Methodenartikel

Gedragsanalyse van locomotorische disfunctie bij Drosophila melanogaster als uitlezing voor neurotoxiciteit

DOI:

10.3791/68517

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1Center of Biotechnology of Azores (CBA), University of the Azores, 2Mesosystem Investigação & Investimentos by Spinpark

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol presenteert een high-throughput, kosteneffectieve methode voor het beoordelen van neurotoxiciteit in de fruitvlieg door middel van de kwantificering van locomotorische disfunctie als alternatief voor traditionele zoogdiermodellen. Het heeft tot doel de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties te evalueren met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig model.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol presenteert een kosteneffectieve methode met hoge doorvoer voor het beoordelen van neurotoxiciteit bij de fruitvlieg (Drosophila melanogaster) door locomotorische disfunctie te kwantificeren. Traditionele zoogdiermodellen zijn weliswaar effectief, maar arbeidsintensief en ethisch beperkt, wat de behoefte aan alternatieve in vivo-modellen benadrukt. De huidige aanpak integreert de klassieke klimtest met een real-time monitoringplatform om motorische stoornissen bij individuele vliegen vast te leggen. Dit gecombineerde systeem verbetert de gevoeligheid, automatisering en reproduceerbaarheid en biedt een schaalbare strategie voor neurotoxicologische screening. Kritieke procedurele stappen zijn onder meer gestandaardiseerde kweekomstandigheden, zorgvuldige anesthesie en behandeling om vliegensterfte of gedragsveranderingen te minimaliseren, en een goede kalibratie van het systeem. Voeding op basis van microcapillaire middelen maakt de optionele integratie van de kwantificering van de inname mogelijk, als aanvulling op de locomotorische analyse en waardoor de opname van het mengsel indien nodig kan worden geëvalueerd. De methode ondersteunt real-time en langdurige gedragsmonitoring, vermindert de vooringenomenheid van de waarnemer en maakt dagelijkse voortgangsevaluatie mogelijk zonder het experiment te onderbreken. Lichtvoorkeurstesten kunnen worden opgenomen met behulp van directe metingen. Het platform biedt aanzienlijke voordelen op het gebied van gedragsresolutie, doorvoer en gegevensconsistentie. Hoewel het geen real-time fluorescentiemogelijkheden heeft die in sommige alternatieve systemen worden aangetroffen, blijft het zeer effectief voor grootschalige gedragsscreening. Dit protocol is met name waardevol voor laboratoria die de neurotoxische effecten van farmaceutische verbindingen, milieuagentia of genetische modificaties willen beoordelen met behulp van een gevoelig, reproduceerbaar en ethisch gunstig in vivo model.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beoordeling van neurotoxiciteit is van cruciaal belang voor het evalueren van de mogelijke nadelige effecten van milieu- en farmaceutische verbindingen op het zich ontwikkelende zenuwstelsel1. Traditionele neurotoxiciteitstesten zijn gebaseerd op zoogdiermodellen, zoals knaagdieren, die duur, tijdrovend en ethisch beperkt zijn2. Daarom zijn alternatieve modellen nodig die een snelle, high-throughput screening van neurotoxische stoffen mogelijk maken3. Studies tonen aan dat de fruitvlieg naar voren is gekomen als een krachtig modelorganisme voor het bestuderen van neurotoxiciteit vanwege zijn goed gekarakteriseerde genetica, geconserveerde neurologische ontwikkelingsroutes en een korte levenscyclus 4,5. Onder de gedragseindpunten dient motorische disfunctie als een gevoelige en kwantificeerbare biomarker van neurologische ontwikkelingsstoornissen, waardoor neurotoxische effecten die kunnen correleren met menselijke neurologische aandoeningen vroegtijdig kunnen worden opgespoord6.

