Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Neuronale ferroptose-verzwakking door RKIP-remming na spontane intracerebrale bloeding via activering van de NRF2/HO-1-route

488 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68511

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Affiliated Hospital 2 of Nantong University

In dit artikel

Samenvatting

Door zowel organismale als celkweekstudies uit te voeren, werd aangetoond dat het remmen van Raf-kinaseremmereiwit (RKIP) neuronale ferroptose na spontane intracerebrale bloeding kan verminderen, waardoor hersenletsel wordt verminderd. De waargenomen cytoprotectie ontstaat door NRF2/HO-1 signaalas modulatie.

Samenvatting

Raf-kinaseremmer-eiwit (RKIP), een primair lid van de fosfatidylethanolamine-bindende eiwitfamilie, staat bekend om zijn betrokkenheid bij verschillende fysiologische processen, waaronder celdifferentiatie, migratie, celcyclus en apoptose. Deze studie onderzocht de functie ervan bij neuronale ferroptose na spontane intracerebrale bloeding (ICH) en de bijbehorende mechanismen. Een cellulair model van spontane ICH werd ontwikkeld met behulp van gekweekte feochromocytoom (PC12)-cellen van ratten die werden gestimuleerd met hemine. De levensvatbaarheid van cellen, RNA-expressie, niveaus van reactieve zuurstofspecies (ROS) en lipidehydroperoxide (LPO) werden beoordeeld. Daarnaast werden de eiwitexpressieniveaus gemeten. Deze studie bevestigde dat RKIP-remming in vitro neuroprotectief is na ICH. Dit effect was geassocieerd met verhoogde expressie van glutathionperoxidase 4 (GPX4) en verminderde expressie van acyl-CoA-synthetase lange keten familie 4 (ACSL4), samen met ROS- en LPO-niveaus in neuronen. RKIP-remming toonde een beschermende rol aan tegen neuronale ferroptose in vitro na ICH, mogelijk via activering van de nucleaire factor E2-gerelateerde factor 2/heemoxygenase-1 (NRF2/HO-1)-route. Dit mechanisme kan inzicht bieden in therapeutische strategieën gericht op neuronale ferroptose bij ICH.

Inleiding

Spontane intracerebrale bloeding (ICH) is een cerebrovasculaire aandoening die wordt gekenmerkt door bloedingen als gevolg van intracraniële vasculaire schade, necrose en vaatruptuur, die vaak de basale ganglia aantast en een belangrijk subtype van hemorragische beroerte vertegenwoordigt1. Het sterftecijfer onder patiënten met de diagnose ICH is ongeveer 50% en een aanzienlijk deel van de overlevenden ervaart ernstig verlies van onafhankelijkheid2. De huidige behandelingsopties voor spontane ICH zijn beperkt, en er zijn geen bestaande therapieën waarvan is aangetoond dat ze de mortaliteit significant verminderen of de neurologische resultaten na ICH aanzienlijk verbeteren.

Ferroptose, een ijzerafhankelijke vorm van geprogrammeerde celdood, wordt gedefinieerd door lipideperoxidatie, accumulatie van ijzerionen en uitputting van glutathion, waardoor het zich onderscheidt van andere vormen van geprogrammeerde celdood in genetische, morfologische en biologische termen3. Toenemend bewijs benadrukt de rol van neuronale ferroptose in de pathologie van ICH. Raf-kinaseremmer-eiwit (RKIP), ook bekend als fosfatidylethanolamine-bindend eiwit 1 (PEBP1), is betrokken bij de neurale ontwikkeling en vormt het 15LOX/PEBP1-complex door zijn binding met 15-lipoxygenase (15LOX), een belangrijke regulator van ferroptose4. De specifieke rol en mechanismen van RKIP bij ferroptose die verband houden met de progressie van spontane imgratieve immaterieel blijven echter onontgonnen.

Deze studie onderzocht de anti-ferroptose-effecten van RKIP-remming op neuronen, wat aantoont dat remming van RKIP-expressie neuronale ferroptose na ICH zou kunnen onderdrukken, mogelijk door activering van de nucleaire factor E2-gerelateerde factor 2/heemoxygenase-1 (NRF2/HO-1) route. Deze bevindingen zijn belangrijk voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën gericht op de pathogenese van ICH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Cultuur van PC12-cellen
De PC12-cellijn werd vermeerderd in het groeimedium Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI-1640) dat 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine bevatte, met routineonderhoud onder standaard kweekomstandigheden (37 °C, 5% CO2 bevochtigde atmosfeer). Voor experimentele procedures werden adherente cellen op kweekvaten geplateerd en konden ze zich vermenigvuldigen tot ze bijna confluente monolagen bereikten (ongeveer 90% oppervlaktebedekking). Cellulaire dissociatie werd bereikt door enzymatische behandeling met 0,25% trypsine-EDTA-oplossing, gevolgd door drie opeenvolgende subcultuurcycli om de stabiliteit van de populatie te garanderen. Verwerkte cellen werden vervolgens toegewezen voor stroomafwaartse experimentele toepassingen en analytische beoordelingen.

