldig gemonteerd op een HD-MEA-chip, die bestaat uit een raster van 26.400 elektroden die in staat zijn om gelijktijdige extracellulaire opnames uit te voeren van ten minste 1.000 RGC's. Opnames kunnen tot enkele uren duren. Uiteindelijk biedt deze methodologische benadering waardevolle toepassingen bij het onderzoeken van de ontwikkeling van het netvlies, ziekten en mogelijk soortoverschrijdende vergelijkende studies, wat bijdraagt aan bredere vooruitgang in neurowetenschappen en visieonderzoek.

Introduction

Spontane retinale golven zijn periodieke uitbarstingen van gecorreleerde activiteit die worden waargenomen in het zich ontwikkelende netvlies vóór het begin van het gezichtsvermogen. Bij muizen veranderen de circuits die retinale golven initiëren en voortplanten snel tijdens de ontwikkeling, beginnend embryonaal en eindigend bij het openen van de ogen (postnatale dag 14)¹. Naarmate retinale circuits zich ontwikkelen, veranderen de spatiotemporele eigenschappen van retinale golven drastisch ^2,3. Verschillende studies ondersteunen dat die specifieke spatiotemporele eigenschappen de ontwikkeling van het visuele systeem instrueren: asynchrone activiteit tussen de ogen instrueert oogspecifieke segregatie⁴, de grootte van het golfgebied instrueert de verfijning van retinotopische axonen in binoculaire hersengebieden ^5,6, en de voortplantingsrichting van golven is geïmpliceerd om de richtingsselectiviteitscircuits in de superieure colliculus te instrueren³. Naast neurale circuits zijn retinale golven verantwoordelijk voor de ontwikkeling van de permeabiliteit van het bloedvaatstelsel⁷. Bovendien werd ontdekt dat de stadium II retinale golven de uitgroei van receptieve veldgebieden beheersen en stabiliseren in retinale ganglioncellen (RGC's)⁸. Cruciaal is dat afwijkende retinale golven tijdens de ontwikkeling de basis kunnen zijn van verschillende neurologische ontwikkelingsstoornissen, en inderdaad, retinale golven zijn abnormaal in een muismodel van congenitale nystagmus³. Gezien hun cruciale rol in de vroege ontwikkeling van het visuele systeem en de implicaties voor ziekte, is het nodig om de spatiotemporele dynamiek van retinale golven op elke leeftijd en in elk diermodel vast te leggen.

Er zijn verschillende methoden naar voren gekomen om retinale golven te bestuderen. Zowel eencellige elektrofysiologie ^9,10 als calciumbeeldvorming 11,12,13,14,15 hebben geleid tot baanbrekende bevindingen over circuits en de functie van retinale golven. Hier richten we ons op multi-elektrode array-opnames (MEA), een methode die wordt gebruikt sinds het vroege onderzoek van retinale golven¹⁶ en die^{als techniek 2} is blijven verbeteren. MEA's maken gelijktijdige extracellulaire registratie van actiepotentialen van honderden tot duizenden RGC's mogelijk, waardoor onderzoekers de initiatie, voortplanting en beëindiging van golven kunnen volgen, vergelijkbaar met wat mogelijk is met calciumbeeldvorming. Aangezien MEA's het actiepotentieel van RGC's rechtstreeks registreren, kunnen MEA's worden gebruikt om verschillende genetische muismodellen of niet-modelorganismen te bestuderen zonder de extra complicatie van de introductie van een calciumindicator. Weefsel kan ook direct in de MEA worden gekweekt, waardoor zeer lange registratietijden mogelijk zijn. MEA's zijn ook zeer schaalbaar, met de huidige producten die tot zes actieve MEA's tegelijk mogelijk maken, wat een snelle beoordeling van het netvlies mogelijk zou kunnen maken en de ontdekking van geneesmiddelen zou kunnen katalyseren. Misschien wel de grootste kracht van MEA's is hun vermogen om veel cellen te bemonsteren met een hoge bemonsteringssnelheid, waardoor laboratoria over de hele wereld snel rijke datasets kunnen verkrijgen, maar expertise in nabewerking vereist is.