Locomotorische testen bij vliegen bieden een kwantificeerbare maat voor neurotoxiciteit en maken dosis-responsbeoordelingen mogelijk, waardoor ze relevant zijn voor het verminderen van het risico op neurotoxiciteit bij de mens7. De negatieve geotaxistest (klimmen) is een veelgebruikte benadering waarbij vliegen instinctief klimmen nadat ze naar de bodem van een flesje zijn getikt, wat hun niveau van motorische ontwikkeling, coördinatie en evenwicht weerspiegelt 8,9. Hoewel deze methode eenvoudig, kosteneffectief en nuttig is voor het beoordelen van ernstige locomotorische afwijkingen en openlijke verstoringen, biedt het alleen een eendimensionale evaluatie van beweging en kan het gevoeligheid missen bij het detecteren van subtiele motorische stoornissen, verfijnde veranderingen en langdurige gedragsmonitoring van symptomen veroorzaakt door neurotoxische middelen8. Om deze beperkingen aan te pakken, zijn meer geavanceerde technologieën voor het volgen van bewegingen, zoals het ethoscoopsysteem, ontwikkeld10. Dit geautomatiseerde opnamesysteem is een videovolgapparaat met hoge doorvoer dat speciaal is ontworpen om het gedrag van vliegen met hoge precisie en reproduceerbaarheid te analyseren11. In tegenstelling tot conventionele locomotorische testen, biedt dit systeem continue, real-time monitoring van bewegingen, waarbij subtiele gedragsafwijkingen worden vastgelegd die traditionele klimtesten over het hoofd kunnen zien 11,12,13. De technologie maakt gebruik van geautomatiseerde videotracking met behulp van een infrarood verlicht camerasysteem dat continu vliegbewegingen met hoge resolutie registreert, waardoor vooringenomenheid van de waarnemer wordt geëlimineerd en de experimentele reproduceerbaarheid wordt verbeterd13. Bovendien detecteert het microbewegingen, waarbij het lopen, rusten en fijne bewegingen zoals verzorgen, voeden of spiertrekkingen differentiëren, waardoor een meer gedetailleerde analyse van motorisch gedrag wordt verkregen13. Gedragsmonitoring op lange termijn is mogelijk, waardoor continue tracking over langere perioden mogelijk is, waardoor het ideaal is voor het beoordelen van progressieve neurotoxische effecten10. De schaalbaarheid en hoge doorvoercapaciteit van het video-opnamesysteem maken het mogelijk om meerdere vliegen parallel te volgen, waardoor de screening van meerdere neurotoxische verbindingen en genetische aandoeningen tegelijkertijd wordt vergemakkelijkt10. Bovendien integreert het systeem open-source software, waardoor onderzoekers analysepijplijnen kunnen aanpassen op basis van experimentele behoeften, waaronder slaap-waakcycli, circadiane ritmes en gedetailleerde locomotorische metrieken10,14. Recente ontwikkelingen, zoals de integratie van Ethoscopy, een op Python gebaseerd framework, hebben de data-analyse verbeterd, waardoor de toegankelijkheid en reproduceerbaarheid in gedragsstudies zijn verbeterd14. Dit raamwerk stelt onderzoekers in staat om complexere voortbewegingsanalyses uit te voeren en tegelijkertijd de barrières voor niet-deskundige gebruikers te verminderen. Het ethoscooplab, een op Jupyter gebaseerde omgeving, faciliteert verder naadloze gegevensverwerking, bevordert gezamenlijk onderzoek en zorgt voor experimentele reproduceerbaarheid14.

Door gebruik te maken van het high-throughput video-trackingplatform naast traditionele klimtesten, biedt deze studie een uitgebreide en gevoelige beoordeling van motorische disfunctie na blootstelling aan neurotoxische ontwikkelingsmiddelen. Het vermogen om fijnschalige locomotorische defecten te analyseren, maakt het een krachtig hulpmiddel voor het screenen van verbindingen die de neurale ontwikkeling en motorische coördinatie verstoren. Het gebruik van fruitvliegen voor screening op neurotoxiciteit biedt verschillende voordelen, waaronder kosteneffectiviteit en hoge doorvoercapaciteit, in vergelijking met modellen van gewervelde dieren, waar grootschalige screenings vaak beperkt zijn vanwege kostenbeperkingen15. Het vliegmodel maakt snelle genetische manipulaties mogelijk om ziektetoestanden na te bootsen en moleculaire routes te identificeren die worden beïnvloed door neurotoxinen16. Hoewel vliegen eenvoudiger zijn dan het zenuwstelsel van zoogdieren, behouden ze belangrijke geconserveerde routes die betrokken zijn bij neurale ontwikkeling en motorische controle17. Volgmethoden met hoge resolutie, zoals het real-time videorecordersysteem, verbeteren de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van de gegevens, waardoor motorische tekorten veroorzaakt door blootstelling aan giftige stoffen in een vroeg stadium kunnen worden opgespoord11.