Testen op levensvatbaarheid van cellen
De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld om de cytotoxiciteit van hemine en locostatine op PC12-cellen te evalueren, volgens de instructies van de fabrikant van de testkit. PC12-cellen werden uniform gezaaid in platen met 96 putjes en gedurende 24 uur gekweekt met hemine of locostatine. Na het wassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werden de cellen gedurende 90 minuten bij 37 °C geïncubeerd in een RPMI-1640-medium met 10% tetrazoliumzoutoplossing die 10% tetrazolium bevatte. Optische dichtheid (OD) -waarden werden vervolgens gemeten bij 450 nm met behulp van een microplaatlezer.

Kwantitatieve reverse transcriptie-polymerasekettingreactie (RT-qPCR)
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit PC12-cellen met behulp van het RNA-extractiereagens. Eerst werd het monster gehomogeniseerd in het extractiereagens, wat een grondige lysis garandeerde. Chloroform werd aan het mengsel toegevoegd, krachtig geschud en gecentrifugeerd om de fasen te scheiden (12.000 × g, 15 min, 4 °C). De waterige fase die het RNA bevatte, werd verzameld en het RNA werd neergeslagen door isopropanol toe te voegen (waterige fase : iPrOH = 1:1) en te incuberen bij kamertemperatuur. Centrifugeren werd gedaan om het RNA te pelleteren (12.000 × g, 10 min, 4 °C), 1 ml 70% ethanol werd toegevoegd om onzuiverheden te verwijderen en ten slotte werd de RNA-pellet opgelost in RNase-vrij water voor opslag bij -80 °C. Complementaire DNA-sjablonen (cDNA) werden gegenereerd door reverse transcriptie met de RT Master Mix. De resulterende sjablonen werden vervolgens verdund in een verhouding van 1:5 en onderworpen aan kwantitatieve real-time PCR op een real-time PCR-instrument. Elk monster werd in drievoud geamplificeerd en de relatieve hoeveelheid PCR-product werd gemiddeld. De gebruikte primers staan vermeld in tabel 1, waarbij β-actine dient als het huishoudgen. De relatieve mRNA-concentratie werd bepaald met behulp van de formule E = 2−ΔΔCt, en de Critical Threshold Cycle (CT)-waarde werd voor elke reactie geregistreerd.

Intracellulaire reactieve zuurstofspecies (ROS) en lipidehydroperoxide (LPO) assays
ROS- en LPO-niveaus werden gemeten met behulp van flowcytometrie. PC12-cellen werden gedurende 24 uur behandeld met hemine (80 μM), locostatine (5 μM) en ML385 (5 μM) en 3x gewassen met PBS in gerechten. De cellen werden vervolgens geïncubeerd bij 37 °C met 5% CO2 gedurende 40 minuten in aanwezigheid van 2',7'-dichloordihydrofluoresceïnediacetaat (DCFH-DA), een ROS-sonde, en BODIPY 581/591 C11, een LPO-sonde. Na PBS-wasbeurten om overtollige sondes te verwijderen, werd de fluorescentie-intensiteit gemeten met behulp van flowcytometrie. Een consistente poortstrategie werd toegepast op alle monsters: eerst werden cellen afgeschermd op FSC-A versus SSC-A om puin uit te sluiten, vervolgens werden afzonderlijke cellen geselecteerd op basis van FSC-A versus FSC-H-gating. Ongekleurde cellen en cellen die alleen met hemine werden behandeld, werden gebruikt als negatieve en positieve controles om de fluorescentiecompensatie en poorten vast te stellen. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van de gekoppelde software.

Eiwitextractie en western blot
Totale eiwitextractie
Het supernatans van behandelde PC12-cellen werd weggegooid, gevolgd door drie wasbeurten met ijskoude PBS. Cellen werden geoogst met behulp van trypsine en gecentrifugeerd bij 200 × g gedurende 5 minuten. Na verwijdering van het supernatant werd de celpellet gehomogeniseerd in koude Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA) lysisbuffer die 10% proteaseremmer en 10% fosfataseremmer bevatte. Na een incubatie van 30 minuten op ijs werd het lysaat gedurende 15 minuten bij 4 °C gecentrifugeerd bij 12.000 × g. Het heldere supernatans werd gemengd met Loading Buffer (4:1) en gedurende 5 minuten bij 95 °C verhit om eiwitten te denatureren. Eiwitmonsters werden bewaard bij -80 °C voor later gebruik.

