Detectie van Mycoplasma pneumoniae nucleïnezuur en geneesmiddelresistentiegen

Samenvatting

Dit protocol biedt een snelle en betrouwbare manier om Mycoplasma pneumoniae-infecties te detecteren en antibioticaresistentie te identificeren. Het helpt behandelaars om sneller de juiste behandelingen te kiezen, waardoor de zorg voor patiënten met longontsteking wordt verbeterd en een beter gebruik van antibiotica wordt ondersteund

Samenvatting

Mycoplasma pneumoniae (Mp) vertegenwoordigt een van de meest voorkomende pathogenen die verantwoordelijk zijn voor buiten het ziekenhuis opgelopen longontsteking (CAP) bij pediatrische populaties. De detectie van Mycoplasma pneumoniae-resistentiegenen biedt robuuste technische ondersteuning en een theoretische basis voor de nauwkeurige klinische diagnose en behandeling van MP-infecties. Nauwkeurige diagnose en evaluatie van geneesmiddelresistentie bij Mp-infectie zijn essentieel voor klinische behandeling. Veelgebruikte detectiemethoden voor Mycoplasma pneumoniae zijn onder meer kweek, detectie van antilichamen en op moleculaire biologie gebaseerde assays. Mp-cultuur is de gouden standaard voor diagnose, maar vereist een specifiek medium, is tijdrovend en heeft een lage gevoeligheid. Op antilichamen gebaseerde detectie van Mp wordt veel gebruikt; Valse negatieven kunnen echter optreden in het vroege stadium van infectie. Op moleculaire biologie gebaseerde detectie zorgt voor een snelle doorlooptijd, een laag risico op besmetting, een hoge gevoeligheid, een hoge specificiteit en wordt niet beperkt door de timing van het verzamelen van monsters of de immuunstatus. Het is daarom erkend als een nieuwe gouden standaard voor het diagnosticeren van Mycoplasma pneumoniae-infectie . Macrolide-middelen zijn de eerste keuze behandeling voor Mp-infectie bij kinderen. Met het uitgebreide gebruik van macroliden bij luchtweginfecties bij kinderen, is de incidentie van geneesmiddelresistente Mycoplasma pneumoniae-infectie echter toegenomen. Patiënten die besmet zijn met resistente stammen ervaren een significant langere koortsduur, langdurige ziekenhuisopname en langdurige koorts na toediening in vergelijking met patiënten die besmet zijn met gevoelige stammen. Mutatieplaatsen die tot nu toe zijn geïdentificeerd, zijn onder meer 2063, 2064, 2067 en 2617. In China zijn puntmutaties alleen gedocumenteerd op posities 2063 en 2064, waarbij een A-naar-G-substitutie op positie 2063 de meest voorkomende is. Voor deze plaatsen is polymerasekettingreactie (PCR) in combinatie met fluorescerende sondetechnologie gebruikt om de nucleïnezuren en geneesmiddelresistentiemutaties van Mycoplasma pneumoniae in menselijke sputummonsters te detecteren. Detectie van Mycoplasma pneumoniae-resistentiegenen biedt cruciale technische ondersteuning en een theoretische basis voor een nauwkeurige diagnose en effectieve behandeling van Mp-infectie.

Inleiding

Mycoplasma pneumoniae (Mp) is het kleinste pathogene micro-organisme dat in staat is om zelfstandig te overleven, gelegen op een tussenpositie tussen bacteriën en virussen. Het wordt voornamelijk verspreid door ademhalingsdruppels of aerosolen en vormt de op één na meest voorkomende ziekteverwekker die in verband wordt gebracht met buiten het ziekenhuis opgelopen longontsteking (CAP) bij kinderen¹, verantwoordelijk voor 20% tot 40% van de CAP-gevallen². Mp vertoont inherente resistentie tegen β-lactam-antibiotica, zoals penicilline en cefalosporines, vanwege de afwezigheid van een celwand, waarop deze antibiotica zich richten door de celwandsynthese te belemmeren. De belangrijkste therapeutische modaliteiten voor Mp-infecties omvatten middelen die de eiwitsynthese belemmeren, waaronder macroliden en tetracyclines, naast geneesmiddelen die de DNA-replicatie belemmeren, zoals tetracyclines en fluoroquinolonen ^3,4,5. Daarom is de snelle laboratoriumidentificatie van Mp essentieel voor het informeren van een oordeelkundige toepassing van antibiotica. Hedendaagse laboratoriumdetectiemethoden voor Mp omvatten isolatie en kweek, antigeendetectie, antilichaamdetectie en genetische diagnostische technieken.

