Een multimodale breedveld-Fourier-transformatie Ramanmicroscoop

Samenvatting

Een grootveld-Fourier-transform microscoop, gebaseerd op een compacte en ultrastabiele birefringent interferometer, maakt het mogelijk om spectra parallel te verkrijgen voor alle pixels van een 2D-detector. De tijddomeinbenadering maakt het mogelijk fotoluminescentie- en Raman-signalen te ontwarren, en maakt snelle Raman-mapping mogelijk (~5 ms/pixel) met een ruimtelijke resolutie van ~1 μm en een spectrale resolutie van 23 ^cm-1 .

Samenvatting

Ramanmicroscopie is een krachtige techniek om de chemische samenstelling van een monster te bepalen. De grootste uitdaging van de geavanceerde spontane Raman-microscopen, gebaseerd op puntscanning frequentiedomeindetectie, is het verkrijgen van Ramankaarten van grote gebieden vanwege typisch lange pixel-dwell-tijden (0,1-1 s). De hier gepresenteerde grootveld-Fouriertransformatie (FT) microscoop maakt snelle meting van uitgebreide monsters mogelijk met een ruimtelijke resolutie van ~1 μm en een spectrale resolutie van ~23 ^cm-1 . Het is gebaseerd op een ultrastabiele en compacte gemeenschappelijke pad birefringent interferometer, toegevoegd langs het detectiepad van een commerciële microscoop, waardoor spectra voor alle pixels van een 2D-detector parallel worden verworven en de meettijd aanzienlijk wordt verminderd (10-100x sneller). De tijddomeinbenadering pakt effectief een andere beperking van de frequentiedomeintechniek aan, namelijk het loskoppelen van het Raman-signaal van de fotoluminescentieachtergrond, waarin het Raman-signaal mogelijk begraven is. Dit protocol beschrijft hoe hyperspectrale metingen worden uitgevoerd met een verbeterde commerciële microscoop: de uitlijning van het verlichtingsschema, de criteria voor het kiezen van meetparameters en de data-analyse om spectra op te halen en te onderzoeken.

Inleiding

Spectrale beeldvorming is een techniek die zowel spectrale als ruimtelijke informatie levert en is toegepast op diverse vakgebieden, van microscopie¹ tot remote sensing². Multispectrale en hyperspectrale beeldvorming worden onderscheiden op basis van of er voor elke pixel van een 2D-sensor enkele discrete spectrale banden of een continu spectrum worden geregistreerd. Ramanbeeldvorming is een bijzondere toepassing van spectrale beeldvorming.

Ramanverstrooiingsmicroscopie is een krachtige techniek om vibratiefrequenties ν_R van een systeem te meten. Vibratiemodi zijn geassocieerd met de chemische bindingen, en daarom maakt Ramanspectroscopie³ het mogelijk om de chemische samenstelling van monsters in biologische⁴ en materiaalkunde⁵ te onderzoeken. Bij spontane Ramanspectroscopie wordt het monster verlicht met monochromatische straling op frequentie ν₀, de zogenaamde pomp. Een deel van het pomplicht, dat interageert met de vibratiemodi, kan inelastische verstrooiing ondergaan, wat resulteert in fotonen bij frequenties ν_S (ν_AS=ν₀-(+) ν_R, waarbij ν_R de moleculaire vibratiefrequentie binnen het monster is. Het lager-energetische verstrooide licht (ν_S) wordt Stokes-straling genoemd, terwijl het energieniveau met hogere energie (ν_AS) de anti-Stokes-straling is. Bij thermisch evenwicht bezetten de meeste moleculen lagere energietoestanden, waardoor de anti-Stokes-componenten aanzienlijk zwakker zijn dan die van Stokes. Om deze reden detecteert Ramanverstrooiingsmicroscopie doorgaans Stokes-fotonen. Omdat moleculen en vaste stoffen meerdere vibratiemodi hebben, wordt het Raman-spectrum gekenmerkt door verschillende banden die samen een unieke chemische signatuur vormen, waardoor materiaalidentificatie en analyse mogelijk zijn. De belangrijkste uitdaging van deze aanpak is de extreem lage doorsnede van spontane Ramanverstrooiing, waarbij slechts één op de meer dan 10 9-10¹² fotonen dit proces ondergaat.

