Toepassing van Dixon's op-en-neer-ontwerp om de minimale alveolaire concentratie van sevofluraan bij ratten te schatten met verfijnde bewegingsclassificatie

Samenvatting

Het hierin gepresenteerde protocol is bedoeld om de diepte van de anesthesie te evalueren met behulp van Dixon's Up-and-Down Design bij verdoofde ratten die worden onderworpen aan een gestandaardiseerde pijnprikkel. Bovendien schetst het een classificatie van de verschillende waargenomen bewegingspatronen.

Samenvatting

Bij het gebruik van vluchtige anesthetica is de standaardmaat voor de potentie de minimale alveolaire concentratie (MAC), gedefinieerd als de alveolaire concentratie waarbij 50% van de proefpersonen geen motorische reactie op een pijnlijke stimulus vertoont. In klinische en experimentele studies stelt de huidige consensus dat alleen "grove doelgerichte bewegingen" gelden als een positieve motorische respons en daarom kunnen duiden op een te milde sedatie. Het juiste niveau van anesthesie, zowel bij mensen als bij dieren, varieert echter individueel op basis van verschillende beïnvloedende factoren, zoals andere toegediende medicijnen. Er werden twee dierstudies bij ratten uitgevoerd om de effecten van tetrahydrocannabinol en ethanol op sevofluraan, een van de meest gebruikte vluchtige anesthetica, te onderzoeken. Om de MAC te schatten, werd Dixon's Up-and-Down Design gebruikt. Voor het eerste dier werd gekozen voor een vooraf bepaalde dosis sevofluraan. Na een evenwichtsperiode van 15 minuten werd een gestandaardiseerde pijnprikkel aangebracht op het distale derde deel van de staart van de rat met behulp van een chirurgische klem. De reactie van het dier op de stimulus werd gedocumenteerd als positief of negatief. Als er een positieve motorische reactie optrad, werd de dosis voor het volgende dier verhoogd. Omgekeerd, als de rat geen motorische respons vertoonde, werd de dosis voor het volgende dier verlaagd. Isotone regressie en de bootstrap-methode werden gebruikt om de MAC- en 95%-betrouwbaarheidsintervallen te schatten. Dit artikel schetst een gedetailleerd protocol voor het beoordelen van de anesthesiediepte bij ratten met behulp van het op-en-neer-ontwerp. Het biedt ook een nieuwe en gedetailleerde beschrijving en categorisering van bewegingspatronen bij verdoofde ratten wanneer een gestandaardiseerde pijnlijke stimulus wordt toegepast om de reproduceerbaarheid voor toekomstige studies te verbeteren.

Inleiding

Sevofluraan is een van de meest gebruikte vluchtige inhalatie-anesthetica¹. De potentie wordt beoordeeld aan de hand van de minimale alveolaire concentratie (MAC), die wordt gedefinieerd als de alveolaire concentratie waarbij 50% van de patiënten geen motorische respons vertoont op een pijnlijke stimulus ^2,3,4. Om de MAC vast te stellen, kunnen ratten worden gebruikt als diermodellen vanwege hun grotere homogeniteit in vergelijking met mensen. De pijnprikkel wordt meestal aangebracht met behulp van een chirurgische klem op het distale derde deel van de staart van de rat². Het gebruik van alternatieve methoden voor pijntesten zou geen garantie zijn voor vergelijkbaarheid met eerder uitgevoerde onderzoeken en zou daarom uiteenlopende resultaten kunnen opleveren. Vanwege de grote verscheidenheid aan bewegingspatronen als reactie op de stimulus, stelt de huidige consensus dat alleen "grove doelgerichte bewegingen" als positieve motorische reacties moeten worden beschouwd³. Deze definitie mist echter verdere verfijning met betrekking tot welke specifieke categorieën zouden kwalificeren als "gross purposeful" en in hoeverre een beweging aan dit criterium zou moeten voldoen. Dit is van het grootste belang, omdat een motorische reactie op een stimulus in een klinische setting kan wijzen op onvoldoende diepte van de sedatie.