De integratie van volgtechnologie en traditionele klimtesten maakte continue gedragsmonitoring met hoge resolutie mogelijk, wat een robuuste en schaalbare methode biedt om subtiele locomotorische stoornissen te detecteren die worden veroorzaakt door blootstelling aan neurotoxische stoffen. De combinatie van genetische hulpmiddelen, een korte levenscyclus en geavanceerde gedragsanalyse positioneert de fruitvlieg als een krachtig alternatief voor gewervelde modellen voor screening op neurotoxiciteit, wat uiteindelijk bijdraagt aan een veiligere ontwikkeling van geneesmiddelen en verbeterde milieurisicobeoordelingen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd bijvoorbeeld gebruikt om het neurotoxische potentieel van de Physalis physalis giffractie te evalueren. De controlegroep kreeg alleen de fysiologische buffer en de sacharoseoplossing zonder de teststof. Alle experimenten werden uitgevoerd op de W118-stam . Ethische goedkeuring is niet vereist voor experimenten met Drosophila, aangezien deze niet vallen onder de regelgeving voor dierenverzorging.

1. Reagentia en monstervoorbereiding

  1. Bereid een biologische buffer zoals PBS (10 mM, pH 7,0) of HEPES (10 mM, pH 7,0), afhankelijk van de vereisten van de specifieke test, en een 10 M stockoplossing van sucrose. Bereken het monstervolume op basis van het aantal replicaten en de duur van het experiment.
  2. Verdun het monster tot de gewenste concentratie met behulp van een biologische buffer, aangevuld met sacharoseoplossing tot een eindconcentratie van 1 M. Als het monster transparant is, kunt u de juiste kleurstof toevoegen (bijv. 0,1 mg/ml blauwe of rode kleurstof) om het voedingsgedrag visueel te beoordelen. In de huidige studie werd de giffractie van Physalia physalis met behulp van PBS verdund tot een eindconcentratie van 10 μg/μL en verder aangevuld met sacharoseoplossing en voedingskleurstof.
  3. Bereid een negatieve controleoplossing die alleen de buffer bevat en vul de oplossing aan met sacharose tot een eindconcentratie van 1 M en kleurstof voor levensmiddelen. In de huidige studie werd PBS aangevuld met sacharose en voedselkleurstof gebruikt als negatieve controleoplossing.
  4. Volg voor de fruitvliegmedia het protocol in18.

2. Onderhoud van biologisch materiaal

  1. Breng gezonde, geslachtsrijpe volwassen vliegen over in een fles met vers bereid voedselmedium. Om verder te gaan, tik je de vliegen tegen de bodem van de fles, open je deze en breng je ze door flesinversie over in een nieuwe fles met vliegenmedium. Plaats de fles in een broedmachine die is ingesteld op 25 °C met een licht-/donkercyclus van 12 uur en een luchtvochtigheid van 50%. Laat de vliegen 's nachts (ongeveer 16-22 uur) eieren leggen om voldoende gesynchroniseerde eieren te verzamelen.
  2. Gebruik na het leggen van de eieren een nieuwe fles met 70% ethanol om de volwassen vliegen weg te gooien. Dit voorkomt extra legeieren en zorgt voor synchronisatie in leeftijd, wat cruciaal is om een cohort volwassenen te verkrijgen met minimale leeftijdsvariatie.
  3. Om een gelijkmatige ontwikkeling te ondersteunen, moeten de flessen onder dezelfde gecontroleerde omstandigheden worden gehouden (25 °C, 12 uur licht-/donkercyclus, 50% vochtigheid). Volwassenen beginnen rond dag 9 of 10 te verschijnen. Het monitoren van de ontwikkelingsvoortgang kan helpen anticiperen op de timing van het opkomen van volwassenen.
  4. Houd de verzamelde vliegen onder dezelfde gecontroleerde omstandigheden totdat ze de gewenste leeftijd voor de test hebben bereikt. Gebruik ze binnen 24-48 uur na opkomst. Dit gecontroleerde verouderingsproces zorgt voor het minimaliseren van de variabiliteit en het verbeteren van de betrouwbaarheid van experimentele resultaten.