In een standaardconfiguratie van een Ramanverstrooiingsmicroscoop is het excitatielicht strak gefocust op één punt van het monster. Na het afstoten van de elastisch verstrooide pompfotonen (meestal met spectrale filters), wordt het resterende licht verzameld en gekarakteriseerd met een frequentiedomeinspectrometer (bijvoorbeeld dispersief rooster); De spectrale resolutie van deze apparaten kan ~0,5-1 ^cm-1 bereiken. De meting wordt herhaald voor elk punt (x,y) in het gezichtsveld (FOV) van een monster met een methode die punt- of rasterscanning⁶ wordt genoemd. Er zijn twee hoofdproblemen van deze benadering: (1) de lage doorsnede van spontane Ramanverstrooiing vereist doorgaans lange integratietijden (0,1-1 s) om voldoende fotonen te verzamelen voor elke pixel van de spectrometer, waardoor de Ramankaart van een uitgebreide steekproef lange meettijden kan vereisen; (2) de excitatie door het pomplicht veroorzaakt ook fotoluminescentie (PL), die overlapt met het spontane Raman-signaal en het vaak kan overweldigen.

Om de verwervingssnelheid te verhogen, is het mogelijk om de line-scanning 7-benadering toe te passen, waarbij de pomp wordt gefocust langs een lijn van het gezichtsveld (bijvoorbeeld bij coördinaat x) en het verzamelde signaal (PL- of Ramanverstrooiing) wordt verspreid door een spectrometer met een 2D-sensor, waardoor voor de gegeven coördinaat x een 2D-dataset ontstaat waarin de ene as overeenkomt met het spectrum en de andere met één ruimtelijke coördinaat y. Desalniettemin lijdt deze implementatie nog steeds onder de aanzienlijke verliezen die de ingangsspleet van de spectrometer introduceert, waarvan de smalle breedte een betere spectrale resolutie biedt, maar ook de hoeveelheid verzameld licht beperkt.

Een breedveldconfiguratie kan beter zijn om de meettijd te verkorten: met deze methode wordt een groot deel van het monster verlicht en wordt het spectrum gelijktijdig voor alle pixels van een 2D-sensor verkregen. In dit geval kan spectrale informatie worden verzameld door gebruik te maken van een set banddoorlaatfilters⁸ of een afstembaar spectraalfilter⁹ voor een monochrome beeldcamera. Ook is deze methode gebaseerd op een frequentiedomeinbenadering en verkrijgt slechts een discreet aantal spectrale banden.

Een alternatieve methode om een spectrum te meten is de Fouriertransformatie (FT) benadering. Het is een tijddomeintechniek gebaseerd op de stelling¹⁰ van Wiener-Kintchin, die stelt dat de vermogensspectrale dichtheid van een signaal de Fouriertransformatie is van zijn tijdsautocorrelatie. In de optica wordt dit in de praktijk verkregen door twee vertraagde replica's van de golfvorm te genereren met een interferometer. Hun interferentie wordt gemeten door een detector als functie van de relatieve vertraging, wat aanleiding geeft tot het zogenaamde interferogram¹¹. De FT-benadering wordt veel gebruikt om spectra in het infraroodspectrale gebied te meten, waar deze Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FTIR)¹² wordt genoemd. FTIR wordt routinematig gebruikt om het absorptiespectrum van vibratieovergangen in het midden-infrarood spectraal bereik (~2,5−25 μm golflengte) te meten.

De tijdsdomein-FT-benadering biedt enkele voordelen ten opzichte van conventionele dispersieve spectrometers: het bereikt een grotere doorvoer door het ontbreken van spleten (Jacquinot's etendue advantage¹²); Het biedt een flexibele spectrale resolutie, die alleen afhangt van het scanbereik. Bovendien is het goed geschikt voor grootveldconfiguraties: bij gebruik van een 2D-detector meet de methode zelfs één interferogram per pixel parallel, waardoor gelijktijdige opname van continue spectra over alle pixels mogelijk is. Aan de andere kant moet een FT-beeldvormingssysteem aan twee uitdagende eisen voldoen: (1) de relatieve vertraging tussen de twee lichtreplica's moet tot een klein deel van de optische cyclus worden geregeld; (2) de faseverschuiving tussen stralen die interfereren in een enkele pixel moet worden beperkt om een goede coherentie en dus een hoog contrast te garanderen. Sommige oplossingen zijn voorgesteld op basis van interferometers met gemeenschappelijke paden^{van 13, 14} of bijna¹⁵, maar die zijn nogal omslachtig of hebben een spectrale resolutie groter dan 100 ^cm-1.