Verschillende factoren zijn van invloed op de anesthesietoestand, waaronder leeftijd⁵, comorbiditeiten⁶, verminderde leverfunctie⁷ of onderkoeling⁸. Bovendien hebben de medicijnen die samen met anesthetica worden toegediend een aanzienlijke invloed op de diepte van de anesthesie. Fentanyl en propofol, die vaak tijdens de inductiefase worden gebruikt, verminderen bijvoorbeeld de benodigde hoeveelheid sevofluraan ^9,10. Bovendien is aangetoond dat lidocaïne of pregabaline de MAC van sevofluraan met^11,12 kan verlagen. Bovendien kan recente inname van alcohol of stoffen zoals tetrahydrocannabinol (THC) ook de MAC verlagen, waardoor de diepte van de anesthesie wordt verbeterd^13,14. Omgekeerd is gesuggereerd dat sympathicomimetica de sedatie kunnen verlichten door het centrale zenuwstelsel te stimuleren¹⁵.

Om de reproduceerbaarheid voor toekomstige studies te verbeteren, worden een gedetailleerd protocol en videobeschrijvingen verstrekt voor het beoordelen van de MAC bij ratten met behulp van Dixon's up-and-down design¹⁶ . In tegenstelling tot eerdere MAC-onderzoeken schetst dit protocol gedetailleerde procedurele stappen om de reproduceerbaarheid in laboratoria te ondersteunen. Bovendien werden videobeelden van twee eerder gepubliceerde onderzoeken opnieuw geanalyseerd en werden motorische reacties geclassificeerd op basis van hun omvang en patroon (gecoördineerde bewegingen - rollen, strekken, saltatorisch en ongecoördineerde beweging curling). Daarom biedt deze studie ook een innovatieve en grondige beschrijving en classificatie van bewegingspatronen bij gesedificeerde ratten als reactie op een gestandaardiseerde pijnlijke stimulus, met als doel de reproduceerbaarheid voor toekomstig onderzoek te verbeteren.

Protocol

Alle experimentele dierstudies zijn goedgekeurd door het Intramuraal Comité voor Dierproeven van de Medische Universiteit van Wenen en de bevoegde regelgevende instantie (Oostenrijks Federaal Ministerie van Vrouwen, Wetenschap en Onderzoek). De experimenten werden uitgevoerd onder constant aanhoudende anesthesie. De dieren nemen pijn niet bewust waar, zelfs niet als er een beweging zou plaatsvinden¹⁷. Volwassen Wistar-ratten in de leeftijd van 81 tot 95 dagen werden gebruikt.

1. Studiedieren en huisvesting

1. Huisvest de dieren op basis van gewicht en geslacht. Scheid mannetjes en vrouwtjes en huisvest ze minimaal 14 dagen voordat u met het experiment begint om acclimatisatie mogelijk te maken. Plaats maximaal drie ratten van meer dan 400 g of vier ratten van minder dan 400 g per kooi.
2. Handhaaf de omgevingscondities met een licht-donkercyclus van 12 uur, een omgevingstemperatuur van 22 °C en een luchtvochtigheid tussen 45% en 65%.
3. Weeg elk dier regelmatig en noteer het lichaamsgewicht vóór elke ingreep.
4. Dieren individueel vervoeren van de huisvesting naar de testfaciliteit. Bedek elke kooi met een doek om visuele stress te verminderen en huisvest niet-geteste dieren in een aparte ruimte om blootstelling aan experimentele procedures te voorkomen.