Als traditionele detectiemethode blijven isolatie en kweek de definitieve standaard voor het diagnosticeren van Mycoplasma pneumoniae-infectie . Kashyap et al. merkten op dat het kweken van Mp uit keeluitstrijkjes of sputummonsters een betrouwbare diagnostische techniek is⁶. Deze aanpak stuit op aanzienlijke obstakels, zoals de strenge culturele vereisten van Mp, langere kweekperioden en doorgaans lage positieve detectiepercentages, die het routinematige klinische gebruik ervan beperken. De detectie van mp-antigeen is afhankelijk van mp-specifieke antilichamen. Miyashita et al. gebruikten monoklonale antilichamen van verschillende Mp-stammen als coatingmiddelen in een dubbel-antilichaam sandwich ELISA en evalueerden hun werkzaamheid met behulp van PCR⁷. De bevindingen toonden geen substantieel verschil tussen de twee methodologieën. De noodzaak van zeer specifieke monoklonale antilichamen met een hoge titer beperkt echter de uitgebreide implementatie van deze methode.

Na een Mp-infectie maakt het immuunsysteem specifieke IgM- en IgG-antilichamen aan. IgM-antilichamen worden over het algemeen binnen 1 week na infectie detecteerbaar en bereiken hun piek na 3 tot 4 weken, waardoor ze waardevolle diagnostische indicatoren zijn voor vroege infectie. In de beginfase kunnen echter vals-negatieve resultaten optreden als gevolg van verminderde antilichaamniveaus⁸. Omgekeerd manifesteren IgG-antilichamen zich later en duiden ze meestal op een eerdere infectie ^9,10. Serologische detectie van Mp wordt ingedeeld in niet-specifieke en specifieke antilichaamtesten. Hoewel niet-specifieke antilichaamtests eenvoudig toe te dienen zijn, is hun specificiteit beperkt, omdat infecties van andere pathogenen, waaronder rickettsia en adenovirus, ook de koude agglutininespiegels kunnen verhogen, wat resulteert in vals-positieve resultaten. Specifieke antilichaamtesten omvatten de complementbindingstest, de deeltjesagglutinatietest, de indirecte hemagglutinatietest, de indirecte immunofluorescentietest en de enzymgekoppelde immunosorbenttest (ELISA). ELISA wordt op grote schaal gebruikt in China vanwege de gevestigde technologie en commerciële toegankelijkheid, die een hoge gevoeligheid en operationele eenvoud biedt, waardoor het dient als een praktische en betrouwbare methode voor het diagnosticeren van Mp-infecties in de routinematige klinische praktijk¹¹.

Real-time fluorescerende kwantitatieve PCR onderscheidt zich door zijn snelle verwerkingstijd, verhoogde specificiteit, robuuste gevoeligheid en afwezigheid van kruisreactiviteit. Deze methode identificeert Mp-DNA in monsters van sputum, keeluitstrijkje of bronchiale spoelvloeistof en vereist 1-100 ng DNA per reactie. De detectie werd uitgevoerd met behulp van een real-time PCR-instrument. De DNA-sjabloon ervaart denaturatie bij hogere temperaturen, gevolgd door primer-gloeien en fluorescerende sondehybridisatie. Genamplificatietechnologie maakt de replicatie van nucleïnezuurfragmenten in extreem lage concentraties tot miljoenen kopieën in een kort tijdsbestek mogelijk, waardoor een detectiegevoeligheid van ≥10 CFU/ml¹² wordt bereikt. In vergelijking met conventionele PCR vermindert real-time fluorescerende kwantitatieve PCR het risico op besmetting en maakt het een hoge doorvoer en geautomatiseerde analyse mogelijk. Daarom is het naar voren gekomen als de favoriete techniek voor directe M-detectie in de klinische praktijk¹³. Vanwege de verhoogde gevoeligheid zijn strenge maatregelen nodig om besmetting te voorkomen, wat kan leiden tot vals-positieve of vals-negatieve resultaten.