In dit werk wordt een nieuwe grootveldmicroscoop beschreven, die het mogelijk maakt fotoluminescentie- en Ramanverstrooiingsbeelden te verkrijgen. Het innovatieve blok van dit systeem is een compacte en ultrastabiele gemeenschappelijke pad birefringent interferometer, genaamd Translating-Wedge-based Identical pulses eNcoding System (TWINS)¹⁶. Het biedt vertragingsscans van honderden optische cycli met een fasenauwkeurigheid van een klein deel van de optische cyclus zelf en hoge stabiliteit. De twee lichtreplica's hebben orthogonale polarisaties en reizen collinair door hetzelfde gemeenschappelijke pad, waardoor ze niet worden beïnvloed door padlengtefluctuaties, typisch voor een dubbelbundelinterferometer. Het schema, getoond in de inzet van Figuur 1, bestaat uit twee blokken dubbelbrekend kristal met orthogonale optische assen: één (B₂) met vaste lengte en de andere (B₁) die in twee wiggen zijn verdeeld die langs de gemeenschappelijke hypotenusrichting kunnen worden verplaatst. Invallend licht is gepolariseerd door P₁ op 45° ten opzichte van de optische as van het dubbelbrekende kristal, zodat de helft van de energie langs de gewone polarisatie zit en de andere helft langs de buitengewone polarisatie. Tijdens het bewegen langs de dubbelbrekende blokken accumuleren de twee orthogonale componenten een relatieve vertraging die fijn wordt aangepast door de totale dikte van blok B₁ te variëren door de invoeging van de wig te veranderen. De tweede polarisator P₂ projecteert de veldcomponenten naar een gemeenschappelijke lineaire polarisatie waardoor ze interfereerden. De vertraging τ tussen replica's hangt af van de wigverplaatsing x langs de gemeenschappelijke hypotenuse als (Vergelijking 1), met c lichtsnelheid, α apexhoek van de wiggen, Δn = n_{e-n o} verschil in gewone en buitengewone brekingsindexen (dubbelbreking). Aangezien de spectrale resolutie Δv omgekeerd evenredig is met het scanbereik T=|T_{2-T 1}|, met T₁, T₂ als initiële en uiteindelijke vertraging van het interferogram, vereist de hoge spectrale resolutie die door Raman-spectroscopie vereist is hoge dubbelbreking en lange wigtranslaties. Onder de meest voorkomende dubbelbrekende kristallen is YVO₄ (yttrium orthovanadate) bijzonder geschikt vanwege zijn hoge Δn- en transparantiebereik in het zichtbare-nabij-infrarood. De wiggen zijn ontworpen met een apexhoek van 10°, waardoor de interferometer met een scanlengte van 15,3 mm een vertraging van 2500 fs op 600 nm kan geven, met een spectrale resolutie van 23 ^cm-1, over het gehele spectrale bereik van belang (de gevoeligheid van de siliciumcamera vormt de bovengrens). Dit werk zal de strategie presenteren voor een juiste instelling van de interferogrambemonstering (d.w.z. stap- en scanbereik) om de gewenste spectrale resolutie te bereiken en om te gaan met de breedbandachtergrond, waarbij het Raman-signaal wordt losgekoppeld van fotoluminescentie.