Het primaire doel van dit protocol is om een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol te bieden voor het voorbereiden van netvliesweefsel en het uitvoeren van elektrofysiologische opnames met behulp van een single-well High-density MEA (HD-MEA)-systeem om spontane retinale golven ex vivo te bestuderen. Deze methode zorgt voor een hoge doorvoer en langdurige gegevensverzameling, waardoor het geschikt is voor een breed scala aan ontwikkelings- en ziektegerelateerde studies. Het nieuwe geavanceerde CMOS-gebaseerde HD-MEA-systeem, dat >1.000 elektrodeplaatsen tegelijk mogelijk maakt, biedt verschillende voordelen ten opzichte van traditionele elektrofysiologische benaderingen. De elektrode-array met hoge dichtheid (26.400 elektroden) maakt nauwkeurige, gelijktijdige extracellulaire opnames mogelijk van maximaal 1.012 RGC's, waardoor fijnschalige ruimtelijke activiteitspatronen worden vastgelegd. Het ontwerp met één putje zorgt voor uniforme opnameomstandigheden¹⁷. Bovendien maakt dit systeem langdurige opnames van enkele uren mogelijk, waardoor het mogelijk wordt om de golfdynamiek onder verschillende fysiologische en farmacologische omstandigheden te bestuderen zonder significante signaaldegradatie¹⁸. Door een protocol aan te bieden, wil deze studie HD-MEA-technologie toegankelijk maken voor een breder publiek van onderzoekers in de neurowetenschappen, oogheelkunde en visiewetenschappen. Deze methode is een belangrijke stap voorwaarts in de studie van retinale golven en biedt nieuwe wegen om de vroege ontwikkeling van het visuele systeem, ziektemechanismen en mogelijke therapeutische interventies te bestuderen.

Protocol

Dit protocol schetst de stappen voor het isoleren en voorbereiden van netvliesweefsel van neonatale muizen voor MEA-opnames van netvliesgolven met behulp van het Maxwell Biosystems HD-MEA-platform. De procedure is ontworpen om fysiologische omstandigheden te behouden, zodat het netvliesweefsel structureel intact blijft, vrij van schade en goed voorbereid is op optimaal elektrodecontact. Deze experimenten werden goedgekeurd door het Vanderbilt Animal Care and Use Program, onder protocolnummer M2200056-00. De muizen (1-2 weken oud, beide geslachten) werden gehuisvest in een 12 uur durende dag/nachtcyclus vivarium en kregen een regelmatig chow-dieet.

1. Voorbereiding van netvliesweefsel

1. Isolatie van het netvlies
   NOTITIE: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over de materialen, apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt (zie ook afbeelding 1).
   1. Bereid de werkruimte voor
      1. Bereid kunstmatig hersenvocht (aCSF): 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH₂PO₄, 26 mM NaHCO₃, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM glucose, geborreld met carbogene: 95% O₂/5% CO₂ (pH 7,4, osmolariteit 290 ± 10 mOsm) en bewaar het bij 5 °C. Houd de aCSF 10 minuten op ijs terwijl deze van zuurstof wordt voorzien voordat u deze dissectie uitvoert.
         OPMERKING: De CaCl₂ moet als laatste worden toegevoegd, nadat de oplossing 10 minuten met carbogen is geborreld.
      2. Begin met oxygenatie van verse, ijskoude aCSF (gedurende ten minste 10 minuten).
      3. Stel dissectiehulpmiddelen en microscoop in.
   2. Euthanaseer het dier volgens de richtlijnen van de instelling.
   3. Reinig de ogen met behulp van een gebogen veerschaar-
      1. Aangezien postnatale pups gesloten ogen hebben tot P11-13 (bij muizen) en de oogleden voorzichtig moeten worden geopend, gebruikt u een microtang om de oogleden vast te pakken en een veerschaar om ze te verwijderen. Haal de ogen voorzichtig uit met een veerschaar en vermijd oogbeschadiging.
      2. Snijd de oogzenuw door en plaats de ogen in zuurstofrijk aCSF. Gebruik een transferpipet om het oog voorzichtig tussen de petrischaaltjes te bewegen.
         OPMERKING: Ververs voor de rest van het dissectieprotocol elke 10 minuten met zuurstofrijk aCSF.
   4. Onder een dissectiemicroscoop,
      1. Maak een kleine incisie in het hoornvlies met een naald terwijl u het oog stabiliseert met een tang.
      2. Ontleed het hoornvlies botweg door voorzichtig langs de sclerale omtrek te scheuren.
      3. Verwijder de iris en lens. Als het netvlies bij jonge dieren aan de lens is bevestigd, verwijder deze dan voorzichtig met een tang.
         OPMERKING: Bij jonge dieren zit het netvlies soms vast aan de lens. Gebruik de tang om de lens voorzichtig van het netvlies te trekken, waarbij een tang om aan de lens te trekken en de andere op de buitenranden van het netvlies rust om het netvlies op zijn plaats te houden terwijl de lens wordt verwijderd.
   5. Oriënteer het netvlies.
      1. Identificeer de ventrale zijde met behulp van het vaatvliesweefsel (zie Sondereker et ^al.19 voor een gedetailleerd protocol over oriëntatie) en plaats het naar de onderzoeker gericht met de RGC-laag naar boven.
      2. Gebruik een gebogen scalpel om een referentiesnede te maken 45° tegen de klok in ten opzichte van de ventrale as.
      3. Scheid met een fijne tang voorzichtig het netvlies van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) en de sclera.
         OPMERKING: Bij jongere muizen pelt de RPE gemakkelijk van het netvlies. Bij oudere muizen is de RPE meer gehecht aan het netvlies. Als de RPE na het verwijderen van het grootste deel van het netvlies nog steeds via de oogzenuw aan het netvlies is verankerd, gebruik dan een veerschaar om die verbinding te verbreken. Dit voorkomt schade aan het netvliesweefsel in de buurt van de oogzenuw.
   6. Neonatale netvliezen hebben bijna geen glasvocht, maar oudere netvliezen wel (verschijnt als een bruin filament langs de rand van het netvlies, maar de vezels verbinden zich ook met elkaar in het glasvocht). Verwijder met de fijne tang het glasvocht dat boven de RGC-laag ligt.
      OPMERKING: Deze vezelachtige laag komt soms los wanneer de lens wordt verwijderd. Als dit niet het geval is, is het belangrijk om er zoveel mogelijk van te verwijderen, anders voorkomt het een goed contact van RGC's met elektroden.
   7. Maak met een scalpel vier reliëfsneden om het netvlies plat in de schaal te laten liggen. Om de oriëntatie later te kennen en te behouden, snijdt u de twee hoeken van het ventrale kwadrant af met een scalpel.

