Methodenartikel

In vitro Reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's)

2.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68530

⸱

20 juni 2025

 ,  , 
1Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel introduceert een eenvoudige reconstitutie in één pot van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden reuzenblaasjes. De methode kan worden veralgemeend en toegepast op inkapseling of opsluiting van een breed scala aan biomoleculen.

Samenvatting

Biomimetische lipidemembranen in de vorm van gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) worden vaak gebruikt om het gedrag van celmembranen na te bootsen vanwege het gemak van eiwitreconstitutie in GUV's, visualisatie en het begrijpen van de dynamiek van cellulair membraan-eiwit. Celmembranen bestaan echter uit lipidevlotten (of domeinen) die voortkomen uit de aanwezigheid van verschillende lipiden in het celmembraan. Een dergelijke verhoogde complexiteit in modelsystemen kan worden opgenomen om te resulteren in fasegescheiden GUV's, waar de lipidensamenstelling nauwkeurig kan worden afgestemd. Hoewel inkapselingsmethoden voor het genereren van homogene GUV's algemeen bekend zijn, zijn methoden om eiwitten in fasegescheiden GUV's in te kapselen beperkt. Hier presenteert dit protocol een vereenvoudigde eenpotproductie van fasegescheiden GUV's, bestaande uit vloeistofverstoorde (Ld) en vloeistofgeordende (Lo) domeinen, waarbij verschillende cytoskeletale eiwitten, d.w.z. FtsZ en actine, efficiënt worden ingekapseld, waardoor de methode een veelzijdig hulpmiddel is voor minimale celproductie. Concreet maakt deze aanpak gebruik van een protocol voor emulsieoverdracht om GUV's te produceren met een hoge inkapselingsefficiëntie. Bij deze methode wordt eerst een lipide-monolaag gegenereerd door een eiwitoplossing te emulgeren in een lipide/oliemengsel, waarbij lipiden van verschillende faseovergangstemperaturen worden gekozen om fasescheiding in de resulterende GUV's te verkrijgen. Deze emulsie wordt voorzichtig overgebracht op een lipide-in-olie-oplossing in een andere buis, wat resulteert in de vorming van een water-olie-interface. De oplossing wordt vervolgens gecentrifugeerd bij verhoogde temperaturen (idealiter bij 37 °C om de eiwitactiviteit te behouden), waarna GUV's worden verzameld voor beeldvorming. Deze methode vereenvoudigt de in vitro reconstitutie van cytoskeleteiwitten binnen fasegescheiden GUV's zonder gebruik te maken van een omslachtige laboratoriumopstelling, en dient dus als een handige methode voor het bestuderen van de mechanica van cytoskelet-membraaninteracties in opsluiting.

Inleiding

Gigantische blaasjes dienen als modelsystemen om cellulaire functies te begrijpen 1,2. Hun gemak van productie, visualisatie, afstembaarheid en in vitro reconstitutie van biomoleculen maken deze biomimetische modellen tot het voorkeurssysteem voor veel onderzoeken 3,4,5. Er zijn verschillende bekende methoden om GUV's te maken, zoals elektroformatie6, cDICE 7,8, emulsieoverdracht en andere op microfluïdische gebaseerde methoden 9,10. De productie van GUV's met dergelijke methoden wordt gerapporteerd in de literatuur 3,11. Bovendien is in vitro de reconstitutie van cytoskeletale netwerken in GUV's eerder beschreven met behulp van een emulsieoverdrachtsmethode vanwege het gemak van deze eenpotvormingsmethode, die geen complexe opstelling vereist12. Een dergelijke reconstitutie wordt echter zeer vaak gerapporteerd bij homogene GUV's, een systeem dat de complexiteit van cellulaire membranen niet volledig nabootst.

Dit protocol beschrijft de in vitro reconstitutie van cytoskeletale netwerken in fasegescheiden GUV's, waarbij de complexiteit van het lipidemembraan wordt aangetoond. Hoewel eerder is gemeld dat dergelijke netwerken binden aan het oppervlak van het membraan (buitenkant), maar niet beperkt zijn tot de gigantische blaasjes13,14, richt de huidige emulsieoverdrachtstechniek zich op het protocol om fasescheiding te verkrijgen en de activiteit van de netwerkvorming van het cytoskelet te behouden. Een van de grootste uitdagingen bij deze techniek is de temperatuur. Standaard productiemethoden voor het genereren van fasegescheiden GUV's vereisen het gebruik van verhoogde temperaturen, die variëren afhankelijk van de faseovergangstemperatuur van de samenstellende lipiden. Cytoskeletale eiwitten zijn echter niet in staat om bij zulke hoge temperaturen te polymeriseren tot structuren van hogere orde 15,16,17. Dit protocol maakt dus niet alleen gebruik van een lipidesamenstelling om fasescheiding in GUV's bij kamertemperatuur te verkrijgen, maar optimaliseert ook de omstandigheden om een goede opbrengst van GUV's bij fysiologische temperaturen te produceren.