Bij de klinische behandeling vormen macroliden de primaire therapeutische interventie voor Mycoplasma pneumoniae-pneumonie (MPP). Het overmatig gebruik en de onjuiste toepassing van antibiotica hebben selectiedruk uitgeoefend, wat heeft geleid tot het ontstaan van macrolide-resistent Mp. Deze resistentie levert een belangrijke bijdrage aan vuurvast MPP. Macrolideresistentie in Mycoplasma pneumoniae is opmerkelijk verhoogd in Oost-Azië, met name in China en Japan, terwijl Europa en de Verenigde Staten relatief lagere resistentiepercentages vertonen. Pediatrische patiënten vertonen over het algemeen verhoogde weerstandspercentages in vergelijking met volwassenen, waardoor verscherpt onderzoek nodig is¹⁴. Sinds 2000 is de incidentie van Mycoplasma pneumoniae-infecties (MRMPI) op wereldschaal aanzienlijk geëscaleerd, vooral in Oost-Azië. In China vormen MRMPI-stammen 69% tot 95% van de gevallen¹⁵, wat aanzienlijk bijdraagt aan ernstige ziekte, falen van de behandeling, complicaties en gevolgen op lange termijn. Onderzoek wijst uit dat mutaties in het 23S rRNA-gen de binding van macrolide aan doelwitten remmen, waardoor de werkzaamheid van het geneesmiddel afneemt. Frequente mutatieloci omvatten de posities 2063, 2064, 2067 en 2617. In China zijn mutaties uitsluitend geïdentificeerd op posities 2063 en 2064^16,17. Een studie uit 2016 gaf aan dat de resistentiepercentages tegen macroliden in Beijing, Harbin, Shanghai en Xinjiang varieerden tussen 66,7% en 86,7%, terwijl Nanjing een lager percentage van 20% ^vertoonde18. Macrolide-resistente stammen zijn in verschillende regio's ontstaan, met resistentiepercentages die als volgt worden gerapporteerd: 8,3%-9,8% in Frankrijk, 3,0%-3,6% in Duitsland, 8,2% in de Verenigde Staten, 0,9%-2,9% in Denemarken, 12,1% in Canada, 20% in Italië, 22% in Israël, 8% in Spanje en 9,3% in het Verenigd Koninkrijk 19,20,21,22,23,24,25,26^{, 27}. okt. Deze trend benadrukt de wereldwijde proliferatie van macrolideresistentie. In 2008 rapporteerden Hindley et al. 46 gevallen van macrolide-resistente Mycoplasma pneumoniae, met 40 gevallen die de A2063G-mutatie aantoonden, één geval met de A2063C-mutatie en vijf gevallen met de A2064G-mutatie²⁸. Vergelijkbare resistentiemutaties zijn geïdentificeerd in Japan en de Verenigde Staten, waarbij de primaire mutaties optreden op posities 2063 en 2064²⁹. Onderzoek suggereert een verband tussen mutatieplaatsen en fenotypes van geneesmiddelresistentie: A2063G-mutatie zorgt voor resistentie tegen 14-ledige macroliden (ML), A2064G-mutatie zorgt voor resistentie tegen zowel 14- als 16-ledige ML, C2617G geeft resistentie tegen 14- en 15-ledige ML, en A2067G-mutatie geeft resistentie tegen 16-ledige ML³⁰. Het monitoren van Mp-resistentie is cruciaal voor de vroege identificatie van resistente infecties en voor het informeren van klinische behandelingskeuzes. Studies hebben aangetoond dat in vitro antimicrobiële gevoeligheidstesten de klinische effectiviteit van geneesmiddelen kunnen voorspellen³¹. In 2011 heeft het American Clinical and Laboratory Standards Institute richtlijnen afgekondigd waarin wordt gepleit voor de microdilutiemethode voor het bepalen van de minimale remmende concentratie (MIC) om macrolidresistentie te evalueren³². De bepaling van MIC kan echter enkele weken duren, waardoor het klinische nut ervan bij het sturen van real-time antibioticatherapie wordt beperkt.

Sanger-sequencing is een directe techniek voor het identificeren van mutaties in het 23S rRNA-gen van Mp. Deze methode maakt gebruik van fluorescerend gelabelde nucleotiden en elektroforetische analyse om DNA-sequenties vast te stellen, waardoor de identificatie van genetische variaties van Mp wordt vergemakkelijkt. Sanger-sequencing, hoewel in staat om tegelijkertijd meerdere mutaties te identificeren en de verhoudingen van resistente en vatbare stammen te kwantificeren, is arbeidsintensief en tijdrovend, waardoor het klinische nut ervan wordt beperkt^33,34. Pyrosequencing daarentegen zorgt voor een nauwkeurigere beoordeling van DNA-sequentievariaties door de afgifte van pyrofosfaat tijdens de opname van nucleotiden te identificeren. Deze methode kan MRMPI-stammen identificeren en de verhoudingen van resistente en vatbare stammen in klinische monsters met grotere nauwkeurigheid kwantificeren dan Sanger-sequencing. Bovendien maakt pyrosequencing longitudinale monitoring van individuele patiënten mogelijk, waardoor real-time evaluatie van zich ontwikkelende resistentie mogelijk is en behandelingswijzigingen kunnen worden geïnformeerd³³. De klinische toepassing ervan wordt echter beperkt door de noodzaak van gespecialiseerde apparatuur, bekwaam personeel en langere verwerkingsduur.