Zoals beschreven door Candeo et ^al.17, kan deze dubbelbrekende spectrometer worden gekoppeld aan een commerciële optische microscoop om hyperspectrale metingen uit te voeren. De eisen zijn als volgt: een herconfigureerbare optische microscoopbehuizing, een TWINS birefringent interferometer, een low-noise monochrome camera (bijv. CCD of sCMOS) en een smalbandige laserbron. Voor laatstgenoemde zijn typische excitatiegolflengten voor Raman- en fluorescentiespectroscopie 355 nm, 488 nm, 514 nm, 532 nm, 633 nm en 785 nm. Hoewel lasers met hoge spectrale zuiverheid, zoals die in de Table of Materials, de beste keuze zijn, kan ook een laser met een bredere lijnbreedte, bijvoorbeeld ~0,1 nm, worden gebruikt, gezien de beperkte spectrale resolutie van het instrument. De microscoop wordt verbeterd door de TWINS in het detectiepad te plaatsen, tussen de buislens en de monochrome detector. Deze configuratie zorgt voor een uniforme padvertraging over het gezichtsveld en een gemiddeld contrast van 55%. Het excitatiepad is ontworpen om een uniforme verlichting van het monster te krijgen: in de praktijk wordt de uitgangstip van een groot-core multimodevezel op het monstervlak afgebeeld. Door gebruik te maken van een mechanische scrambler worden de modi sterk gekoppeld in de kern van de vezel, waardoor een vlakke profiel op het monstervlak ontstaat. Daarnaast maakt een trillende stemspoel het specklepatroon dat typisch is voor monochrome straling gemiddeld. Een karakterisering van deze hoge hoedverlichting is te zien in Aanvullende Figuur 1. De bundel wordt op het monster gefocust door een oneindig gecorrigeerd objectief, dat ook terugverstrooid Raman- en luminescentielicht richting het detectiepad verzamelt. De filters die nodig zijn om verlichting te weigeren, worden gedetailleerd.

Om te laten zien hoe breedband- en smalbandspectrale kenmerken met deze hyperspectrale microscoop kunnen worden gemeten, worden zowel luminescentie als Ramanverstrooiing gemeten voor een testmonster dat speciaal voor illustratieve doeleinden is geselecteerd. Het monster bestaat uit een mengsel van drie poederpigmenten met bekende Raman-spectra: twee polymorfen van titanium wit (TiO₂), namelijk rutiel en anatase, en cadmiumsulfide geel (CdS). Dezelfde procedure kan echter worden gebruikt voor een breder scala aan toepassingen, van materiaalkunde tot biologie.

Het doel van dit artikel is om de stappen voor het uitvoeren van een hyperspectrale meting te illustreren, terwijl de assemblage en uitlijning van de TWINS-interferometer worden beschreven door Candeo et ^al.17. Daarom zou een geïnteresseerde onderzoeker moeten beginnen met een vooraf geassembleerde interferometer gebaseerd op deze technologie.

Het protocol begint met de monstervoorbereiding en hoe de microscoop wordt ingesteld om de Ramanverstrooiing en PL-fotonen te exciteren en te verzamelen. Vervolgens worden de scanparameters (scanlengte, bemonsteringsstap) en acquisitieparameters (belichtingstijd, hardware-binning) ingesteld volgens de eisen van het te onderzoeken signaal. Tot slot wordt de post-processing pipeline gepresenteerd, waarin de procedure wordt beschreven om het spectrum bij elke pixel (spectrale hyperkubus, Figuur 2B) uit de verkregen temporele dataset (temporele hyperkubus, Figuur 2A) op te halen, en de algoritmen voor ruisreductie en geavanceerde spectrale analyse uiteenzet. De volledige workflow is weergegeven in Figuur 3.

Protocol

De reagentia en de gebruikte apparatuur in deze studie zijn vermeld in de Materiaalkunde.

1. Monstervoorbereiding

VOORZICHTIG: Draag latex handschoenen tijdens deze voorbereiding, omdat CdS-pigment giftig is, vooral bij inademing.

1. Gebruik een schraper om 20 mg van elk pigmentpoeder op een precisiebalans aan te brengen, waarmee je een verhouding van 1:1:1 krijgt.
   OPMERKING: Maak de schrapertip van elk monster zorgvuldig schoon om kruisbesmetting te voorkomen.
2. Meng het poeder met een vijzel om klonten te verwijderen.
3. Giet het resulterende mengsel op een microscoopglaasje; Gebruik de schrapertip om het voorzichtig te persen en verkrijg zo een bijna gelijkmatige dikte van de laag.
4. Breng nagellak aan op de randen van een microscoopdekmantel. Leg het op het mengsel, met de nagellak naar beneden, en druk genoeg om het te verzegelen. Laat het een paar seconden drogen om de lak te verharden.

