Driedimensionaal weefselmodel met hoge doorvoer voor kwantificering van elektroporatiedrempels

Summary

Dit protocol maakt gebruik van computationele modellering om omkeerbare en onomkeerbare elektroporatiedrempels te kwantificeren met behulp van de ruimtelijke verdeling van getransfecteerde cellen binnen een driedimensionale weefselnabootsing voor high-throughput analyse van elektroporatieprotocollen.

Abstract

Elektroporatie is een veelbelovende technologie die gebruikmaakt van elektrische pulsen voor de afgifte van macromoleculen en ablatie van zacht weefsel, met toepassingen zoals profylactica van de volgende generatie en de behandeling van genetische ziekten zoals kanker. Deze studie demonstreert een 3D-weefselkweekmodel met hoge doorvoer voor kwantificering van de omkeerbare en onomkeerbare elektroporatiedrempels voor een bepaald elektroporatieprotocol. Door gebruik te maken van een niet-uniform elektrisch veld en de ruimtelijke verdeling van getransfecteerde cellen te analyseren, kunnen zowel omkeerbare als onomkeerbare drempels worden geïdentificeerd binnen een enkel monster, waardoor de efficiëntie waarmee elektroporatieprotocollen kunnen worden gekarakteriseerd, vooral voor in vivo translatie, toeneemt. Om dit vermogen aan te tonen, werden 3D-weefselnabootsers die HEK293-cellen bevatten, getransfecteerd met behulp van een ring- en pin-elektrode om een GFP-coderend plasmide af te leveren. Elektroporatiedrempels werden vervolgens afgeleid op basis van fluorescerende microscopiebeelden van de getransfecteerde monsters. Dit model toont potentieel voor gebruik als middel voor high-throughput evaluatie van elektroporatieprotocollen, een belangrijk voordeel ten opzichte van de huidige methoden om deze drempels te evalueren, die vaak tijdrovend zijn en minder representatief zijn voor in vivo omstandigheden.

Introduction

Omkeerbare elektroporatie (RE) is een gevestigde methodologie voor het afleveren van een verscheidenheid aan normaal membraanondoorlaatbare verbindingen en moleculen in cellen ^1,2,3. Hier worden gepulseerde elektrische velden (PEF's) gebruikt om een kritische elektrische veldintensiteit te bereiken die voorbijgaande, gelokaliseerde nanoporiën langs delen van het celmembraan induceert. RE is gebruikt om een verscheidenheid aan moleculen en verbindingen af te leveren, variërend van kleurstoffen en nucleïnezuren tot chemotherapeutica en andere g....

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van de cellen

1. In een bioveiligheidskast plaat 1 × 10⁵ cellen/ml van cellijn HEK293 in een volume van 10 ml per weefselkweek T75-kolf in Eagle's Minimum Essential Medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine.
2. Incubeer HEK293-cellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO₂ -omgeving.
3. Oogst cellen voor experimenten 2 dagen na het zaaien door de kweekmedia te ve....

Results

De ring- en pin-elektrode leverde met succes een DNA-plasmide dat codeert voor een groen fluorescerend eiwit (GFP) af in 3D-collageenweefselimitaties die zijn ingebed met HEK293-cellen. Succesvolle kwantificering van de RE-drempel werd bereikt door de buitenstraal van het getransfecteerde gebied te meten en de overeenkomstige veldintensiteit af te leiden uit het rekenmodel van de experimentele opstelling, zoals te zien is in figuur 2<.......

Discussion

Met deze methode kunnen omkeerbare en onomkeerbare elektroporatiedrempels worden geïdentificeerd zonder dat meerdere monsters bij discrete spanningen hoeven te worden getest. Het gebruik van een niet-uniform elektrisch veld maakt kwantificering mogelijk op basis van de ruimtelijke verdeling van getransfecteerde cellen in het model. Er zijn echter beperkingen verbonden aan deze niet-uniforme verdeling. In de eerste plaats zijn de RE- en IRE-drempels die hierin worden beschreven de drempel.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1000 uL pipette tips	Fisher Scientific	13-811-164
15 mL conical tube	Fisher Scientific	14-959-70C
200 uL pipette tips	Fisher Scientific	13-811-139
304 stainless steel blunt tip needles	McMaster Carr	75165A753
316 Stainless steel tubing	McMaster Carr	89785K319
Acrylic	McMaster Carr	8505K754
Biosafety Cabinet	Fisher Scientific	13-261-312
CAD software	Dassault Systems	SolidWorks
Centrifuge	Nuaire	NU-C200R
Electroporator	Hbio	45-0662	A custom built device and a BTX ECM 830 system were used in this study
EMEM	Fisher Scientific	MT10009CV	This may vary  if using a cell line other than HEK293
Falcon 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid	Corning	353043	Any 12 well plate can be used, just ensure that well dimensions are taken into consideration when fabricating the electrode holder.
FBS	Fisher Scientific	A5670701
Fiber Optic Temperature Probe	Micronor Inc.	TS5-20MM-02
GFP-Plasmid	Aldeveron	gWiz-GFP
HEK293 Cells	ATCC	CRL-1573	Other cell lines can be used, just ensure the correct culture medium is used
Hot Plate	Thermoelectric Cooling America Corporation	AHP-301CPV
Ice or Refrigerated Bead Bath	Fisher Scientific	10-876-001
Image analysis software	Leica	LAS X
Incubator	Fisher Scientific	15-015-2633
Inverted Fluorescence Microscope	Leica	DMi8
Laser Cutter	McMaster Carr	7344N11
Penicillin-streptomycin	Fisher Scientific	15140122
Pipette Kit	Fisher Scientific	14-388-100
Simulation Software	COMSOL	COMSOL Multiphysics 6.2
T75 Flask	Fisher Scientific	156499
Type I Bovine Collagen Solution	Advanced Biomatrix	5005	3 mg/mL