2. Installatie van de apparatuur

1. Controleer of alle benodigde apparatuur functioneel en beschikbaar is voordat u het experiment start. Voer apparatuurcontroles uit volgens institutionele richtlijnen of standaard operationele procedures, inclusief lektesten, kalibratie en vermogensfunctietests, indien van toepassing.
2. Gebruik een luchtdichte, transparante kamer (15 cm × 20 cm × 9 cm) voor het plaatsen van de rat. Zorg ervoor dat de kamer is uitgerust met een opening van 15 mm om de staart naar buiten te geleiden en gaslekkage tot een minimum te beperken.
3. Sluit de instroomleiding aan op een sevofluraanverdamper en een zuurstofbron.
4. Sluit de uitstroomleiding aan de andere kant van de kamer aan op zowel een gasafzuigsysteem als een anesthesiemonitor om sevofluraanconcentraties te registreren.
5. Controleer of de rectale thermometer, verwarmingsdeken en infrarood verwarmingslamp werken. Test de thermometer tegen een referentieapparaat, controleer of de verwarmingsdeken het doeltemperatuurbereik bereikt en controleer of de infraroodlamp aangaat en een stabiele output behoudt. Plaats de lamp direct boven de testkamer op een veilige afstand in overeenstemming met de lokale veiligheidsprocedures.
6. Bereid een arteriële klem van 25 cm voor die moet worden gebruikt voor de gestandaardiseerde pijnprikkel.

3. Voorbereiding van geneesmiddelen

1. THC-preparaat (optioneel)
   1. Gebruik een THC-formulering met een concentratie van 25 mg/ml. Bereken het benodigde volume voor elk dier door het lichaamsgewicht in kilogram te vermenigvuldigen met (10 mg/kg/25 mg/ml), wat resulteert in 0,4 ml per kg lichaamsgewicht.
   2. Gebruik een positieve verplaatsingspipet om het exacte berekende volume voor elk dier op te zuigen. In dit stadium niet toedienen. Bereid de pipet voor en zet deze opzij voor latere toediening tijdens de toedieningsstap van het geneesmiddel (zie stap 4.6).
   3. Gebruik een pipetpunt die geschikt is voor een maagsonde, zoals een pipetpunt die veilig tot 0,3 ml vloeistof kan bevatten. Voer de orale sonde rechtstreeks uit met behulp van de geladen pipet. Gooi de pipetpunt na elk gebruik weg om kruisbesmetting te voorkomen.
2. Ethanol preparaat (optioneel):
   1. Bereid ethanol in de vereiste doseringsconcentratie van 1 g/kg of 2 g/kg. Gebruik een sterk geconcentreerde formulering van ethanol (bijv. 96-100%) als basis en los deze op in 0,9% zoutoplossing tot een totaal volume van 10 ml/kg lichaamsgewicht voor elk individueel dier. Gebruik alleen dezelfde hoeveelheid zoutoplossing als de overeenkomstige placebo. Volg alle veiligheidsrichtlijnen van de instelling, met name die met betrekking tot de omgang met en opslag van ontvlambare stoffen.
   2. Gebruik een geschikte spuit (5 ml of 10 ml, afhankelijk van het gewicht van het dier) om het exacte berekende volume voor elk afzonderlijk dier op te zuigen. Dien de stof in dit stadium niet toe. Bereid de spuit voor en zet deze opzij voor intraperitoneale injectie tijdens de toedieningsstap van het geneesmiddel (zie stap 4.6). Bevestig een naald van 23 G voor toediening en bedek deze met een bijbehorende dop om letsel te voorkomen tot gebruik.

4. Toepassing van geneesmiddelen

1. Induceer anesthesie voor toediening van het geneesmiddel door de rat in de kamer te plaatsen en deze te overspoelen met 3,5 vol% sevofluraan in 100% zuurstof bij 3 l/min.
2. Wacht ongeveer 3-5 minuten totdat het dier visueel bewusteloos is.
3. Voer de oprichtreflextest uit door de kamer voorzichtig te kantelen om het dier op zijn rug te rollen. Als het niet probeert zichzelf binnen 10 seconden recht te zetten, neem dan voldoende diepte van anesthesie aan.
4. Verlaag de sevofluraanconcentratie tijdelijk tot 0 en spoel de kamer gedurende 15 s door met 100% zuurstof om de blootstelling aan anesthesiegas voor de onderzoeker te minimaliseren.
5. Haal het dier uit de kamer en plaats het voor een gastoevoerbuis die dezelfde sevofluraanconcentratie afgeeft om de anesthesie tijdens de toediening te behouden. Sla deze stap over als de toediening van de teststof kort genoeg is om herstel van de anesthesie te voorkomen.
6. Stoffen toedienen volgens experimenteel ontwerp: 10 mg/kg THC toedienen via maagsonde of intraperitoneaal 1 g/kg of 2 g/kg ethanol toedienen. Raadpleeg sectie 3 voor voorbereidingsdetails en volg de institutionele richtlijnen voor het uitvoeren van zowel maagsonde- als intraperitoneale toedieningsprocedures.
7. Breng het dier terug naar zijn kooi om te herstellen.
8. Wacht 1 uur voor ethanol en 2 uur voor THC voordat u verder gaat met de procedure.