Een ander aspect waarmee rekening moet worden gehouden bij het produceren van gereconstitueerde GUV-systemen is het volume van de ingekapselde biomoleculen dat nodig is. Voor de meeste eiwitten kan het produceren van grotere volumes duur en tijdrovend zijn, waarbij meerdere zuiveringsrondes nodig zijn. Bovendien vereisen in vitro reconstitutie-experimenten over het algemeen een eerste verkennende fase waarin de biomolecuulconcentraties, buffersamenstellingen, enz. eerst worden getest om een geoptimaliseerd gehalte aan inwendige oplossing te bereiken. Dit protocol optimaliseert dus het GUV-productieprotocol voor twee verschillende testen, die zich aanpassen aan de bovengenoemde premissen. Aan de ene kant beschrijft dit protocol één test die het standaard protocol voor omgekeerde emulsie optimaliseert, waarbij relatief grotere hoeveelheden eiwitten betrokken zijn en GUV-productie met een hoge opbrengst wordt gegenereerd in buisjes, die later worden overgebracht naar beeldvorming van platen met 96 putjes. Aan de andere kant optimaliseert de hier beschreven aanpak ook het protocol voor fasegescheiden GUV-productie rechtstreeks in beeldvormingsputplaten, waarbij lagere volumes biomoleculen worden gebruikt (~1/4 van de hoeveelheden die nodig zijn voor productie in buizen) en GUV-generatie in serie mogelijk maakt, waardoor veel ingekapselde omstandigheden in één centrifugatiestap worden bereikt. Het hier gepresenteerde protocol toont dus één inkapselingsmethode, maar stelt de gebruiker in staat om beide instellingen te kiezen op basis van hun vereisten.

Bovendien beschrijft dit protocol een geoptimaliseerde methode voor inkapseling voor twee verschillende cytoskeletale netwerken: FtsZ en actine. Aangezien deze twee eiwitten verschillende buffer- en verdringingscondities vereisen, behandelt het protocol de daaropvolgende noodzakelijke veranderingen om een optimale netwerkreconstitutie te bereiken. Daarom kan de hier gepresenteerde benadering worden gebruikt en gegeneraliseerd voor het inkapselen van alle vereiste biomoleculen in fasegescheiden GUV's.

Protocol

De reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van het lipidenmengsel

  1. Neem 0,5 ml chloroform in een glazen injectieflacon van 5 ml. Voeg 17,5 μL DOPC, 7,4 μL DOPG, 29,6 μL DPPC toe (allemaal van 25 g/L lipide voorraden bereid in chloroform), 32,2 μL 10 g/L DPPG en 20,6 μL 18 g/L Cholesterol. Voeg 1,2 μL 1 g/L Atto655-DOPE kleurstof toe. Draai het lipidenmengsel voorzichtig voort en verdamp de chloroform onder stikstofstroom en suspendeer de dunne film opnieuw in een totaal van 400 μL chloroform.
  2. Voor de inkapseling van FtsZ is de uiteindelijke bereide lipidenmix in de verhouding DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol (17.499: 7.5: 31.5: 13.5: 30 mol ratio) gelabeld met 0.001 mol% Atto655-DOPE. Voor de productie van GUV's met ingekapseld gebundeld actine bevat de lipidenmix gebiotinyleerde lipiden en wordt deze bereid in de verhouding DOPC: DOPG: DPPC: DPPG: Chol: Biotinyl CAP PE (17.499: 7.5: 30.5: 13.5: 30: 1) gelabeld met 0.001 mol% Atto655-DOPE.
  3. Los het lipidenmengsel (32 mM, 50 μL) op in chloroform en droog in een glazen injectieflacon onder N2 gasstroom gedurende ~15 min.
  4. De glazen injectieflacon wordt vervolgens ~30 minuten onder vacuüm in een exsiccator bewaard om eventuele sporen van resterende chloroform te verwijderen.
  5. Dispergeer de gedroogde film in een mengsel van decaan (20 μl) en minerale olie (500 μl) in de glazen injectieflacon om de uiteindelijke concentratie van 3.2 mM te verkrijgen en sonificeer bij verhoogde temperaturen (~50 °C) gedurende ~30 minuten met behulp van een badsonicator.
  6. Breng het lipide-in-oliemengsel over in een tube en incubeer de tube ~10 minuten bij 37 °C voordat je doorgaat met de volgende stappen.
  7. Bereid de inkapselingsmix voor eiwitten voor.