3. Negatieve geotaxis-test

OPMERKING: Een schematische weergave van de negatieve geotaxistest wordt weergegeven in aanvullende figuur 1.

  1. Breng de vliegen op de dag van het experiment voorzichtig over naar een lege fles.
  2. Vliegen moeten voorafgaand aan de overdracht kort op ijs worden verdoofd om beweging en hanteringsstress te minimaliseren. Plaats hiervoor de fles met de vliegen in een doos met ijs, die de hele fles bedekt.
  3. Tik na 1 minuut zachtjes op de fles om te controleren of alle vliegen verdoofd zijn. Houd ze nog 1 minuut op ijs om volledige anesthesie te garanderen zonder stress te veroorzaken of hun klimvermogen te beïnvloeden.
    OPMERKING: Houd er rekening mee dat bepaalde anesthetica, zoals CO2, het latere gedrag kunnen beïnvloeden, inclusief verminderd klimgedrag, en de resultaten van de negatieve geotaxistest kunnen beïnvloeden.
  4. Terwijl de vliegen worden verdoofd, maak je een kleinere bak gevuld met ijs klaar en plaats je een petrischaaltje of een vlak, schoon oppervlak op het ijs om een gekoeld platform te creëren. Deze opstelling helpt de anesthesie tijdens het sorteren te behouden en minimaliseert de beweging van vliegen bij herstel.
  5. Beoordeel de anesthesie door de volledige immobilisatie van de vliegen na 2 minuten op ijs te bevestigen. Eenmaal volledig verdoofd, brengt u vliegen voorzichtig over door de buis om te keren boven een gekoeld petrischaaltje en er zachtjes op te tikken om ze los te laten. Het koude oppervlak helpt om de vliegen tijdens het hanteren geïmmobiliseerd te houden.
  6. Gebruik een fijn penseel en onder een stereomicroscoop (bij een vergroting van 10x en 20x, indien beschikbaar) om mannelijke en vrouwelijke vliegen voorzichtig te scheiden op basis van onderscheidende kenmerken, zoals grootte en pigmentatiepatronen. Mannetjes zijn over het algemeen kleiner met brede zwarte banden, terwijl vrouwtjes groter zijn met lichtere, langwerpige buiken. Voer deze stap zo snel mogelijk uit om het effect van anesthesie op vliegen te minimaliseren.
    OPMERKING: Als seksedifferentiatie niet nodig is voor het experiment, laat dan de segregatiestap achterwege. Minimaliseer de blootstellingstijd en behandel de vliegen voorzichtig om stress en mogelijke gedragsveranderingen te verminderen.
  7. Breng de gesorteerde vliegen voorzichtig over in lege flesjes met de juiste toewijzing. Laat ze ongeveer 30 minuten herstellen van de anesthesie in een gecontroleerde omgeving (25 °C, 12 uur/12 uur licht/donkercyclus, 50% vochtigheid) voordat u verder gaat met de test.