5. Anesthesie-inductie voor MAC-testen

1. Plaats de rat na de wachttijd terug in de luchtdichte testkamer en overspoel deze met het vastberaden mengsel van sevofluraan en zuurstof. Zorg voor een constante zuurstofstroom van 3 L/min. Bepaal de individuele sevofluraanconcentratie (stap 9.1) voor elk dier, te beginnen met 2,6 vol% (of een ander vooraf bepaald startpunt op basis van statistische planning) voor het eerste dier in elke groep. Een gedetailleerde beschrijving van het Up-and-Down-Design wordt hieronder gegeven.
2. Zet de infrarood verwarmingslamp aan.
3. Wacht ongeveer 3-5 minuten totdat het dier visueel bewusteloos is.
4. Voer de oprichtreflextest uit door de kamer voorzichtig te kantelen om het dier op zijn rug te rollen. Als het niet probeert zichzelf binnen 10 seconden recht te zetten, neem dan voldoende diepte van anesthesie aan.
5. Verlaag de sevofluraanconcentratie tijdelijk tot 0 en spoel de kamer gedurende 15 s door met 100% zuurstof om de blootstelling aan anesthesiegas voor de onderzoeker te minimaliseren.
6. Open snel de kamer en plaats de rectale thermometer. Bewaak de kerntemperatuur van het lichaam tijdens de procedure en pas de intensiteit van de infrarood verwarmingslamp en de verwarmingsdeken dienovereenkomstig aan.
7. Leid de staart naar buiten via de kleine opening in de kamer.
8. Sluit de kamer snel.
9. Herstel onmiddellijk de gewenste sevofluraanconcentratie voordat u verder gaat.

6. Evenwichtstijd

1. Wacht een periode van 15 minuten om in evenwicht te komen.
2. Controleer continu de kerntemperatuur van het dier (37,2 °C ± 0,3 °C) en pas de verwarmingsapparaten dienovereenkomstig aan om normothermie te behouden.

7. Pijnprikkel

1. Identificeer het distale derde deel van de staart.
2. Pas de pijnprikkel toe door de klem in de derde stand te vergrendelen (ongeveer 50 N kracht).
3. Laat de klem in de derde stand vergrendeld totdat de rat een positieve bewegingsreactie vertoont, maar maximaal 1 minuut.
4. Noteer in het protocol de aan- of afwezigheid van een motorische reactie. Geef een korte beschrijving van de waargenomen beweging in termen van patroon en omvang. Zie punt 11 voor de classificatie van bewegingspatronen.

8. Herstel

1. Zet de verdamper en de verwarmingslamp uit en plaats de rat terug in de kooi.

9. Omhoog-en-neer ontwerp

1. Bepaal de sevofluraanconcentratie voor het volgende experiment met behulp van Dixon's Up-and-Down-Design. Als het vorige dier een motorische reactie op de stimulus vertoonde, verhoog dan de concentratie voor het volgende dier met 0,2%pt. Omgekeerd, als het vorige dier geen motorische respons vertoonde, verlaag dan de concentratie met 0,2%pt.

10. Euthanasie (indien van toepassing)

OPMERKING: Euthanasie is niet inherent een noodzakelijk onderdeel van de experimenten. De bevoegde Intramurale Commissie voor Dierproeven moet worden geraadpleegd. Voor de twee gerefereerde onderzoeken werd besloten om intracardiale bloedafnames uit te voeren en de dieren daarna te euthanaseren. De dieren werden niet teruggebracht naar de kooi zoals beschreven in stap 8.1, maar in plaats daarvan werd de procedure direct voortgezet met stap 9.1.