2. Bereiding van inwendige oplossingen voor inkapseling

  1. FtsZ filament mengsel
    1. Bereid het FtsZ-eiwitmengsel in een totaal volume van 10 μL in een microbuisje. Voeg voor het FtsZ filamenteuze netwerk 0,87 μL 23 μM FtsZ-YFP-mts, 1,31 μL 381 g/L Ficoll70, 1,11 μL 271 g/L BSA en 1 μL 25 mM GTP toe aan 5,71 μL FtsZ reactiebuffer (RB). Het totale volume van de oplossing is 10 μL met 2 μM FtsZ-YFP-mts, 50 g/L Ficoll70, 30 g/L BSA en 2,5 mM GTP in de uiteindelijke oplossing. Bewaar het op ijs voordat u het gebruikt voor inkapseling in GUV's.
      OPMERKING: FtsZ-reactiebuffer (RB) bevat 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM GluK, 5 mM GluMg.
  2. Actine-bundel mengsel
    1. Voor de inkapseling van actinebundels wordt eerst een 10 μL actine mastermix (A-Mix) bereid met 86% G-actine, 10% Atto488-actine en 4% gebiotinyleerde actine in water. Bereid voor deze stap eiwitvoorraadoplossingen volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens voor een eindconcentratie van 35,42 μM A-Mix 6,39 μ l 2 g/l G-actine, 1,48 μl 1 g/l atto488-actine, 1,19 μl 0,5 g/l gebiotinyleerde actine en 0,9 μl H2O toe.
    2. Om prepolymerisatie en bundeling van actine buiten de GUV's te voorkomen, bereidt u de uiteindelijke actineoplossing minuten voor de inkapseling. De uiteindelijke oplossing bestaat uit 7% jodixanol, 0,01 g/l neutravidine, 2,4 μM A-Mix, 0,6 μM fascin, 10 g/l BSA, 20 g/l Ficoll70 en 5 mM ATP in actinepolymerisatiebuffer.
      1. Om deze eindoplossing te bereiden, die te allen tijde op ijs moet worden bewaard, voegt u in de volgende volgorde toe: 2,92 μl 60% jodigananol, 10,25 μl H2O, 2,5 μl 0,1 g/l neutravidine, 0,92 μl 271 g/l BSA, 1,31 μl 381 g/l Ficoll70, 2,5 μl 10x actinepolymerisatiebuffer, 1,69 μL van 35,42 μM A-Mix, 1,65 μL van 9 μM Fascin en 1,25 μL van 100 mM ATP. Meng goed en neem snel de 5 μL die nodig is om in te kapselen.
        LET OP: meet de osmolariteit van deze binnenoplossing met een osmometer (~430 mOsm/Kg). Een overeenkomend mengsel van buitenoplossing met dezelfde osmolariteit moet worden bereid door glucose in water te verdunnen tot dezelfde osmolariteitswaarde is bereikt (zie stap 3.2). 10x Actinepolymerisatiebuffer bevat 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 500 mM KCl en 50 mM MgCl2.

3. Productie van GUV's en inkapseling in vitro

  1. GUV-productie in buizen: inkapseling van FtsZ
    1. Voeg voor FtsZ-inkapseling 500 μL FtsZ-reactiebuffer (RB) toe in een plastic buis van 1,5 ml en voeg voorzichtig 200 μL lipide-in-oliemengsel toe (bereid in stap 1.6 hierboven) om de vorming van een olie-waterinterface en de afzetting van een lipidemonolaag op dit grensvlak mogelijk te maken.
    2. Om de emulsie te vormen, neem je eerst nog een tube van 1,5 ml en voeg je 200 μL lipide-in-olie toe. Incubeer deze buis bij 37 °C gedurende ~10 minuten voordat u de emulsie vormt.
    3. Eenmaal geïncubeerd, voeg je 5 μL van de FtsZ-eiwitmix (bereid in 2.1.1) toe aan deze buis. Het eiwit van 5 μL in waterige media zakt als een druppel naar de bodem van de buis.
    4. Maak een emulsie door 5-6 keer zachtjes op de bodem van de tube te tikken totdat de oplossing zichtbaar troebel wordt.
    5. Piket deze emulsie voorzichtig en plaats deze op de olie-waterinterface (voorbereid in stap 3.1.1 hierboven).
    6. Centrifugeer dit op 6000 x g gedurende 30 minuten bij een voorverwarmde temperatuur van 37 °C en houd deze temperatuur aan tot het einde van de blaasjesproductie.
    7. Laat het monster bijna 30 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat u het beeldt.
    8. Verwijder de bovenste olielaag door voorzichtig vanaf de bovenkant van de buis te pipetteren, zodat er bijna 100-200 μL oplossing overblijft voor beeldvorming.
    9. Knip met een schaar een pipetpunt in een schuine hoek af en neem voorzichtig 50-100 μL van de GUV-oplossing van de bodem van de buis. Deze oplossing zal worden gebruikt voor beeldvorming.
  2. GUV-productie direct in platen met 96 putjes: inkapseling van actine
    1. Voor het inkapselen van actine moet eerst een mengsel van de buitenste oplossing (glucose in water) worden bereid met dezelfde osmolariteit als het inwendig actinemengsel. Om overeen te komen met de ~430 mOsm/kg van het binnenmengsel, maakt u een mengsel van buitenoplossing door 198 μl 2 M glucose toe te voegen in 802 μl H2O.
    2. Om de blaasjes direct op een putje te maken, passivert u eerst een putje van een plaat met 96 putjes. Voeg 100 μL 10 g/L BSA toe aan het putje en incubeer gedurende 10-15 min. Was het putje vervolgens vijf keer met 100 μL buitenoplossing en zorg ervoor dat u de gepassiveerde glazen bodem niet met de pipetpunt aanraakt. Laat 100 μL van de buitenste oplossing in de put zitten na het wassen.
    3. Voeg voorzichtig 50 μL lipide-in-oliemengsel toe aan het putje om de lipidemonolaag bovenop de buitenste oplossing voor te bereiden. Om een correcte afzetting van de olie bovenop de waterfase te garanderen, laat u de pipetpunt aan één kant van de put rusten en laat u de olie van de wand van de put glijden.
    4. Om de emulsie te vormen, neemt u eerst een tube van 1,5 ml en voegt u 100 μL lipide-in-olie toe. Incubeer deze buis bij 37 °C gedurende ~10 minuten voordat u de emulsie vormt.
    5. Voeg 2,5 μl van de uiteindelijke actineoplossing (uit stap 2.2.2) toe aan de buis met 100 μl lipide-in-oliemengsel (stap 1.6 hierboven). Het eiwit van 2,5 μL in waterige media zakt als een druppel naar de bodem van de buis.
    6. Maak een emulsie door 10-20 keer zachtjes op de bodem van de tube te tikken totdat de oplossing zichtbaar troebel wordt.
    7. Piket deze emulsie voorzichtig en plaats deze op de olie-waterinterface (voorbereid in stap 3.2.3 hierboven). Dompel de punt van de pipet voorzichtig onder in het midden van de oliemonolaag en leg de emulsie af. De emulsie vormt een troebele wolk die opgesloten zit in de fase van de oliemonolaag.
    8. Centrifugeer de plaat met 96 putjes op 200 x g gedurende 20 minuten bij een voorverwarmde temperatuur van 37 °C en houd deze temperatuur aan tot het einde van de blaasjesproductie.
      OPMERKING: Centrifugeer op 400 x g gedurende 10 minuten om de productietijd van blaasjes te verkorten. Houd u echter aan deze centrifugatieparameters voor het beste resultaat. Centrifugatie boven 400 x g resulteert in verdichte blaasjes met lipideaggregaten die zich ophopen op de bodem van de beeldplaat.
    9. Laat het monster bijna 30 minuten afkoelen tot kamertemperatuur voordat u het beeldt.
      OPMERKING: Directe beeldvorming kan worden uitgevoerd op een put zonder dat de bovenste laag olie hoeft te worden verwijderd of de blaasjes naar een andere kamer/put hoeven te worden overgebracht.