2. Opstelling van de microscoop

VOORZICHTIG: Draag een veiligheidsbril wanneer de laser aan is, aangezien het maximale vermogen op het monstervlak 300 mW is.

OPMERKING: De prestaties van pomplasers blijven onaangetast door temperatuurvariaties, zolang deze binnen het temperatuurbereik wordt gebruikt dat in het datablad is gespecificeerd (bijvoorbeeld 10-40 °C voor de laser die in de materiaaltabel wordt gerapporteerd).

1. Lijn de TWINS-interferometer uit langs het detectiepad van de microscoop.
   OPMERKING: Zoals beschreven door Candeo et ^al.17, moet de interferometermodule tussen de buislens en de detector worden toegevoegd, zodat er een juiste afstand tussen hen is. Voor de microscoop die in dit werk wordt gebruikt, is dit alleen gegarandeerd wanneer de oculairmodule wordt verwijderd.
2. Om het Koehler-verlichtingsschema aan te passen aan laserexcitatie, verwijder je de ingebouwde excitatielamp van de microscoop en gebruik je een microscoopobjectief om het licht op te vangen aan de uitgang van een groot-core multimode vezel.
   OPMERKING: De objectievergroting bepaalt de grootte van het verlichtingspatroon wanneer de punt van de vezel is geconjugeerd met het monstervlak. Een mogelijke keuze is een doel van 10x/0,25-0,30.
3. Kies de excitatiegolflengte en focus de excitatielaser op de ingang van de groot-core multimode vezel. Zet de camera aan en start een visualisatiesoftware.
   1. Bevestig een middengedeelte van de vezel aan het trillende membraan van een stemspoel, waarmee de speckle wordt verwijderd. Mechanisch verwarren ze de vezel door hem strak te buigen om alle ruimtelijke modi samen te voegen. Zet de laser aan.
   2. Bereid een testmonster voor voor uitlijning, bijvoorbeeld fluorescerend rode markerstrepen op een microscoopdekmantel.
   3. Pas de positie van de vezeltip aan ten opzichte van het verlichtingsoptische systeem door de vezel met een precisietranslatiefase te bewegen om een plek met uniforme intensiteit en goed gedefinieerde randen op het monstervlak te krijgen.
      OPMERKING: Voor alle gerapporteerde metingen wordt een 532-nm laser gebruikt. Met een vezel van 400 μm kerngrootte bedekt de diameter van de spot 82% van de FOV-breedte van de camera.
4. Gebruik een filterset voor de excitatie- en detectiepaden, waarbij de volgende criteria worden toegepast (Aanvullende Figuur 2):
   1. Gebruik een smalbanddoorlaatfilter op 532 nm (2,0-nm bandbreedte) om de laserlijn schoon te maken en eventuele pompzijbanden te verwerpen die ontstaan door niet-lineaire verbreding door voortplanting in de vezel.
   2. Gebruik een dichroïsche spiegel (DM in Figuur 1) om het laserlicht naar het monster te reflecteren en de roodverschoven terugverstrooide straling die door het objectief wordt verzameld, door te laten.
   3. Gebruik een long-pass filter (LPF in Figuur 1) op 532 nm om restverlichting te weren.
   4. Gebruik tijdens Ramanverstrooiingsmetingen een kortdoorlaatfilter (SPF in Figuur 1) op 600 nm om achtergrondfluorescentie te onderdrukken.
5. Meet het vermogen op het monstervlak met een vermogensmeter. Verzwak de pompstraal om een intensiteit bij het monster te verkrijgen die geen schade veroorzaakt (van de orde 2 W/cm², zoals weergegeven in Tabel 1). Gebruik een sluiter voor de laser terwijl je de andere meetparameters instelt.
   OPMERKING: Vanwege de lage doorsnede van spontane Ramanverstrooiing is een hoge vermogensdichtheid nodig om signaalverzameling te verbeteren. Echter, de drempel voor de schade van het monster moet worden meegenomen. In tegenstelling tot puntscansystemen verlicht een breedveldopstelling een groot gebied, waardoor de stroomafvoer minder efficiënt wordt en zorgvuldig energiebeheer vereist is om monsterschade te voorkomen.
6. Zet het monster op het microscooppodium en stel de scherpstelling aan.
   OPMERKING: Om de focus gemakkelijk te vinden, verlicht je het monster eerst met een witte lamp in transmissie of reflectie. In dat laatste geval kon een gloeilamp naast de microscoop worden gebruikt. De monsterfocus wordt vervolgens geoptimaliseerd met het pomplaserlicht.