2. Montage van het netvlies op de MEA-chip

1. Montage van het netvlies-
   1. Breng het netvlies voorzichtig over van de petrischaal naar de MEA-chip met behulp van de transferpipet waarvan de punt is afgesneden. Zorg ervoor dat er voldoende aCSF in de chip zit om de bodem van de put te bedekken.
   2. Gebruik de enkelhaarborstel om het netvlies voorzichtig te manoeuvreren om boven de elektroden te worden geplaatst, waarbij de RGC-laag naar de elektroden is gericht.
   3. Gebruik de pipet van 10 μL om voorzichtig extra aCSF rond het netvliesweefsel te verwijderen. Kantel de chip schuin om extra aCSF kwijt te raken.
      NOTITIE: Raak de elektroden of amplifiers nooit aan met de pipetpunt. Naarmate aCSF wordt verwijderd, zal het netvlies meer plat worden. Als een deel van het netvlies onder zichzelf is gevouwen, gebruik dan de enkelvoudige haarborstel om voorzichtig onder het gewenste blad te scheppen om het uit te vouwen. Om te voorkomen dat het netvlies beweegt tijdens het uitvouwen van een deel van de blaadjes, kan een tweede enkelvoudige haarborstel worden gebruikt om zachte druk uit te oefenen in het midden van het netvlies, waar de optische zenuw verbinding maakt.
   4. Droog de put zoveel mogelijk door de spaan in een hoek van 45° te kantelen en het laatste deel van de aCSF te verwijderen dat zich in het gekantelde deel van de spaan verzamelt.
      OPMERKING: Hierdoor wordt de verbinding tussen het netvlies en de elektroden vergroot.
   5. Gebruik filterpapier om de randen van het netvlies voorzichtig te deppen en te drogen. Plaats de MEA-chip in een opnamekamer.
2. Verbetering van het elektrodecontact
   1. Gebruik een vervangbaar inzetstuk voor tissuehouders om het netvlies voorzichtig op de elektroden te duwen, voor een optimaal contact en een betere signaal-ruisverhouding.
      NOTITIE: Het inzetstuk van de tissuehouder mag niet meer worden neergelaten zodra het in contact komt met het netvlies (een duidelijke "natte plek" zal zichtbaar zijn op het contactpunt). Verder verlagen van de elektrodehouder kan het weefsel van het netvlies beschadigen. Ga snel over van stap 2.1.4 naar 2.2.1 om de duur te minimaliseren dat het netvlies zonder zuurstofrijke aCSF blijft; Deze stap is van cruciaal belang en moet zo snel mogelijk worden voltooid. Het is belangrijk om snel te handelen bij het afvlakken van het netvlies op de chip, maar het is ook belangrijk dat het grootste deel van de aCSF van de dissectie wordt uitgedroogd, zodat het netvlies goed contact maakt met de elektrode. Als u te snel gaat om het netvlies onder oxygenatie te krijgen, loopt u het risico geen goed contact te hebben met opname-elektroden, en als u te langzaam gaat, loopt u het risico dat netvliescellen hypoxisch worden en afsterven. We vinden dat 30-60 s leidt tot goed contact en een gezond netvlies (d.w.z. we observeren typische retinale golven).
   2. Gebruik het perfusiesysteem waarnaar wordt verwezen en begin de MEA-chip goed te vullen met zuurstofrijk aCSF met een debiet van 2 ml/min.
      OPMERKING: Een open perfusiesysteem wordt aanbevolen, omdat de elektrische ruis laag blijft en het zorgt voor verse aCSF naar het netvlies. Zorg ervoor dat er een in-line verwarmingssysteem is aangesloten op de perfusie-opstelling om de aCSF op te warmen tot fysiologische omstandigheden.
   3. Zet de in-line verwarming van het perfusiesysteem aan om de aCSF op te warmen tot 32-34 °C.