4. Beeldvorming en 3D-beeldreconstructie

  1. Neem een 96 beeldvormende putplaat en passiveer deze ~10 minuten met BSA voordat u het monster naar de beeldputplaat overbrengt (zie stap 3.2.2).
  2. Breng de GUV-oplossing over op de gepassiveerde putplaat.
  3. Plaats de putplaat op het podium van een omgekeerde confocale microscoop op een 40x waterobjectief.
  4. Richt u op een interessegebied (ROI) en neem een z-stack-afbeeldingsreeks van de gekozen ROI met vaste z-stapintervallen. Het protocol resulteert in GUV's met een grootte van 5-30 μm, zodat het interval naar behoefte kan worden vastgesteld op 0,5-1 μm.
  5. Sla elke z-stack-afbeeldingsreeks op in .tiff indeling.
  6. Open een interessante afbeeldingsreeks in een beeldverwerkingssoftware (ImageJ/Fiji). Identificeer het beeld met de hoogste intensiteit. Houd ctrl+shift+c ingedrukt om het venster Helderheid en contrast te openen en klik op Auto.
  7. Ga in het menu ImageJ/Fiji naar Analyze > Set Scale en voer de bekende fysieke afstand en de eenheid ervan in voor elke afbeeldingspixel.
  8. Ga in het menu ImageJ/Fiji naar Image > Stacks > Z-project om een 3D-afbeelding te reconstrueren op basis van de z-stack. Stel het projectietype in als standaarddeviatie. De standaardopties kunnen worden gebruikt voor de rest van de instellingen (Segment starten en segment stoppen).
    OPMERKING: pas op voor projectieartefacten met standaarddeviatie die voortkomen uit overlappende z-stacks in 3D-reconstructie. Om ervoor te zorgen dat er geen artefacten zijn, verwijdert u z-stacks in de onderste helft van de bol om alleen de projectie van de bovenste helft te observeren.

5. Statistische analyse van de GUV-frequentie op basis van grootte

  1. Verkrijg Z-stack-afbeeldingen van de GUV's die van belang zijn, zoals uitgelegd in stap 4.4 en 4.5. Om zoveel mogelijk GUV's in een breed gezichtsveld in beeld te brengen, verkrijg je confocale stapels met 1x of 2x zoom.
  2. Open de Z-stack-sequenties in een beeldverwerkingssoftware (in dit geval ImageJ/Fiji), zoals uitgelegd in 4.6.
  3. Selecteer het weergavekanaal waar het membraanfluorescentiesignaal is verkregen door op de balk met het label c onder de afbeelding te klikken. Pas de helderheid en het contrast van het beeld aan zoals uitgelegd in 4.6.
  4. Navigeer door de verschillende verworven vlakken door op de z-balk onder de geopende afbeelding te klikken. Selecteer het vlak waar de diameter van het te analyseren blaasje het grootst is.
  5. Open de ROI-manager in ImageJ/Fiji door te klikken op Analyseer > tools > ROI-manager.
  6. Klik uit de tools die beschikbaar zijn in het hoofdpaneel van ImageJ/Fiji op de ovale selectie.
  7. Teken een cirkel die bij de GUV past door de fluorescentie-intensiteit van het GUV-membraan te volgen. Als u een cirkel wilt selecteren, drukt u op de Shift-toets en sleept u de muis om de cirkel uit te breiden tot de grootte van het blaasje. De cirkelselectie kan worden verplaatst door tegelijkertijd met de linkermuisknop op het midden van het blaasje te klikken en de muis naar de gewenste locatie te slepen.
  8. Sla de cirkelselectie op die in de ROI Manager is getekend door op Toevoegen [t] te klikken, in het optiepaneel van de ROI Manager.
  9. Om de grootte van het blaasje in microns te verkrijgen, klikt u op Meten op het paneel van de ROI Manager. Er verschijnt een nieuw venster. Neem de waarde die wordt weergegeven in de kolom Major of Minor (beide kolommen moeten dezelfde waarde hebben als ze verwijzen naar ellipsassen) als de maat voor de diameter van het blaasje.
  10. Gebruik plotsoftware (Excel, Origin, Prism) om een staafdiagram te maken waarin de fractie van GUV's voor verschillende groottebereiken wordt gespecificeerd.