3. Meetparameters

1. Zet de driver van de motor aan die de wigtranslatie uitvoert. Bestuur de hardwarecomponenten (camera en motor) gelijktijdig om hyperspectrale metingen uit te voeren (voorbeeld van een gebruikersinterface weergegeven in aanvullende figuur 3).
2. Stel de camera-acquisitieparameters, belichtingstijd en hardwarebinning in om de signaalintensiteit te optimaliseren, waarbij je de volgende instructies volgt:
   1. Aangezien een hoge signaal-ruisverhouding (SNR) in het temporele signaal leidt tot een hoge SNR in de teruggewonnen spectra, geef voorkeur aan een lange belichtingstijd, die het sensordynamisch bereik beter vult.
      OPMERKING: Voor lage signalen, net als bij Ramanverstrooiing, moet men een compromis vinden tussen het signaalniveau en de totale meettijd: de langste belichtingstijd is mogelijk niet haalbaar.
   2. Kies voor hardware binning om lading van meer pixels te verzamelen voordat je het uitleest.
      OPMERKING: Het optellen van lading en het uitvoeren van één uitlezing geeft een betere ruisprestatie dan het uitlezen van meerdere pixels en vervolgens het optellen van hun signaal in de nabewerking. De keuze voor binning wordt ook bepaald door de acceptabele vermindering van de ruimtelijke resolutie.
3. Kies scanparameters, totale scanlengte en steekproefstap volgens de volgende criteria:
   1. Om een hoge spectrale resolutie voor Ramanpieken te bereiken, stel je een asymmetrische lange wigtranslatie in (-2526 fs→ -36 fs). Voer daarentegen een symmetrische scan uit rond de nulvertragingpositie (-65 fs → 65 fs) om meer breedbandspectrale kenmerken van het PL-signaal terug te krijgen.
   2. Met Vergelijking 1 voor vertraging τ als functie van wigtranslatie x, kies je de bemonsteringsstap om de Nyquist-limiet voor de spectrale bandbreedte van interesse te bereiken.
      OPMERKING: Gegeven de minimale golflengte van het spectrum λ_min, leg op (Vergelijking 2).
      
      waarbij de dubbelbreking Δn golflengteafhankelijk is (zie de vergelijkingen van Sellemeier).
4. Open de sluiter om met de laser op het monster te schijnen. Als er een afname van de signaalintensiteit wordt waargenomen, wacht dan tot het monster een stationaire toestand heeft bereikt (meestal enkele seconden).
   OPMERKING: Om de afname in signaalintensiteit te compenseren, pas je binning en belichtingstijd aan om een goede SNR te behouden.
5. Begin met het verkrijgen van een monochroom beeld voor elke wigpositie, d.w.z. de tijdsvertraging tussen replica's vanaf elk punt van de 2D-sensor.
   OPMERKING: De acquisitiesoftware moet twee variabelen opslaan: de temporele hypercube (2D-beeldset) en de vector van motorposities die door de encoder tijdens de scan worden vastgelegd.
6. Zodra de meting is voltooid, schakel je de laser uit en ga je verder met de data-analyse.