Analyse van de westerse vlek
Eiwitten werden gescheiden door SDS-PAGE met behulp van een stapelgel en oplossende gel, waarbij monsters in putten werden geladen. Elektroforese werd uitgevoerd bij 80 V voor de stapelgel en 120 V voor de oplossende gel. Eiwitten werden overgebracht op een polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan (vooraf geactiveerd in methanol gedurende 1 minuut) met behulp van een overdrachtssysteem met een constante stroom van 300 mA gedurende 1-2 uur. Het membraan werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk in TBST om niet-specifieke binding te voorkomen. Na drie wasbeurten met TBST (elk 10 minuten) werd het membraan een nacht bij 4 °C geïncubeerd met de volgende primaire antilichamen verdund in TBST: Konijn anti-ACSL4 (1:1.000), Konijn anti-GPX4 (1:1.000), Konijn anti-HO-1 (1:2.000), Konijn anti-NRF2 (1:1.000), Konijn anti-RKIP (1:1.500) en Muis anti-β-actine (1:5.000). Het membraan werd 3 x 10 minuten gewassen met TBST en gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen: HRP-gelabeld Geit Anti-Muis IgG (1:1.000), HRP-gelabeld Geit Anti-Konijn IgG (1:1.000). Na extra TBST-wasbeurten gedurende 3 x 5 minuten werden eiwitsignalen gevisualiseerd met behulp van een ECL Western Blot Kit en gekwantificeerd met behulp van ImageJ-software.

Immunofluorescentie kleuring
Cellen werden gezaaid op dekglaasjes die vooraf in kweekplaten waren geplaatst en mochten hechten. Na experimentele behandelingen werd het bovenstaande weggegooid en werden de cellen 3x gewassen met PBS. De cellen werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gefixeerd met 4% paraformaldehyde (PFA), gevolgd door drie PBS-wasbeurten. Vervolgens werden de cellen gepermeabiliseerd met 0,1% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 3x gewassen met PBS. De niet-specifieke binding werd geblokkeerd door incubatie met 3% runderserumalbumine (BSA) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Primaire antilichamen werden 's nachts bij 4 °C aangebracht: Konijn anti-HO-1 (1:500), Konijn anti-NRF2 (1:500). Na drie PBS-wasbeurten de volgende dag werden de cellen in het donker gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met fluorescerende secundaire antilichamen: Alexa Fluor 488-gelabeld Goat Anti-Rabbit IgG (1:500). Na de laatste wasbeurten werden de monsters gemonteerd met een montagemedium dat 4',6-diamidino-2'-fenylindool (DAPI) bevatte voor nucleaire tegenkleuring. Beelden werden vastgelegd met behulp van een confocale laserscanmicroscoop.