Op basis van restrictiefragmentlengtepolymorfisme (RFLP)-analyse van het P1-gen wordt Mp gecategoriseerd in twee typen: type I (verder onderverdeeld in vijf subtypen: 1a-1e) en type II (verder onderverdeeld in drie subtypen: 2a-2c). Deze test kan 8 gensubtypes van Mycoplasma pneumoniae³⁵ detecteren. Deze methode vergemakkelijkt de kwalitatieve identificatie van Mycoplasma pneumoniae en macrolide resistentie mutaties (23S rRNA 2063 (A:G) en 2064 (A:G) mutatieplaatsen) in pediatrische sputummonsters, en biedt een snel en eenvoudig aanvullend diagnostisch instrument voor Mycoplasma-infecties en surveillance van antibioticaresistentie.

Protocol

Alle studieprotocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Medische Ethische Commissie van het Heyuan People's Hospital (Goedkeuring nr. YXYJLL-LW2025001). Alle patiënten gaven voorafgaand aan deelname schriftelijke geïnformeerde toestemming.

1. Verzameling van specimens

OPMERKING: Wees voorzichtig bij het handhaven van de aseptische techniek tijdens het verzamelen van monsters.

1. Verzamel monsters van sputum van de patiënt of verdachte patiënt. Verkrijg monsters binnen 3 dagen na het begin van de ziekte van de patiënt.
2. Instrueer de patiënt om zijn mond met water te spoelen, diep adem te halen, zijn adem 5 seconden in te houden en geleidelijk uit te ademen.
3. Vraag de patiënt om nog een keer diep uit te ademen, te proberen het sputum te verdrijven, het in een daarvoor bestemde plastic beker te doen en het deksel goed vast te zetten. Het sputum moet onmiddellijk bij kamertemperatuur (RT) aan het klinische laboratorium worden afgeleverd. Bewaar de monsters bij 2-8 °C in de koelkast.

2. Bereiding van amplificatiereagentia

1. Ontdooi in de bereidingsruimte voor reagens van het PCR-laboratorium de buffer, de primersonde en het water uit de kit bij 4 °C nadat u ze uit de vriezer van -20 °C hebt gehaald. Verwijder het enzym, meng het voorzichtig door te schudden en centrifugeer vervolgens gedurende 10 s bij 1.006 x g .
2. Pak een steriele nucleasevrije centrifugebuis, label deze en bereid het reactiesysteem voor elk individu voor zoals beschreven in tabel 1. Het totale aantal PCR-reacties moet gelijk zijn aan de som van de monsters, één zwak positieve kwaliteitscontrole, één kwaliteitscontroleproduct W en één negatieve extractiecontrole.
3. Bepaal de hoeveelheid van elk reagens, voeg het toe aan een centrifugebuis van de juiste grootte, meng grondig en centrifugeer kort op lage snelheid. Doseer 20 μL reagens in elke PCR-reactiebuis en verplaats deze naar het monsterverwerkingsgebied.

3. Monster behandeling

1. Behandel 1 ml sputummonsters met 2 ml sputumverteringsbuffer, meng grondig met vortex en incubeer gedurende 30 minuten totdat volledige vloeibaarmaking is bereikt.
2. Voeg op basis van de monsterhoeveelheid achtereenvolgens 5 μL van de interne standaard toe aan de^1e en 7e^{kolom van} de nucleïnezuurextractieplaat, gevolgd door de toevoeging van 200 μL vloeibare monsters, normale zoutoplossing en MM zwak positieve kwaliteitscontrole achtereenvolgens.
3. Haal een nucleïnezuurextractieplaat op met behulp van een geautomatiseerd nucleïnezuurextractie-instrument. Voeg de geëxtraheerde nucleïnezuren toe na het uitvoeren van stroomafwaartse analyses in de kolommen 6 en 12 van de extractieplaat.
4. Monstertoevoeging: Voeg in het monstervoorbereidingsgebied van het PCR-laboratorium geëxtraheerd nucleïnezuur toe aan de 6e^en 12e^{kolom van} de extractieplaat. Breng vervolgens 5,0 μl van het bereide nucleïnezuur van het monster over naar de PCR-reactiebuis, die het PCR-reactiemengsel bevat (inclusief monster, sterke en zwakke positieve kwaliteitscontroles, kwaliteitscontrole W en negatieve extractiecontrole).
5. Zet de vloeistof van de PCR-reactiebuis vast en voer deze onmiddellijk uit om te bevestigen dat de vloeistof goed is afgesloten en geen luchtbellen bevat.