  8. Gebruik voor de bereiding van microcapillaire voeding een pipet om handmatig 10 μl van de testoplossing in elke microcapillaire buis te laden. Zorg ervoor dat het volume consistent is in alle monsters om de voedingsomstandigheden te standaardiseren.
  9. Voeg met een pipet 3-5 μL minerale olie toe aan het open uiteinde van het microcapillair. Dit voorkomt dat het monster verdampt en lekt tijdens het experiment.
  10. Steek de voorgevulde microcapillairen door de gaten in de pluggen van de katoenen flacon en zorg ervoor dat ze stevig vastzitten. Gebruik indien nodig eerder afgeknipte punten om het katoen strak te passen zonder de luchtstroom te belemmeren.
  11. Plaats de injectieflacons met de vliegen in een broedmachine die is ingesteld op 25 °C met een licht/donkercyclus van 12 u/12 u. Laat ze voor de duur van het experiment staan en vervang de microhaarvaten dagelijks handmatig door vers bereid voedsel om een consistente blootstelling te garanderen. De blootstellingsperiode is afhankelijk van de toxiciteit en de aard van het monster en duurt doorgaans tussen 2 en 7 dagen.
  12. Breng de vliegen met tussenpozen van 12 uur over naar een schone, lege injectieflacon om de locomotorische activiteit te beoordelen.
  13. Meet en markeer een lijn op 7 cm vanaf de bodem van de injectieflacon met behulp van een permanente marker. Deze hoogte zal dienen als klimdoel.
  14. Plaats een camera of telefoon op een stabiele locatie om het klimgedrag vast te leggen. Zorg voor voldoende verlichting en een transparante achtergrond voor analyse. Controleer of de experimentele opstelling compatibel is met het gezichtsveld van de camera.
  15. Tik zachtjes op de injectieflacon om de vliegen naar de bodem te brengen en begin dan onmiddellijk met opnemen. Vermijd overmatige kracht die de vliegen zou kunnen verwonden of desoriënteren.
  16. Bekijk de opnames en meet de tijd die elke vlieg nodig heeft om de gemarkeerde lijn van 7 cm te bereiken. Stel een maximale tijdslimiet in (bijv. 30 s); Wijs deze tijd toe aan elke vlieg die de lijn niet bereikt.
  17. Let goed op abnormaal gedrag, zoals ongecoördineerde bewegingen, vertraagde start van het klimmen of onregelmatige klimpatronen. Deze symptomen kunnen wijzen op de neurotoxische effecten van de geteste verbinding.
    OPMERKING: Raadpleeg voor gedetailleerde instructies over de bereiding van het voer het protocol voor de Capillaire Feeder (CAFE) Test19. Deze methode biedt nauwkeurige richtlijnen voor het bereiden van vloeibare voedselbronnen voor fruitvliegjes, zorgt voor een nauwkeurige kwantificering van de voedselinname en minimaliseert de variabiliteit in voedingsexperimenten.

