Methodenartikel

Synthese van 13C 2-retinylacetaat en dosispreparaat voor retinolisotopenverdunningstests

611 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68535

⸱

22 augustus 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Otolaryngology - Head and Neck Surgery, University of Wisconsin-Madison

In dit artikel

Samenvatting

Retinylacetaat wordt meestal gelabeld met twee 13C wanneer massaspectrometrie met gaschromatografie-verbranding en isotopenverhouding wordt gebruikt voor serum- en moedermelkanalyse. Dit artikel beschrijft de synthese van 13C 2-retinylacetaat en de bereiding van doses voor retinolisotopenverdunningstests die moeten worden toegediend door een positieve verdringingspipet of tuberculinespuit.

Samenvatting

De retinolisotopenverdunningstest (RID) is de meest gevoelige methode om de vitamine A-status te beoordelen door de totale leverreserves te schatten, die als de referentiestandaard worden beschouwd. Voor de detectie van massaspectrometrie met gaschromatografie-verbranding-isotopenverhouding wordt 13C toegevoegd aan het retinolgedeelte. De synthetische procedure voor 13C-retinylacetaat begint met het van nature voorkomende β-ionon. In het kort wordt C18-tetraeenketon gesynthetiseerd uit β-ionon en gezuiverd. Als een 13C 4-retinylacetaat gewenst is, kan het carbanion van 13C2-gelabeld triethylfosfosoacetaat worden gebruikt om twee 13C's toe te voegen aan het β-ionongedeelte voordat de drie koolstofatomen van aceton worden toegevoegd om het C18-tetraeenketon te synthetiseren. Als een 13C 3-retinylacetaat gewenst is, kunnen de drie koolstofatomen van de aceton worden geëtiketteerd met 13C.

Voor het meest gebruikte 13C 2-retinylacetaat voor toekomstige analyse door middel van gaschromatografie-verbranding isotoopverhouding massaspectrometrie, wordt een gemodificeerde Wittig-Horner-procedure gebruikt en wordt niet-gelabeld C18-tetraeenketon gereageerd met het carbanion van 13C2-gelabeld triethylfosfosoacetaat om twee-13C's toe te voegen aan de 14 en 15 posities van het retinolmolecuul. De resulterende ethylester wordt gereduceerd tot de alcohol en veresterd tot 13C 2-retinylacetaat met azijnzuuranhydride. Het volledig trans-isomeer wordt gezuiverd op 8% - water-gedeactiveerd aluminiumoxide met behulp van relatief onschadelijke, zeer vluchtige oplosmiddelen - hexanen en diethylether - die worden verwijderd door roterende verdamping en sonificatie van oliedoses. Het product wordt gekenmerkt door ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectroscopie, dunnelaagchromatografie (TLC) en hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) volgens analytische normen. De geconcentreerde dosis wordt opgelost in sojaolie bewaard bij -80 °C. De uiteindelijke doses worden verdund in sojaolie (~200 μL/dosis) en gekwantificeerd door middel van UV-Vis-spectroscopie tegen de sojaolie van het voertuig. Doses worden gemeten voor toediening aan mensen met een positieve verdringingspipet of tuberculinespuiten voor de RID-test. Met behulp van de juiste aannames worden de totale lichaamsvoorraden berekend en worden de totale leverreserves geschat.

Inleiding

Retinol-isotopenverdunning (RID) is de enige biomarker van de vitamine A-status die de totale vitamine A-voorraden (TBS) in het lichaam kwantitatief meet en met de juiste aannames de totale leverreserves (TLR) kan schatten. Het is de meest gevoelige manier om de vitamine A-status en de impact van interventies met voorgevormde retinol of provitamine A-carotenoïden te meten. Hoewel het technisch uitdagend is, is RID nauwkeurig en minimaal invasief omdat er alleen bloedmonsters nodig zijn in tegenstelling tot leverbiopsieën1. De RID-test omvat de toediening van gedeutereerd of 13C-gelabeld retinylacetaat, afhankelijk van het massaspectrometerplatform. Voorafgaand aan de toediening van de dosis wordt een basisbloedmonster verzameld, wat essentieel is bij het gebruik van 13C-labels, maar kan worden gedaan op een willekeurig geselecteerde subgroep. Een tweede monster wordt verzameld nadat het 13C-gelabelde retinylacetaat is gemengd met TBS1.