4. Versterking

1. Plaats de reactiebuis in de fluorescentie-PCR-detector en configureer de cyclusparameters als volgt in tabel 2.
2. Verkrijg fluorescentiesignalen in FAM (2063 of 2064 A:G-mutatie), VIC (Mycoplasma pneumoniae) en CY5 (interne standaard), met gegevensverzameling ingesteld op 64 °C.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: Deze studie maakte gebruik van kwantitatieve real-time PCR (qPCR), met representatieve resultaten die wijzen op A:G-resistentie-geassocieerde mutaties op posities 2063 of 2064 van Mycoplasma pneumoniae. Patiënten die positief testen, moeten macrolide-antibiotica vermijden tijdens de klinische behandeling.

1. Na de reactie analyseert en archiveert het instrument autonoom de resultaten. Controleer of de doelgenen voor negatieve controle FAM-fluorescentie Ct ≥ 35.33 en VIC-fluorescentie Ct ≥ 35.01 vertonen, terwijl de doelgenen voor kwaliteitscontrole W FAM-fluorescentie Ct ≥ 35.33 en VIC-fluorescentie Ct ≥ 35.01 vertonen. De Ct-waarden voor FAM- en VIC-fluorescentie in zwak positieve kwaliteitscontroleproducten varieerden van 29,00 tot 34,00.
2. Over het algemeen is de Ct-waarde van de interne standaard ≤ 35,00. Als een karakteristieke S-amplificatiecurve wordt waargenomen, maar de interne standaard niet wordt versterkt vanwege de verhoogde concentratie van het doelgen, rapporteer dit dan direct als een positief monster of evalueer het monster opnieuw door middel van een 10-voudige gradiëntverdunning.
3. Classificeer het monster dat UNDECT vertoont of het ontbreken van een typische S-type versterkingscurve als negatief.
4. Beschouw monsters als negatief wanneer FAM-fluorescentie (2063 of 2064 A:G-mutatie) Ct ≥ 35.33, VIC-fluorescentie (Mycoplasma pneumoniae) Ct ≥ 35.01, of wanneer er geen typische S-type amplificatiecurve is. Debeschouw monsters als positief wanneer hun Ct-waarde voldoet aan tabel 3 en een karakteristieke S-type versterkingscurve vertonen.
   OPMERKING: De resultaten van monsterdetectie zijn afhankelijk van de kwaliteit van het verzamelen, verwerken, transporteren en bewaren van monsters; Eventuele fouten kunnen leiden tot vals-negatieve resultaten. Het niet beheersen van kruisbesmetting tijdens de monsterverwerking kan leiden tot vals-positieve resultaten.

Resultaten

Na liquefactie, nucleïnezuurextractie en fluorescentie-PCR-amplificatie van sputummonsters werden de startwaarde, de eindwaarde en de drempelwaarde van de basislijn gewijzigd na de analyse van de amplificatiecurve. De startwaarde was 3 en de eindwaarde was 20.

De representatieve resultaten van dit experiment waren positief voor Mp-nucleïnezuur en een A: G-resistentiemutatie trad op op 2063 of 20...

Discussie

PCR en zijn afgeleide technieken vertonen een superieure gevoeligheid en specificiteit in vergelijking met serologische methoden bij de identificatie, typering en detectie van geneesmiddelresistentie in Mycoplasma pneumoniae (MP). Bovendien zorgen op PCR gebaseerde technieken voor gebruiksgemak en lagere kosten, waardoor ze een levensvatbaar alternatief zijn voor routinematige klinische diagnostiek³⁶. Mp is een opmerkelijke ziekteverwekker die in verband ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Geautomatiseerd nucleotidezuur extractie-instrument	Guangzhou Da 'an Gene Co., Ltd.	Smart 32
Filter Tips	Coring Life Science Co., Ltd.	29822001	0-10µL
Filter Tips	Coring Life Science Co., Ltd.	03023001	1-50µL
Filter Tips	Coring Life Science Co., Ltd.	05623001	5-300µL
Microtubes	Coring Life Science Co., Ltd.	14124934	1.5mL
Mycoplasma pneumoniae nucleotidezuur en geneesmiddelresistentie mutatie site detectie kit (fluorescentie PCR methode)	Jiangsu Mole Biotechnology Co., Ltd.	20241111
Kernzuur extractie reagens (magnetische kralen methode)	Shengxiang Biotechnology Co., Ltd.	G24004
PCR buizen	DN Biotech(Hong Kong)  Co., Ltd.	6121003	0.2mL
Real-time fluorescerende PCR instrument	BIO-RAD	CFX96