Statistische analyse
De meetgegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (S.D.). Kwantitatieve gegevens die de resultaten van drie onafhankelijke replicaattesten vertegenwoordigen, werden genomen voor analyse. Voor vergelijkingen tussen twee groepen werd een t-test toegepast, terwijl een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) werd gebruikt voor vergelijkingen tussen meerdere groepen, gevolgd door Tukey's post-hoctest voor meerdere vergelijkingen. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hemin kan plasmamembraanschade veroorzaken en wordt daarom vaak gebruikt voor de constructie van in vitro celmodellen van ICH. Deze studie onderzocht de effecten van heminebehandeling bij verschillende concentraties en duur op de levensvatbaarheid van PC12-cellen, terwijl tegelijkertijd de dynamiek van RKIP-eiwitexpressie onder overeenkomstige experimentele omstandigheden werd geanalyseerd door middel van western blot-analyse (Figuur 1A). De levensv...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie onderzocht de effecten en onderliggende mechanismen van RKIP-knockdown op ferroptose geïnduceerd door ICH in een in vitro setting. Stimulatie van cellen met hemine veroorzaakt oxidatieve stress, vergezeld van overmatige aanmaak van ROS en LPO, waardoor ferroptose wordt bevorderd. Remming van endogene RKIP-expressie versnelt de vrijgekomen NRF2 om naar de kern te transloceren en te binden aan het Antioxidant Response Element (ARE), waardoor ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die van invloed zouden kunnen zijn geweest op het werk dat in dit artikel wordt gerapporteerd.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door subsidies van het Nantong Municipal Health Commission Project (MS2022015) en het Nantong Science and Technology Bureau Project (JCZ2023022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgGBeyotime BiotechA0423
Anti-ACSL4 antibodyCell signaling38493T
Anti-GPX4 antibodyCell signaling59735S
Anti-HO-1 antibodyMedChemExpressHY-P80499
Anti-NRF2 antibodyCell signaling12721T
Anti-RKIP antibodyAbcamab76582
Anti-β-actin antibodyAbcamab179467
BeyoECL PlusBeyotime BiotechP0018M
BSANCM BiotechWB6504-100g
Cell Counting Kit-8Beyotime BiotechC0037
CELLSAVINGNCM BiotechC40050
ChamQ SYBR Color qPCR Master MixVazymeQ411-02
DMSOBeyotime BiotechST038
Fetal Bovine SerumGibcoA5670801
GraphPad Prism
HeminMedChemExpressHY-19424
HiScript Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)VazymeR123-01
HRP-labeled Goat Anti-Mouse IgGThermoC31430100
HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgGThermoC31460100
Lipid Peroxide (LPO) Content Assay KitSolarbioBC5245
LocostatinMedChemExpressHY-W013411A
ML385MedChemExpressHY-100523
Mounting Medium?antifading (with DAPI)SolarbioS2110
NON-FatPowderedMilkSolarbioD8340
PBS (powder?pH7.2-7.4)SolarbioP1010
PC-12AdhNanjing BioChannel BiotechnologyBC-C-RA-005
Penicillin-Streptomycin LiquidSolarbioP1400
PRMI-1640GibcoA1049101
Protease and phosphatase inhibitor cocktail for general use, 50xBeyotime BiotechP1045
Protein MarkerThermo26617
PVDF MilliporeRIKB43638
Reactive Oxygen Species Assay KitSolarbioCA1410
RIPA buffer (high)SolarbioR0010
SDS-PAGE Gel Quick Preparation KitEpizymePG110
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5xBeyotime BiotechP0015
TritonX-100SolarbioIT9100
TRIzolThermo15596018CN
Trypsin-EDTA solution?0.25% (without phenol red)SolarbioT1300