Resultaten

Als eerste stap werden GUV's met membraanfasescheiding geproduceerd volgens een aangepaste omgekeerde emulsiebenadering (Figuur 1A). Dit resulteert in een hoge opbrengst van GUV's, die een membraan vertonen dat is vermengd in Ld -en Llo-domeinen, zoals weergegeven door het Atto 655-DOPE-label op het Ld-domein en donkere gebieden die overeenkomen met niet-gelabeldeLo-domeinen (Figuur 1B). Deze methode levert fasegescheiden GUV's op met een grootte van 5-30 μm (Figuur 1C) bij verhoogde temperaturen (alle stappen worden uitgevoerd bij 37 °C en afgebeeld bij RT). Bovendien werden de centrifugatiesnelheden aangepast om de opname van de oorspronkelijke componentlipiden in GUV's te garanderen en om overmatige overbevolking te voorkomen.

Om de succesvolle inkapseling van biomoleculen aan te tonen met behulp van de emulsiemethode die in het huidige protocol wordt beschreven, werden bovendien zowel FtsZ- als actinenetwerken in individuele experimenten gereconstitueerd. FtsZ-netwerken worden gerecapituleerd in GUV's, die naar voren komen als filamenten die bij voorkeur binden aan Ld-domeinen via hun membraantargetingsequentie (MTS) in aanwezigheid van 2,5 mM GTP en 50 g/L Ficoll70 (zoals weergegeven in figuur 2). De netwerken werden ongeveer 1 uur na de inkapselingsstap geobserveerd. Actomyosinenetwerken verschijnen echter als dunne bundels (in tegenstelling tot dikke netwerken van FtsZ) na reconstitutie in GUV's (Figuur 3). Opgemerkt moet worden dat gebiotinyleerde lipiden een cruciale rol spelen bij de binding van de actomyosinenetwerken aan het membraan van de GUV's. Zonder gebiotinyleerde lipiden kunnen actomyosinebundels geen gebogen configuratie aannemen en blijven ze als rechte, korte en stijve bundels bij het lumen in plaats van zich aan het membraan te hechten als een verstrengeld netwerk van lange bundels (Figuur 4).

In het gewijzigde emulsieprotocol wordt de centrifugatiesnelheid aangepast om fasegescheiden GUV's te verkrijgen, zoals eerder vermeld. Hogere centrifugatiesnelheden met monsters die actomyosinenetwerken bevatten (600 x g gedurende 15 minuten) resulteren inderdaad in de aggregatie van blaasjes tot een weefselachtige configuratie in de productieput. In alle standaard reconstitutie-experimenten van actomyosinenetwerken werd de optimale centrifugatiesnelheid dus ingesteld op 200 x g om niet-geaggregeerde GUV's te verkrijgen (Figuur 5).

figure-results-1
Figuur 1: Eenpotgeneratie van fasegescheiden GUV's met behulp van de dubbele emulsieoverdrachtsmethode. (A) Experimenteel schema van de belangrijkste stappen in de eenpotproductie van fasegescheiden blaasjes via dubbele emulsieoverdracht. (B) Confocaal Z-projectiebeeld van de resulterende GUV's gegenereerd volgens de methode beschreven in A. Schaalbalk is 50 μm. (C) Staafdiagram met de fractie van fasegescheiden GUV's gegenereerd op basis van hun diameter. Uitgevoerde experimenten n = 3, het totale aantal geanalyseerde GUV's per experiment = 100. Gegevens weergegeven als gemiddelde waarden, individuele gegevenspunten zijn de drie onafhankelijke experimenten. Foutbalken geven de standaarddeviatie van de drie experimenten weer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Fasegescheiden blaasjes met ingekapselde FtsZ-netwerken. (A) Confocale 3D-projectiebeelden uitgevoerd op een volledig verworven z-stack van een fasegescheiden GUV die een FtsZ-netwerk bevat. (B) Confocale Z-projectiebeelden die alleen op de bovenste helft van het blaasje worden uitgevoerd. Vanwege de heterogene vorming van domeinen over het oppervlak van de GUV, toont de 3D-reconstructie van de verkregen confocale plakjes de overlapping van lipidedomeinen vanaf de bovenste en onderste delen van het blaasje. Om overlapping te voorkomen en de visuele inspectie van de domeinen te vergemakkelijken, wordt de onderste helft van de verkregen z-stacks uit het bestand verwijderd. De resulterende bovenste helft wordt vervolgens gebruikt voor zijn 3D-projectie via standaarddeviatie. Schaalbalken zijn beide 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Fasegescheiden blaasjes met ingekapselde actomyosinenetwerken. (A) Confocale Z-projectiebeelden van een volledige verworven stapel met een uitzoomweergave van de put na de productie van de blaasjes. De hoge opbrengst aan blaasjes maakt het mogelijk om verschillende actomyosinestructuren in de blaasjes te bestuderen. De schaalbalk is 50 μm. (B) Confocale Z-projectiebeelden uitgevoerd op de bovenste helft van een blaasje. Om de visuele analyse van lipidendomeinen te vergemakkelijken, wordt alleen de bovenste helft van de beeldsegmenten gebruikt om een 3D-projectie uit te voeren. De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Belang van gebiotinyleerde lipiden voor de vorming van membraangebonden actomyosinenetwerken in fasegescheiden blaasjes. Confocale 3D-projecties van fasegescheiden blaasjes met niet-gehechte actomyosinenetwerken. Als gebiotinyleerde lipiden niet in het mengsel worden opgenomen, vormen actomyosinestructuren zich in het lumen en krijgen ze geen gebogen configuratie op het binnenste blad van de blaasjes (rechterpaneel, actine gelabeld met Atto488). De schaalbalk is 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Effect van de centrifugatiesnelheid op de productie van fasegescheiden blaasjes via emulsieoverdracht. Confocale 2D-beelden van een GUV-monster dat is gegenereerd door gebruik te maken van een centrifugatiekracht van 600 x g gedurende 15 minuten. De gebruikte centrifugatiesnelheid, hoger dan de geoptimaliseerde 200 x g, resulteert in de aggregatie van blaasjes tot een weefselachtige configuratie in de put. De schaalbalk is 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Discussie