4. Verwerking van de verkregen datacube

1. Genereer de spectrale hypercube uit de verkregen dataset, volgens deze instructies:
   1. Laad het motorpositiecorrectiebestand voor de specifieke stappenmotor (zie de bespreking).
   2. Laad het frequentiekalibratiebestand van de specifieke interferometer om gemeten ruimtelijke frequenties (pseudofrequenties) te koppelen aan echte optische frequenties (zie de sectie Discussie).
   3. Kies het frequentiebereik voor de spectra die worden berekend door de interferogrammen van alle pixels met Fourier te transformeren.
   4. Onder de beschikbare apodisatiefuncties¹² voor het vensteren van het gemeten interferogram, kies degene die een goede afweging biedt tussen spectrale verbreding en artefactreductie in de teruggewonnen spectra, zoals het Happ-Genzel (Hamming) venster.
   5. Genereer de spectrale hyperkubus door de apodiseerde interferogrammen met Fourier te transformeren voor alle pixels. Sla het op in complexe waarden.
      OPMERKING: Het complexe spectrum van FT bevat extra informatie, wat nuttig zal zijn om de dataset te denoiseren en het gemiddelde spectrum van een set geselecteerde pixels te extraheren.
2. Zodra de spectrale hypercube is berekend, voer je verschillende onderzoeken uit, bijvoorbeeld het verkrijgen van het gemiddelde spectrum in geselecteerde gebieden; genereer een vals-kleur RGB-afbeelding; kaartspectrale pieken; Achtergrond aftrekken.
3. Om spectrale ruis te verminderen, die significante pieken kan overweldigen, vooral in Raman-spectra, implementeert u de Singular Value Decomposition (SVD)¹⁸ door deze stappen te volgen:
   1. Hervorm de temporele hyperkubus tot een matrix A met interferogrammen langs de rijen.
   2. Voer de SVD van de matrix uit, waarbij U-, S- en V-matrices worden verkrijgen zodanig dat A = USV^T is.
      OPMERKING: U-kolommen zijn de ruimtelijke verdelingen van de eigenvectoren van V (kolommen), terwijl S een diagonale matrix is met singuliere waarden (SV's) in aflopende volgorde.
   3. Hervorm elke kolom van U tot een matrix van pixels en voer de 2D FT uit om de ruimtelijke frequenties te verkrijgen.
   4. Aangezien hoge frequenties geassocieerd worden met zeer abrupte veranderingen in de afbeelding, beschouw ze als ruis; definieer een vierkante regio gecentreerd in de berekende Fourierruimte die lage (voornamelijk signaal) en hoge (voornamelijk ruis) frequenties scheidt.
      OPMERKING: Een mogelijke keuze voor dit gebied is een zijde van 1/4 ten opzichte van de grootte van de Fourierruimte.
   5. Bereken de ruimtelijke signaalverhouding (SSR) voor elke SV door de som van pixelintensiteiten (complexe modulus) binnen de grens te delen door de som van intensiteiten buiten de grens. Plot SSR als functie van het SV-nummer.
   6. Definieer een drempel voor SSR, dat wil zeggen het aantal significante SV's dat moet worden bijgehouden om ruisbijdragen in de dataset te verminderen en artefacten te vermijden.
      OPMERKING: SSR laat doorgaans een dalende trend zien die afvlakt in een plateau naarmate het aantal enkelvoudige waarden toeneemt. Een vuistregel is om singuliere waarden te behouden tot het punt waarop het plateau begint.
   7. Stel alle onderste SV's op nul in de diagonale matrix S, waardoor S_{ontruisd is,} en bereken een ongeruisde temporele hyperkubus als US_ontruisde V^T.
      OPMERKING: SVD is een matrixfactorisatie die ook kan worden toegepast op de hervormde spectrale hyperkubus (met rijen die spectra bevatten in plaats van interferogrammen).
4. Herhaal stappen 4.1-4.2 met de gedenoised temporele hypercube om de spectra terug te halen.
5. Download het programma via de link in Referentie¹⁹ om een diepere analyse van de dataset uit te voeren met het Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) algoritme.
   OPMERKING: Softwareontwikkelaars geven een gedetailleerde beschrijving van algoritme²⁰. Het is een iteratieve methode om het menganalyseprobleem op te lossen: elk spectrum wordt uitgedrukt als de lineaire combinatie van zuivere spectrale profielen. Met een matrixrepresentatie: B = C R^T+E, waarbij B de dataset is, C de concentraties voor elk spectrum bevat, kolommen van R de referentiespectra van de bestanddelen zijn, en E de fout uitdrukt.
   1. Hervorm de spectrale hyperkubus tot een matrix van N_pix x N_frequentie, met N pix totaal aantal pixels en N_frequentie vectorlengte van N_pix.
   2. Selecteer het aantal soorten dat in het monster wordt verwacht en laad hun referentiespectra.
      OPMERKING: Referentiespectra kunnen voor elk pigment afzonderlijk worden gemeten. Anders maakt het programma een SVD van de dataset en gebruikt het evenveel hoofdcomponenten als de geselecteerde bestanddelen voor de eerste schattingen.
   3. Selecteer beperkingen: teruggehaalde spectrale profielen moeten niet-negatief zijn en zo veel mogelijk lijken op referentiespectra.
   4. Plot de concentratiekaart (hervormde kolommen van C) en spectra (kolommen van R) voor elke soort.
   5. Exporteer deze kaarten en gebruik ze om een vals-kleur afbeelding te produceren (Figuur 4A), waarmee de analyse wordt afgerond.
      OPMERKING: De programma's die gebruikt zijn om de hier gepresenteerde resultaten te verkrijgen zijn niet openbaar beschikbaar, maar kunnen op verzoek van de auteurs worden verkregen.