4. Realtime monitoringstests

OPMERKING: Voor de installatie, inclusief de schematische weergave van de componenten van het volgsysteem en het kalibratieprotocol, volgt u de eerdere publicaties11,12. Een algemeen overzicht van de experimenten is te vinden in Aanvullende Figuur 2.

  1. Real-time voortbewegingstest (Tracking-assay)
    1. Herhaal stap 3.8-3.9 om de voedingsmicrocapillairen voor te bereiden met het monster en de afdichting van minerale olie.
    2. Bereid de afzonderlijke voortbewegingskamers voor met behulp van doorzichtige plastic rietjes, elk ongeveer 6 cm lang. Deze rietjes dienen als kosteneffectieve en transparante behuizingen die geschikt zijn voor opnames. De buizen moeten compatibel zijn met de slaaparena11, die plaats biedt aan 20 buizen voor gedragsstudies met hoge doorvoer.
    3. Sluit het ene uiteinde van elk rietje af met een transparante folie en zorg voor een luchtdichte sluiting. Maak bij het afgedichte uiteinde een klein gaatje voor het inbrengen van het voedingsmicrocapillair. Zorg ervoor dat het gat groot genoeg is om het microcapillair stevig vast te houden zonder lekken of beweging te veroorzaken tijdens de test.
    4. Herhaal stap 3.1-3.6 om te verdoven, scheid eventueel af en plaats voorzichtig een verdoofde vlieg in elke buis met een fijn penseel. Sluit het open uiteinde van elke buis af met transparante folie of een katoenen plug, zodat de lucht kan stromen en de vliegen worden ingesloten.
    5. Plaats de geassembleerde buizen in de arena en zorg ervoor dat elk microcapillair naar buiten toegankelijk blijft voor dagelijkse vervanging. Plaats een voorgevuld microcapillair in elk buisje. Laat vliegen ongeveer 30 minuten herstellen en acclimatiseren voordat u met de test begint.
    6. Plaats het apparaat in een kamer met gecontroleerde omgevingsomstandigheden (bijv. 25 °C, 12 uur/12 uur licht-/donkercyclus, 50% luchtvochtigheid). Sluit het apparaat aan op het netwerk of het lokale volgsysteem.
    7. Ga naar het platform en zoek het apparaat dat aan het experiment is toegewezen. Zorg ervoor dat het systeem elke vlieg nauwkeurig volgt, zoals aangegeven door de markeringen. Voer alle relevante experimentele metadata in en begin met het opnemen van de test. Gebruik voor geavanceerde gegevensanalyse het rethomics-framework, een R-pakket dat is ontworpen voor gedragsgegevensanalyse met hoge doorvoer11,12.
    8. Vervang dagelijks voedsel in de microcapillairen door vers bereide oplossingen. Inspecteer elke vlieg dagelijks visueel om overleving en goed gedrag te garanderen gedurende de experimentele periode die doorgaans tussen de 3 en 5 dagen duurt.
  2. Circadiane ritme beoordeling
    1. Om het circadiane ritme van vliegen en hun mogelijke veranderingen te onderzoeken, moet u ervoor zorgen dat het experiment synchroon begint met een gedefinieerde licht/donker-cyclus. Houd tijdens de opnamefase een licht/12 uur donkere fotoperiode aan om verstoringen van de endogene ritmes te voorkomen. Zodra de voorwaarden zijn ingesteld, herhaalt u de stappen 4.1.1-4.1.8 en zorgt u ervoor dat alle procedures consistent worden uitgevoerd in de lichte/donkere fasen.
  3. Beoordeling van licht/donker voorkeursgedrag
    1. Herhaal stap 3.1-3.11 om vliegen en voedende microhaarvaten voor te bereiden.
    2. Zodra de voerflesjes zijn bereid, plaatst u ze in de couveuse zodat vliegen zich gedurende 2 uur (of een andere duur zoals bepaald door eerdere gegevens over de locomotorische activiteit) met het testmonster kunnen voeden.
    3. Om het lichtvoorkeursgedrag te beoordelen, bereidt u individuele voortbewegingskamers die 50% van elke buis bedekken voor met aluminiumfolie om een afgebakend donker gebied te creëren. Zorg voor een consistente dekking over alle buizen om een gestandaardiseerde vergelijking mogelijk te maken.
    4. Herhaal de stappen 4.1.2-4.1.4 om vliegen afzonderlijk in de voortbewegingskamers over te brengen, waarbij het inbrengen van microcapillairen wordt overgeslagen.
    5. Plaats de voorbereide buizen in de arena en laat de vliegen ongeveer 30 minuten acclimatiseren.
    6. Herhaal stap 4.1.6-4.1.7 en registreer het gedrag van de vliegen gedurende 60 minuten. Buizen waarin verminderde beweging wordt geregistreerd, kunnen duiden op een donkervoorkeur, aangezien het volgsysteem de vliegen in het met folie bedekte gebied niet detecteert om obstructie te signaleren.