Een van de grootste uitdagingen voor in vitro reconstitutie van membraangebaseerde modelsystemen is de inkapseling van eiwitten in fasegescheiden GUV's als gevolg van hun bereiding bij hoge temperaturen. Het genereren van dit type fasegescheiden blaasjes via synthese in één pot kan inderdaad leiden tot problemen die voortvloeien uit de afbraak van eiwitten bij verhoogde temperaturen. Dit protocol beschrijft dus de geoptimaliseerde omstandigheden om membraanfasescheiding te observeren volgens de dubbele emulsiemethode voor GUV-productie bij fysiologische temperaturen, terwijl tegelijkertijd de activiteit van de ingekapselde eiwitten behouden blijft. Deze benadering introduceert een negatieve lading in beide domeinen om de binding van alle gewenste eiwitten te vergemakkelijken wanneer elektrostatische interacties een vereiste zijn. In het geval van inkapseling van FtsZ, ondanks de aanwezigheid van negatieve lading in beide domeinen, ontwikkelen en binden de cytoskeletale netwerken zich bij voorkeur aan Ld-domeinen , wat aangeeft dat naast negatieve lading ook vloeibaarheid van het membraan een essentiële vereiste is voor eiwitbinding18. Bovendien ontwikkelen de netwerken zich in het geval van actine-inkapseling over membraangebieden waar gebiotinyleerde lipiden worden opgenomen19.

Hoewel de emulsietransfertest veel wordt gebruikt in de literatuur, is deze alleen toegepast op de productie van homogene GUV's. Dit protocol bestaat daarom uit verschillende gewijzigde aspecten van de test, die de observatie van domeinvorming in het membraan mogelijk maken. Een van de belangrijkste aspecten in dit opzicht is de temperatuur. Om domeinen te observeren en om de functionaliteit van de eiwitten (met name de vorming van cytoskeletale netwerken) te behouden, gebruikt dit protocol 37 °C om GUV's te produceren. Aan de ene kant, wanneer GUV's bij een hogere temperatuur worden geproduceerd, verliezen de ingekapselde eiwitten hun functionaliteit, bevinden ze zich in het lumen en polymeriseren ze niet in structuren van hogere orde. Aan de andere kant, als GUV's bij een lagere temperatuur worden geproduceerd, wordt er geen fasescheiding waargenomen in het membraan. Zo wordt 37 °C de optimale temperatuur voor de productie van GUV in de experimenten.

Het is belangrijk op te merken dat dit protocol twee mogelijke testsystemen biedt om GUV's te produceren volgens hetzelfde emulsieoverdrachtsprincipe: in buizen en putplaten. Beide hebben voor- en nadelen, waarmee de gebruiker mogelijk rekening moet houden tijdens de experimentele planningsfase om te bepalen welk systeem het beste bij zijn behoeften past. Kunststof buizen hebben immers geen centrifuge nodig die is uitgerust met een rotor voor putplaten, ze zijn gemakkelijker te hanteren en maken controle mogelijk over de verdunningsfactor van de blaasjes na productie en vóór beeldvorming. Ze vereisen echter grotere volumes (voor zowel de olie- als de waterige fase) en verwijdering van de olielaag na productie voor GUV-extractie, waardoor olieresten in de beeldvormingsput kunnen achterblijven als deze stap niet zorgvuldig wordt uitgevoerd. Als alternatief vereisen putplaten het gebruik van een kleiner monstervolume, maken ze de inkapseling van verschillende inwendige omstandigheden in serie en tegelijk mogelijk en vereisen ze geen GUV-extractie, omdat blaasjes direct na productie in dezelfde productieput kunnen worden afgebeeld. Het grootste nadeel van putplaten is de aggregatie van blaasjes en de noodzaak om centrifugatieparameters aan te passen om een vergelijkbare productieopbrengst van blaasjes te bereiken als die waargenomen in buizen.

Onafhankelijk van het gebruikte inkapselingssysteem (buizen of putplaten), toont deze benadering aan dat optimale verdringingsomstandigheden nodig zijn om de GUV's te produceren en om de polymerisatie van ingekapselde eiwitten te vergemakkelijken. In het bijzonder, volgens dit protocol, werd de beste conditie voor GUV's met ingekapseld FtsZ waargenomen met 30 g/L BSA en 50 g/L Ficoll7018; terwijl voor actine een mengsel van 10 g/L BSA, 7% Jodivananol en 20 g/L Ficoll70 nodig was19.