1. Bereid de euthanasieoplossing voor door 300 mg pentobarbital op te lossen in 1 ml zoutoplossing. Zuig de oplossing op in een spuit en houd deze na de bloedafname klaar voor onmiddellijk gebruik.
2. Haal de rat uit de doos en plaats hem voor een beademingsslang die 3,5 vol% sevofluraan in 100% zuurstof toedient om een constante anesthesie te behouden. Plaats het dier op zijn rug om onbelemmerde toegang tot het thoracale gebied mogelijk te maken.
3. Voer de intracardiale bloedafname uit met een naald van 23 g en een spuit van 5 ml. Tangpeer de hartslag voorzichtig met een vinger om het hart te lokaliseren. Steek de naald net caudaal in op de processus xiphoid, iets links van de middellijn en in een ondiepe hoek.
4. Aspireer voorzichtig terwijl u de positie van de naald aanpast totdat de bloedstroom wordt waargenomen. Verzamel het benodigde volume.
5. Nadat de bloedafname is voltooid, verwijdert u voorzichtig de spuit van de naald en bevestigt u de voorgeladen spuit met de pentobarbitaloplossing. Dien de volledige 1 ml van de oplossing intracardiaal toe om euthanasie te garanderen in overeenstemming met de ethische richtlijnen van de instelling.

11. Voortzetting van de experimenten

1. Herhaal het experiment vanaf stap 3 voor elk proefdier afzonderlijk.

12. Classificatie van bewegingspatronen (optioneel)

1. Classificeer gedragsreacties in de volgende categorieën:
   1. Rollen: Classificeren als rollend wanneer de gedragsreactie een axiale rotatie van het lichaam inhoudt, meestal langs de lengteas.
   2. Rekken: Classificeren als rekken wanneer de gedragsreactie wordt gekenmerkt door een bilaterale, symmetrische buitenwaartse extensie van de ledematen en het lichaam.
   3. Saltatorische beweging: Classificeren als saltatoire beweging wanneer de gedragsreactie bestaat uit plotselinge, op de achterpoten gerichte trappen of schokken die lijken op korte, huppelachtige uitbarstingen van het hele lichaam.
   4. Curling: Classificeren als curling wanneer de gedragsreactie ongecoördineerde, naar binnen gerichte beweging van verschillende intensiteit omvat, waardoor het lichaam naar het midden buigt.

Resultaten

In het THC-onderzoek was de bootstrap-schatting van de MAC 2,8 vol% in de controlegroep (95% BI: 2,7-2,9 vol%) en 2,1 vol% in de 10 mg/kg THC-groep (95% BI: 1,8-2,4 vol%)¹³.

In de ethanolstudie was de geschatte MAC 2,24 vol% in de controlegroep (95% BI: 1,97-2,94 vol%). In de groep met 1 g/kg ethanol was het 1,65 vol% (95% BI: 1,40-1,98 vol%) en in de 2 g/kg ethanolgroep 1,08 vol% (95% BI: 0,73-1,42 vol%)¹⁴. Het ...

Discussie

Deze studie verfijnt het protocol voor het bepalen van de MAC van sevofluraan bij ratten door kritische methodologische stappen in detail te beschrijven en gemeenschappelijke uitdagingen aan te pakken om bij te dragen aan een meer gestandaardiseerde en reproduceerbare aanpak voor het beoordelen van de anesthesiediepte.

Nauwkeurige MAC-bepaling is essentieel voor zowel experimentele als klinische anesthesiepraktijken. Dit werk draagt bij aan de bestaande litera...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Luchtdichte transparante kamer	N/A	N/A	Generiek
Arteriële klem	KLS Martin	13-410-22-07	25 cm
Draeger Primus	Dräger Austria GmbH	Primus
Draeger Vapor 2000	Dräger Austria GmbH	Vapor 2000
Homeotherme dekenregelunit	Harvard Apparatus, Holliston, Massachusetts, USA	50-7137	230 V
Handmatige mobiele babywarmer	Fisher/Paykel, Auckland, Nieuw-Zeeland	IW9210/920