Referenties

  1. Puy, L., et al. Intracerebral haemorrhage. Nat Rev Dis Primers. 9 (1), 14(2023).
  2. Shao, A., Zhu, Z., Li, L., Zhang, S., Zhang, J. Emerging therapeutic targets associated with the immune system in patients with intracerebral haemorrhage (ICH): from mechanisms to translation. EBioMedicine. 45, 615-623 (2019).
  3. Jiang, X., Stockwell, B. R., Conrad, M. Ferroptosis: mechanisms, biology and role in disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (4), 266-282 (2021).
  4. Wenzel, S. E., et al. PEBP1 wardens ferroptosis by enabling lipoxygenase generation of lipid death signals. Cell. 171 (3), 628-641 (2017).
  5. Beshir, A. B., Argueta, C. E., Menikarachchi, L. C., Gascón, J. A., Fenteany, G. Locostatin disrupts association of Raf kinase inhibitor protein with binding proteins by modifying a conserved histidine residue in the ligand-binding pocket. Forum Immunopathol Dis Therap. 2 (1), 47-58 (2011).
  6. Janjusevic, M., et al. a disrupter of Raf kinase inhibitor protein, inhibits extracellular matrix production, proliferation, and migration in human uterine leiomyoma and myometrial cells. Fertil Steril. 106 (6), 1530-1538 (2016).
  7. Xiao, Z., et al. Reduction of lactoferrin aggravates neuronal ferroptosis after intracerebral hemorrhagic stroke in hyperglycemic mice. Redox Biol. 50, 102256(2022).
  8. Li, Q., et al. Inhibition of neuronal ferroptosis protects hemorrhagic brain. JCI Insight. 2 (7), e90777(2017).
  9. Zhou, Z. X., et al. Withaferin A inhibits ferroptosis and protects against intracerebral hemorrhage. Neural Regen Res. 18 (6), 1308-1315 (2023).
  10. Sun, Y., Li, Q., Guo, H., He, Q. Ferroptosis and iron metabolism after intracerebral hemorrhage. Cells. 12 (1), 90(2022).
  11. Duan, L., et al. Baicalin inhibits ferroptosis in intracerebral hemorrhage. Front Pharmacol. 12, 629379(2021).
  12. Wang, Y., Wu, S., Li, Q., Sun, H., Wang, H. Pharmacological inhibition of ferroptosis as a therapeutic target for neurodegenerative diseases and strokes. Adv Sci (Wein)h. 10 (24), e2300325(2023).
  13. Dodson, M., Castro-Portuguez, R., Zhang, D. D. NRF2 plays a critical role in mitigating lipid peroxidation and ferroptosis. Redox Biol. 23, 101107(2019).
  14. Xiang, Y., Song, X., Long, D. Ferroptosis regulation through Nrf2 and implications for neurodegenerative diseases. Arch Toxicol. 98 (3), 579-615 (2024).
  15. Anandhan, A., et al. NRF2 controls iron homeostasis and ferroptosis through HERC2 and VAMP8. Sci Adv. 9 (5), eade9585(2023).
  16. Fan, Z., et al. Nrf2-Keap1 pathway promotes cell proliferation and diminishes ferroptosis. Oncogenesis. 6 (8), e371(2017).
  17. Tu, W., Wang, H., Li, S., Liu, Q., Sha, H. The anti-inflammatory and anti-oxidant mechanisms of the Keap1/Nrf2/ARE signaling pathway in chronic diseases. Aging Dis. 10 (3), 637-651 (2019).
  18. Sun, Y. Y., et al. Remote ischemic conditioning attenuates oxidative stress and inflammation via the Nrf2/HO-1 pathway in MCAO mice. Redox Biol. 66, 102852(2023).
  19. Ge, M., et al. Brg1-mediated Nrf2/HO-1 pathway activation alleviates hepatic ischemia-reperfusion injury. Cell Death Dis. 8 (6), e2841(2017).
  20. Wang, H., et al. VDR activation attenuates renal tubular epithelial cell ferroptosis by regulating Nrf2/HO-1 signaling pathway in diabetic nephropathy. Adv Sci (Weinh). 11 (10), e2305563(2024).
  21. Lin, Q., et al. Mitophagy alleviates cisplatin-induced renal tubular epithelial cell ferroptosis through ROS/HO-1/GPX4 axis. Int J Biol Sci. 19 (4), 1192-1210 (2023).
  22. Jiang, T., et al. Gastrodin protects against glutamate-induced ferroptosis in HT-22 cells through Nrf2/HO-1 signaling pathway. Toxicol In Vitro. 62, 104715(2020).
  23. Gong, F., et al. Trehalose inhibits ferroptosis via NRF2/HO-1 pathway and promotes functional recovery in mice with spinal cord injury. Aging (Albany NY). 14 (7), 3216-3232 (2022).
  24. Luo, L., et al. Astaxanthin attenuates ferroptosis via Keap1-Nrf2/HO-1 signaling pathways in LPS-induced acute lung injury. Life Sci. 311 (Pt A), 121091(2022).
  25. Zhao, J., et al. PEBP1 acts as a rheostat between prosurvival autophagy and ferroptotic death in asthmatic epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (25), 14376-14385 (2020).
  26. Wang, H., Xu, L., Tang, X., Jiang, Z., Feng, X. Lipid peroxidation-induced ferroptosis as a therapeutic target for mitigating neuronal injury and inflammation in sepsis-associated encephalopathy: insights into the hippocampal PEBP1/15-LOX/GPX4 pathway. Lipids Health Dis. 23 (1), 128(2024).
  27. Manivarma, T., et al. Membrane regulation of 15LOX-1/PEBP1 complex prompts the generation of ferroptotic signals, oxygenated PEs. Free Radic Biol Med. 208, 458-467 (2023).
  28. Huang, W., et al. Downregulation of RKIP promotes radioresistance of nasopharyngeal carcinoma by activating NRF2/NQO1 axis via downregulating miR-450b-5p. Cell Death Dis. 11 (7), 504(2020).
  29. Al-Mulla, F., Bitar, M. S., Feng, J., Park, S., Yeung, K. C. A new model for Raf kinase inhibitory protein induced chemotherapeutic resistance. PLoS One. 7 (1), e29532(2012).
  30. Zuo, H., et al. RKIP-mediated NF-κB signaling is involved in ELF-MF-mediated improvement in AD rat. Int J Med Sci. 15 (14), 1658-1666 (2018).
  31. Liu, H., et al. RKIP promotes cisplatin-induced gastric cancer cell death through NF-κB/Snail pathway. Tumour Biol. 36 (3), 1445-1453 (2015).
  32. Casper, E. The crosstalk between Nrf2 and NF-κB pathways in coronary artery disease: can it be regulated by SIRT6. Life Sci. 330, 122007(2023).
  33. Hu, B., et al. NF-κB and Keap1 interaction represses Nrf2-mediated antioxidant response in rabbit hemorrhagic disease virus infection. J Virol. 94 (10), e00016-e00020 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

NRF2-routeHO-1-activatiePC12-cellenreactieve zuurstofverbindingenlipide hydroperoxideGPX4-expressieACSL4-expressie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.