Een ander belangrijk aspect van de productie van GUV is de centrifugatiesnelheid en -tijd. Voor de vorming van FtsZ-netwerken onder de bovengenoemde crowding-concentraties levert centrifugeren bij 6000 x g gedurende 30 minuten een populatie GUV's op die goed verdeeld en gescheiden zijn over de beeldvormende putplaat. Omgekeerd maakt 200 x g gedurende 20 minuten voor actine het genereren van een hoog GUV-productierendement mogelijk. Als de centrifugatiesnelheid of -tijd wordt verlaagd, wordt de opbrengst van GUV's beïnvloed, terwijl een verhoging van de centrifugatiesnelheid boven de genoemde waarden leidt tot aggregatie van GUV's. Onder de genoemde omstandigheden genereert dit protocol GUV's met een maximale inkapselingsefficiëntie, evenals individuele GUV's die niet aan elkaar plakken.

Hoewel dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar alle lipiden en ingekapselde biomoleculen, dicteren de gewenste membraansamenstelling en de inhoud van de blaasjes de centrifugatieparameters, die het genereren van fasegescheiden blaasjes mogelijk maken. Daarom dient dit protocol als richtlijn om de productie van diverse blaasjes met membraandomeinen mogelijk te maken.

Dergelijke methodologieën van in vitro reconstitutie binnen fasegescheiden GUV's zijn cruciaal om de ingewikkelde eiwit-membraandynamiek te begrijpen die wordt gemedieerd door lipidedomeinen, rekening houdend met de complexiteit van de celmembranen14. De kleine omvang en de zeer dynamische aard van deze lipidedomeinen maken de karakterisering van grensvlakinteracties in vivo moeilijk. Daarom dienen GUV's als een essentieel hulpmiddel vanwege hun relatieve gemak van bereiding en fysisch-chemische modulatie, evenals hun geschiktheid voor analyse door lichtmicroscopie20.

Bovendien biedt de inkapseling van functionele moleculen binnen heterogene bio-interfaces veelbelovende toepassingen op het gebied van nanogeneeskunde. In het bijzonder de ontwikkeling van gefunctionaliseerde medicijnafgiftesystemen met verschillende eigenschappen die voortvloeien uit de asymmetrische verdeling en verdeling van biomoleculen in besloten ruimtes op hun oppervlak21. Geneesmiddel-lipide-interacties spelen een belangrijke rol in de farmacokinetische eigenschappen van geneesmiddelen, zoals hun transport, distributie en accumulatie, die uiteindelijk de werkzaamheid van de gebruikte geneesmiddelen beïnvloeden22. Daarom is het van cruciaal belang om de rol van deze interacties op de farmacokinetische eigenschappen van geneesmiddelen te begrijpen bij het ontwikkelen van effectieve geneesmiddelen. Modellipidemembranen kunnen worden onderzocht om hun mechanismen van interacties met peptiden, polymeren en nanodragers te begrijpen23. Veranderingen in de lipidensamenstelling van cellen en weefsel bij bepaalde ziektetoestanden kunnen dus biofysische interacties veranderen, die kunnen worden onderzocht om doelwitspecifieke geneesmiddelen en medicijnafgiftesystemen te ontwikkelen24.

Concluderend biedt het hier beschreven protocol een gemakkelijke strategie om fasegescheiden GUV's te genereren met ingekapselde eiwitten die verankerd zijn aan hun binnenste lipidenblad. Het genereren van deze vesiculaire systemen is veelbelovend bruikbaar op gebieden als biotechnologie en synthetische biologie, waar assemblages met meerdere componenten met complexe functionaliteiten om celachtige functies na te bootsen, innovatieve oplossingen en nieuwe toepassingen kunnen opleveren.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs willen de MPIB Core Facility bedanken voor hun hulp bij eiwitzuivering, Michaela Schaper voor het klonen van plasmiden, Kerstin Röhrl voor eiwitzuivering en Sandra Ortmeier voor lipidenpreparaten. De auteurs willen ook Adrián Merino-Salomón en Shunshi Kohyama bedanken voor hun nuttige discussies over crowder-omstandigheden en eiwitinkapseling. M.R.-L. maakt deel uit van IMPRS-ML en het ONE MÜNCHEN-project dat wordt ondersteund door het federale ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF) en de Vrijstaat Beieren in het kader van de excellentiestrategie van de federale regering en de deelstaten. De auteurs willen ook de steun van het Center for Nanoscience (CeNS), München, erkennen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (natriumzout) (DOPG)Avanti Polar lipids840475In chloroform
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Avanti Polar lipids850375In chloroform
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (natriumzout) (18:1 Biotinyl Cap PE)Avanti Polar lipids870273In chloroform
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-(1'-rac-glycerol) (natriumzout) (DPPG)Avanti Polar lipids840455In chloroform
1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)Avanti Polar lipids850355In chloroform
96-Well Flat-Bottom Microplate (SensoPlate)
Actine (alpha-actine skeletspier, konijn)HYPERMOL8101-01
Atto488-Actine (alpha-actine skeletspier, konijn)HYPERMOL8153-01
Atto655-DOPEATTO-TECAD 655-16Poeder
Bath SonicatorBranson 1510R-MTHBransonic ultrasoonreiniger
Biotin-Actine (alpha-actine skeletspier, konijn)HYPERMOL8109-01
BSASigma AldrichA6003
CentrifugeEppendorf5424R
CentrifugeEppendorf5804 R
ChloroformSigma Aldrich67-66-3
Cholesterol (schapen)Avanti Polar lipids700000In chloroform
DecaanTCI Deutschland GmbHD0011
Fascin (mens, recombinant)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)CS-FSC01-A
Ficoll70Sigma AldrichF2878
Iodixanol (OptiPrep)Sigma AldrichD1556
LSM800 confocale laserscanningmicroscoopCarl ZeissC-Apochromat 40 × /1.2 water-immersie objectief. Diode-gepompte solid-state lasers: 488 nm en 640 nm.
MineraalolieSigma Aldrich8042-47-5
Myosine II (skeletspier van konijn)Cytoskeleton Inc (Tebubio GmbH)MY02-A
NeutravidinThermo Fisher Scientific Inc.31000
OsmometerFiske AssociatesFiske Micro-Osmometer model 120
Greiner Bio-One GmbH07-000-109