3. Elektrofysiologische opnames

1. Extracellulaire opnames-
   1. Schakel het opnamesysteem in.
   2. Dubbelklik op de acquisitiecomputer eerst op het pictogram Server en vervolgens op Scope om deze te openen.
   3. Klik op het pictogram Initialiseren in de Scope-interface en voer de MEA-chip-ID in om extracellulaire opnamen te starten met behulp van het MEA-systeem.
   4. Klik op het pictogram Verschuiving in de interface van het bereik om de verschuiving in te stellen.
   5. Pas de versterkings- en filterinstellingen aan om de signaaldetectie te optimaliseren. Gebruik de standaardinstellingen van 512 gain en een highpass van 300 Hz; stel de bemonsteringsfrequentie in op 20 kHz.
   6. Selecteer de juiste opnameconfiguratie. Het totale actieve gebied dat kan worden bemonsterd is 3,85 x 2,1 mm². Met de software kunnen gebruikers kiezen hoe ze de elektrodeafstand willen configureren; Om dit protocol te volgen, gebruikt u de standaardinstelling die de opname-elektroden gelijkmatig over het maximale actieve gebied verspreidt, aangezien dit over een zo groot mogelijk deel van het netvlies wordt bemonsterd. Dit leidt tot een afstand van 87,5 μm per opname-elektrode.
   7. Laat het netvlies 60 minuten acclimatiseren aan de opnamekamer.
   8. Begin met spontane activiteitsregistraties van RGC's door naar het tabblad Analyse te navigeren en het pictogram Nieuwe test maken te selecteren. Kies het type netwerktest , wijs een geschikte bestandsnaam toe en klik op OK om de configuratie op te slaan. Stel de gewenste duur voor de opname in door de parameter Opnametijd (sec) aan te passen. Schakel de optie Alleen piek in om u te concentreren op piekgegevens en klik vervolgens op het pictogram Test uitvoeren om de opnamesessie te starten.
      OPMERKING: Voor opnames van retinale golven van 10 minuten en langer raden we aan om de instelling voor alleen spikes te gebruiken, die alleen de tijdstempels van actiepotentialen opslaat met behulp van een ingebouwde spike-detectietool in plaats van het volledige ruwe elektrofysiologische spoor per kanaal. Dit komt omdat langdurige opnames (>10 minuten) over 1.024 kanalen gemakkelijk kunnen resulteren in gegevensbestanden ter grootte van TB die technisch uitdagend zijn om te analyseren en de voortgang van het onderzoek drastisch vertragen. We hebben bevestigd dat ruwe gegevens met behulp van piektijden alleen de bekende spatiotemporele eigenschappen van retinale golven repliceren: voor fase II-golven nemen we grote golven waar die het grootste deel van het netvlies bedekken en voorkomen op frequenties die overeenkomen met eerdere rapporten (zie figuur 2). We merken wel op dat als het onderzoeksproject een meer diepgaande analyse van spike-golfvormen vereist, het vastleggen van het ruwe elektrofysiologische spoor een noodzaak is.
   9. Controleer regelmatig de lopende registratie om ervoor te zorgen dat de gegevensverzameling verloopt zoals verwacht en dat het systeem goed functioneert.

4. Opruimprocedure

1. Zodra de registratie is voltooid en de gegevens zijn opgeslagen, schakelt u de inline-verwarming uit en schakelt u vervolgens het perfusiesysteem uit.
2. Verwijder voorzichtig het inzetstuk van de tissuehouder en verwijder de MEA-chip. Reinig de chip door deze eerst te spoelen met 70% ethanol, gevolgd door gedeïoniseerd (DI) water.
3. Om verstopping van de slang te voorkomen, spoelt u het perfusiesysteem gedurende 15 minuten met DI-water.