Resultaten

Figuur 4A toont de Raman-kaart voor een geselecteerd gebied van het poedermengsel. Het is een vals-kleur weergave van de abundantiekaarten die met MCR-ALS zijn opgehaald, zoals beschreven in stap 4.5. Het geeft informatie over de samenstelling van het monster, aangezien de drie soorten duidelijk van elkaar te onderscheiden zijn binnen het gezichtsveld. Figuur 4B toont de gemiddelde spectra in de geselecteerde gebieden van de kaa...

Discussie

Er is een breedveld FT multimodale microscoop geïntroduceerd voor het verkrijgen van spontane Ramanverstrooiings- en luminescentiebeelden, en deze is toepasbaar in de materiaalkunde. De toepasbaarheid op biologische monsters wordt aangetoond door Candeo et ^al.17, die een hyperspectrale fluorescentieafbeelding van gekleurde menselijke cellen presenteren. De grootste uitdaging voor Ramanverstrooiingsmetingen in dit veld is het voorkomen van fotoschade als gevolg van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Anatase	Kronos	1200	Polymorf van wit TiO2 pigment
Cadmiumsulfidepoeder	Kremer Pigmente GmbH & Co.	21060	Cadmium geel, kleurindex donker/PY35
Camera	Andor	Luca R	Elektronen vermenigvuldigende CCD-camera met 1004x1002 pixels van 8µm x 8µm
Reinigingsfilter	Semrock	LL01-532-12.5	Ø1/2" 2,0 nm- FWHM laserlijnfilter bij 532 nm
Dekvlakken	BRAND GmbH & Co	4700 55	Borosilicaat glas 22x22x0,15 mm microscoopdekglazen
Dichroïc spiegel	Semrock	Di02-R532-25x36	25,2x35,6 mm enkele rand laser dichroïc splitser bij 532 nm
Vezel	Thorlabs	M74L05	400µm-kerngrootte, NA 0,39 multimodevezel
Laser	Hubner Photonics	Cobolt Samba 1000	CW diode gepompte laser bij 532 nm, maximaal vermogen 1000 mW
Lang doorlaatfilter	Semrock	LP03-532RU-25	Ultra steil lang doorlaatrandfilter bij 532 nm
Microscoop	Leica	DMRBE	Trinoculair onderzoeksmicroscoop
Objectief	Leica	PL-FLUOTAR, 10x/0.30	Excitatie- en opvangobjectief met 10x vergroting, 0,3 NA
Objectief	Newport	M-10X	Objectieflens in verlichtingspad, met 10x vergroting, 0,25 NA
Rutiel	Kronos	2900	Polymorf van wit TiO2 pigment
Korte doorlaatfilter	Thorlabs	FESH600	Ø25,0 mm doorlaatfilter met afsnijgolflengte 600
Glijmiddel	Marienfeld	1000612	76x26x1 mm microscoopglaasjes