5. Gegevensanalyse

  1. Bereid de metagegevenssjabloon voor door alle benodigde informatie op te nemen, zoals ID, behandeling, details van de verbinding, testduur en andere relevante variabelen. Een sjabloonvoorbeeld en de bijbehorende gegevensverwerkingspijplijn zijn opgenomen in aanvullende tabel 1.
  2. Sla het voltooide metagegevensbestand op in CSV-indeling. Om compatibiliteit te garanderen, opent u het CSV-bestand in een teksteditor om te controleren of het geen onnodige tekens of opmaakproblemen bevat. Verwijder eventuele overbodige tekens.
  3. Voordat u doorgaat met gegevensanalyse, maakt u een back-up van de gegevens. Open een terminal en voer de volgende opdracht uit: sudo python backup_tool.py. Deze stap beschermt de gegevens tegen mogelijk verlies of beschadiging tijdens de analyse.
  4. Identificeer en noteer de locatie van de gegevensbestanden die overeenkomen met het experiment. Zorg ervoor dat deze bestanden toegankelijk zijn voor analyse.
  5. Analyseer gegevens met behulp van Rethomics. Open RStudio en laad de benodigde Rethomics-pakketten voor analyse van gedragsgegevens. Gedetailleerde instructies en tutorials zijn beschikbaar op de Rethomics-website: https://rethomics.github.io/scopr.html

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol werd bijvoorbeeld gebruikt om het neurotoxische potentieel van de Physalis physalis giffractie te evalueren. De behandelde groep bestond uit vliegen die werden gevoed met een fysiologische buffer aangevuld met een sacharoseoplossing (tot een eindconcentratie van 1 M) en de testgiffractie. De controlegroep kreeg alleen de fysiologische buffer en de sacharoseoplossing zonder de teststof. Alle experimenten werden uitgevoerd op de W118-stam .

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de eerste plaats is het vaststellen van een niet-dodelijke (subletale) dosis een cruciale eerste stap voor het uitvoeren van de neurotoxiciteitsexperimenten. Dit zorgt ervoor dat de vliegen tijdens het onderzoek levensvatbaar blijven, waardoor gedrags- en locomotorische effecten kunnen worden waargenomen zonder de verstorende factor van mortaliteit. In onze studie werd de subletale dosis van de Physalia physalis giffractie bepaald op 10 μg/μL. Om robuuste en reproduceerbare r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteur Zuzanna Tomkielska was in dienst van Mesosystem S.A., en auteur Ana Casas is ook verbonden aan Mesosystem S.A. De overige auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd gefinancierd door het EEA Grants-project MOD. PN. FRM.059.PT.V03 — Physalia physalis: een innovatieve en onbenutte bron van cosmetische producten met een hoge toegevoegde waarde; door de "Pacto da Bioeconomia Azul" (projectnr. C644915664-00000026) binnen WP5 – Algae Vertical, gefinancierd door het Next Generation EU European Fund en het Portugese herstel- en veerkrachtplan (PRR); en door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) via CBA (UIDB/05292/2020 en UIDP/05292/2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aluminiumfolie --
Blauwe kleurstof  RAYNER-Rayners blauwe kleurstof 28ml
Camera Module 2 NoIRRaspberry Pi 096-4062Geleverd op Mauser.pt
Katoenen garenSigma-AldrichBR28205
Drosophila-voorraaddoosjesVWRVWRI734-1249Bottle Fly Round 60Z
Drosophila-buisjesVWRWRI734-2255
Glazen petrischaalSigma-AldrichBR455701
Micro-hematocriet capillairSigma-AldrichBR749321
MicroSD-kaart--Producent raadt het gebruik van een SD-kaart met minimaal 32GB opslagruimte aan voor Raspberry Pi OS-installaties
Micro-USB voedingRaspberry Pi 096-4585Geleverd op Mauser.pt
Mineraal olie BIO-RAD#1632129
Verfkwast--
Fosfaat gebufferde saliine (PBS)componenten afkomstig van verschillende bedrijven-Buffer gebruikt voor het bereiden van voedsel voor de controlegroep en gebruikt voor monsterverdunning; 10 mM pH 7
Stoppen voor Drosophila-buisjes en flessenVWRVWRI734-2875
Stoppen voor Drosophila-buisjes en flessenVWRVWRI734-2673
AfdichtingsfolieSigma-AldrichHS234526C
Single-board computer  (3 Model B)Raspberry Pi 096-5700Geleverd op Mauser.pt
SucroseSigma-AldrichS9378
Transparante plastic rietje--Alle die compatibel zijn met Ethoscopic sleep arena (6,5 cm x 0,5 cm)