Results

High-throughput opnames en analyse van retinale golven met HD-MEA's
We voerden een HD-MEA-opname van een uur uit van spontane retinale golven (Figuur 2). Een rasterplot van neuronale activiteit toont het gestructureerde patroon van retinale golven, waarbij elke stip een gedetecteerde actiepotentiaal van een individuele elektrode vertegenwoordigt (Figuur 2A, onder). Het optellen van de activit...

Discussion

Het hier beschreven protocol biedt een reproduceerbare en high-throughput methode voor het voorbereiden van netvliesweefsel en het uitvoeren van HD-MEA-opnames, en biedt een robuuste methode om de activiteit van het netvliesnetwerk te bestuderen. HD-MEA-technologie biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van traditionele elektrofysiologische en beeldvormingstechnieken, met name bij het vastleggen van gegevens met een hoge doorvoer. HD-MEA levert real-time nauwkeurigheidsopnames op mill...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mL disposable transfer pipette (with end cut off)	Fisherbarnd	13-711-9CM	Assists in moving retina between petri dishes.
Kunstmatige hersenvocht (aCSF)			Behoudt fysiologische omstandigheden voor retinal weefsel; bestaat uit NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, CaCl2, MgCl2, glucose, en bellen met carbogen.
CaCl2	Fisher Chemicals	C79-500	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
Carbogenvoorraad (95% O2, 5% CO2)			Wordt gebruikt om aCSF te zuurstofrijk maken en de levensvatbaarheid van weefsel te behouden.
Gebogen lemmetmes (#10)	Integra	4-110	Wordt gebruikt om weefsel met precisie te snijden.
Dissectiemicroscoop (stereoscoop)	Zeiss	Stemi 508	Onmisbaar voor het visualiseren en hanteren van retinal weefsel.
glucose	Fisher Chemicals	BP350-1	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
Inline verwarming	Multichannel System	TC02	Verwarmt aCSF tot 32-34°C voor optimale omstandigheden.
Ismatec Perfusiesysteem	Ismatec	ISM4208	Onderhoudt een continue stroom van zuurstofrijk aCSF.
KCl	Fisher Chemicals	P271-500	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
KH2PO4	Sigma Aldrich	P5504-100g	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
MaxOne Opname-eenheid	Maxwell Biosystems	MX1-BRD	Interface tussen MaxOne Chip en Systeem
MaxOne Systeem	Maxwell Biosystems	MX1-SYS	Kernsysteem voor MEA-gebaseerde elektrofysiologische opnames.
MaxOne Weefselhouder met een 3-assige micromanipulator en verwisselbare inzetstukken	Maxwell Biosystems	MX1-HLD	Zorgt voor nauwkeurige plaatsing van de retina op de MEA-chip.
MEA-chip (MX1-S-CHP, MaxWell Biosystems)	Maxwell Biosystems	MX1-S-CHP	Micro-elektrode array met hoge dichtheid voor het opnemen van neuronale activiteit.
MgCl2	Fisher Chemicals	M33-500	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
NaCl	Fisher Chemicals	S271-1	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
NaHCO3	Fisher Chemicals	S233-500	Om kunstmatig hersenvocht (aCSF) te bereiden
Naald (30 G x ½)	BD Biosciences	305106	Helpt bij het maken van incisies in het hoornvlies.
Neonatale dieren (P1-P14; muis)			Modelorganismen zoals muizen, ratten of anderen gebruikt voor retinale studies.
PC met MaxLab Live Scope-software	HP	Z4	Wordt gebruikt voor gegevensverwerving en analyse van opnames.
Petrischaal (35 mm of 60 mm)	Pyrex	3483E12	Gebazig als werkruimte voor dissectie.
Roboz micro Adson-forceps (RS-5232, 4.75” lang, 1 x 2 tanden, 0.5 mm punt)	Roboz	RS-5232	Gespecialiseerde forceps voor fijne dissectie.
Roboz veerschaar (RS-5671, 10 mm snijrand, 0.15 mm puntbreedte, 3¾" totale lengte)	Roboz	RS-5671	Precisieschaar voor het snijden van delicaat weefsel.
Borstel met een enkele haar			Kleine penseel aangepast tot een enkele haar voor het hanteren van delicaat weefsel.
Twee fijnpuntige pincetten	Roboz	RS-5060	Wordt gebruikt voor delicaat weefselhanteren.
Whatman-filterpapier (#1), gesneden in kleine stukken	GE Healthcare	1001-042	Wordt gebruikt voor het hanteren en drogen van retinal weefsel.