Referenties

  1. Rideau, E., Dimova, R., Schwille, P., Wurm, F. R., Landfester, K. Liposomes and polymersomes: a comparative review towards cell mimicking. Chem Soc Rev. 47 (23), 8572-8610 (2018).
  2. Imai, M., Walde, P. Giant unilamellar vesicles: From protocell models to the construction of minimal cells. The Giant Vesicle Book. , (2019).
  3. Akbarzadeh, A., et al. Liposome: classification, preparation, and applications. Nanoscale Res Lett. 8 (1), 102(2013).
  4. Litschel, T., Schwille, P. Protein Reconstitution Inside Giant Unilamellar Vesicles. Annu Rev Biophys. 50 (1), 100620-114132 (2021).
  5. Dimova, R., Aranda, S., Bezlyepkina, N., Nikolov, V., Riske, K. A., Lipowsky, R. A practical guide to giant vesicles. Probing the membrane nanoregime via optical microscopy. J Phys Condens Matter. 18 (28), S1151-S1176 (2006).
  6. Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss Chem Soc. 81 (0), 303-311 (1986).
  7. Abkarian, M., Loiseau, E., Massiera, G. Continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE) for high throughput monodisperse vesicle design. Soft Matter. 7 (10), 4610-4614 (2011).
  8. Dürre, K., Bausch, A. R. Formation of phase separated vesicles by double layer cDICE. Soft Matter. 15 (47), 9676-9681 (2019).
  9. Pautot, S., Frisken, B. J., Weitz, D. A. Production of Unilamellar Vesicles Using an Inverted Emulsion. Langmuir. 19 (7), 2870-2879 (2003).
  10. Deshpande, S., Caspi, Y., Meijering, A. E. C., Dekker, C. Octanol-assisted liposome assembly on chip. Nat Commun. 7 (1), 10447(2016).
  11. Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
  12. Moga, A., Yandrapalli, N., Dimova, R., Robinson, T. Optimization of the Inverted Emulsion Method for High-Yield Production of Biomimetic Giant Unilamellar Vesicles. ChemBioChem. 20 (20), 2674-2682 (2019).
  13. Liu, A. P., Fletcher, D. A. Actin polymerization serves as a membrane domain switch in model lipid bilayers. Biophys J. 91 (11), 4064-4070 (2006).
  14. Lopes dos Santos, R., Malo, M., Campillo, C. Spatial Control of Arp2/3-Induced Actin Polymerization on Phase-Separated Giant Unilamellar Vesicles. ACS Synth Biol. 12 (11), 3267-3274 (2023).
  15. Sun, Q., Fu, Y., Wang, W. Temperature effects on hydrophobic interactions: Implications for protein unfolding. Chem. Phys. 559, 111550(2022).
  16. Zimmerle, C. T., Frieden, C. Effect of temperature on the mechanism of actin polymerization. Biochemistry. 25 (21), 6432-6438 (1986).
  17. Concha-Marambio, L., Maldonado, P., Lagos, R., Monasterio, O., Montecinos-Franjola, F. Thermal adaptation of mesophilic and thermophilic FtsZ assembly by modulation of the critical concentration. PLoS One. 12 (10), e0185707(2017).
  18. Kanwa, N., Kohyama, S., Fröhlich, L., Desai, A., Schwille, P. Mutual dependence between membrane phase separation and bacterial division protein dynamics in synthetic cell models. Angew Chem Int Ed Engl. 64 (6), e202417800(2025).
  19. Reverte-López, M., et al. Self-organized spatial targeting of contractile actomyosin rings for synthetic cell division. Nat Commun. 15 (1), 10415(2024).
  20. dos Santos, R. L., Campillo, C. Studying actin-induced cell shape changes using Giant Unilamellar Vesicles and reconstituted actin networks. Biochem Soc Trans. 50 (5), 1527(2022).
  21. Staufer, O., et al. Microfluidic production and characterization of biofunctionalized giant unilamellar vesicles for targeted intracellular cargo delivery. Biomaterials. 264, 120203(2021).
  22. Lopes, D., Jakobtorweihen, S., Nunes, C., Sarmento, B., Reis, S. Shedding light on the puzzle of drug-membrane interactions: Experimental techniques and molecular dynamics simulations. Prog Lipid Res. 65, 24-44 (2017).
  23. Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical interactions with model lipid membranes: applications in drug discovery and drug delivery. Mol Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
  24. Schulz, M., Werner, S., Bacia, K., Binder, W. H. Controlling Molecular Recognition with Lipid/Polymer Domains in Vesicle Membranes. Angew Chem Int Ed Engl. 52 (6), 1829-1833 (2013).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fasegescheiden GUV sprote ne inkapselinglipid raftsemulsieoverdrachtlipidedomeinenFtsZ prote neactine inkapselingmembraanprote nedynamiek

Gerelateerde artikelen