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
  2. Bellen, H. J., Tong, C., Tsuda, H. 100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future. Nat Rev Neurosci. 11 (7), 514-522 (2010).
  3. Rand, M. D. Drosophotoxicology: the growing potential for Drosophila in neurotoxicology. Neurotoxicol Teratol. 32 (1), 74-83 (2010).
  4. Gupta, S. C., et al. Chlorpyrifos induces apoptosis and DNA damage in Drosophila through generation of reactive oxygen species. Ecotoxicol Environ Saf. 73 (6), 1415-1423 (2010).
  5. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. Lancet Neurol. 13 (3), 330-338 (2014).
  6. Bal-Price, A., et al. International STakeholder NETwork (ISTNET): creating a developmental neurotoxicity testing roadmap for regulatory purposes. Arch Toxicol. 89 (2), 269-287 (2015).
  7. Cabrita, R., et al. Motor dysfunction in Drosophila melanogaster as a biomarker for developmental neurotoxicity. iScience. 25 (7), 104541(2022).
  8. Mendes, C. S., Bartos, I., Akay, T., Márka, S., Mann, R. S. Quantification of gait parameters in freely walking wild-type and sensory deprived Drosophila melanogaster. Elife. 2, e00231(2013).
  9. Dubovický, M., et al. Evaluation of developmental neurotoxicity: some important issues focused on neurobehavioral development. Interdiscip Toxicol. 1 (3-4), 206-210 (2008).
  10. Pereira, T. D., Shaevitz, J. W., Murthy, M. Quantifying behavior to understand the brain. Nat Neurosci. 23 (12), 1537-1549 (2020).
  11. Geissmann, Q., et al. Ethoscopes: an open platform for high-throughput ethomics. PLoS Biol. 15 (10), e2003026(2017).
  12. Geissmann, Q., Garcia Rodriguez, L., Beckwith, E. J., Gilestro, G. F. Rethomics: an R framework to analyse high-throughput behavioural data. PLoS One. 14 (1), e0209331(2019).
  13. Blackhurst, L., Gilestro, G. F. Ethoscopy and ethoscope-lab: a framework for behavioural analysis to lower entrance barrier and aid reproducibility. Bioinform Adv. 3 (1), vbad132(2023).
  14. gilestrolab/ethoscopy. , https://github.com/gilestrolab/ethoscopy (2025).
  15. Bilder, D., Irvine, K. D. Taking stock of the Drosophila research ecosystem. Genetics. 206 (3), 1227-1236 (2017).
  16. Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (4), 504-523 (2010).
  17. Affleck, J. G., Walker, V. K. Drosophila as a model for developmental toxicology: using and extending the Drosophotoxicology model. Methods Mol Biol. 1965, 139-153 (2019).
  18. Frias, J., Simoes, N. Fruit Fly Potato Culture Media. protocols.io. , (2020).
  19. Diegelmann, S., et al. The Capillary Feeder (CAFE) Assay measures food intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), e55024(2017).
  20. Bartholomew, N. R., Burdett, J. M., VandenBrooks, J. M., Quinlan, M. C., Call, G. B. Impaired climbing and flight behaviour in Drosophila melanogaster following carbon dioxide anaesthesia. Sci Rep. 5, 15298(2015).
  21. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nat Protoc. 7 (5), 995-1007 (2012).
  22. Ardekani, R., et al. Using GFP Video to Track 3D Movement and Conditional Gene Expression in Free-Moving Flies. PLoS One. 7 (7), e40506(2012).
  23. Mackay, T. F. C., et al. The Drosophila melanogaster Genetic Reference Panel. Nature. 482, 173-178 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neurotoxiciteit bij Drosophilaklimtestgedragsscreeningreal time monitoringnegatieve geotaxisvoeding via microcapillarenmotorische beperkingactiviteitsregistratielichtvoorkeur

Gerelateerde artikelen