Vitamine A-interventies om tekorten te voorkomen, omvatten voedselverrijking, biofortificatie, dieetdiversificatie en suppletie. In sommige landen zijn er echter overlappende interventies geweest die gericht waren op dezelfde mensen, wat leidde tot hypervitaminose A2, waardoor een monitoringkader nodig is om de resultaten van het programma te beoordelen. Als zodanig zijn methoden nodig die de vitamine A-status kwantitatief meten. In samenwerking met de lidstaten bevordert de Internationale Organisatie voor Atoomenergie (IAEA) het vreedzame gebruik van isotopen in onderzoek en evaluaties, wat de toepassing van de RID-test ondersteunt. De RID-test wint aan kracht en kan binnenkort worden gebruikt in grote bevolkingsonderzoeken om de vitamine A-status te beoordelen van tekort tot overmaat in landen die vitamine A-interventies implementeren3.

Eerder werd 10,11,14,15-13 C 4-retinylacetaat gesynthetiseerd met behulp van modificaties van Bergen et al. voor gedeutereerd retinylacetaat 4,5. Deze verbinding werd gebruikt in ratten6 en menselijke experimenten met gaschromatografie-verbranding-isotopenverhouding massaspectrometrie (GCCIRMS) aangepast voor analyse7. Uit deze waardevolle experimenten hebben we vastgesteld dat GCCIRMS zo gevoelig was dat vier 13C's niet nodig waren voor de RID-test met GCCIRMS. Daarom worden de kosten van de tracer verlaagd door slechts twee 13C's te gebruiken in de 14 en 15 posities van het retinolmolecuul (Figuur 1). Deze wijziging verlaagt de kosten die gepaard gaan met de synthese en leidt tot hogere opbrengsten als gevolg van de synthetische route. Hierin wordt een opgeschaald protocol voor de synthese ervan beschreven.

GCCIRMS is gevoeliger dan andere soorten massaspectrometrie voor het meten van stabiele isotopen8 en kan reageren op veranderingen in het dieet en natuurlijke 13C-verrijkingsveranderingen in serumretinol. Dit werd beschreven bij gerbils9 en mensen10die maïs consumeerden, en bij mensen die deelnamen aan een plantaardige interventie11. De natuurlijke abundantie van 13C varieert inderdaad tussen verschillende populaties en moet worden bepaald bij proefpersonen die deelnamen aan RID-evaluaties12. Er zijn echter kleine subgroepen gebruikt voor het meten van natuurlijke verrijking met het RID bij Ghanese en Thaise kinderen13,14 en Thaise vrouwen15. Individuele baseline 13C-verrijking moet worden bepaald voor de meest nauwkeurige bepaling van TBS op individueel niveau12.

Protocol

OPMERKING: Bij het inschrijven van proefpersonen voor onderzoek, interventies of evaluatieve studies, moet goedkeuring door de Institutional Review Board (IRB) worden nagestreefd met de juiste procedures voor geïnformeerde toestemming.

1. Synthese van 13C 2-retinylacetaat (figuur 2)

OPMERKING: Alle synthetische procedures en kwantificering worden uitgevoerd onder gouden fluorescentieverlichting om degradatie en isomerisatie van verbindingen te voorkomen.

  1. Synthetiseer β-ionylacetaat in een grote batch van in de handel verkrijgbare β-ionon. Bedek bijvoorbeeld natriumhydride (NaH) (4 g, 0,16 mol) met 100 ml ether. Voeg niet-geëtiketteerd triethylfosfonoacetaat (36 g, 0,16 mol) druppelsgewijs toe aan 100 ml ether en roer gedurende 2 uur. H2 komt vrij en de initiële suspensie wordt helder en amberkleurig.
    LET OP: Natriumhydride (NaH) is een sterk reductiemiddel dat nuttig is in een breed scala aan chemische reacties. Laboratoriumbranden kunnen echter optreden vanwege de zeer exotherme reactie met water in de atmosfeer16,17. Het wordt aanbevolen om een veiligheidsinformatieblad te raadplegen; er zijn aanvullende richtlijnen gepubliceerd voor het omgaan met matig pyrofore vaste stoffen zoals NaH18. Houd het gesuspendeerd in olie of niet-reactief oplosmiddel tijdens het hanteren, spoelen van reactievaten en opslagcontainers met inert gas (zoals stikstof of argon), het koelen van het reactievat en opslag in afgesloten containers die in een droge omgeving worden bewaard. In ons laboratorium wordt NaH in kleine hoeveelheden (~1 g) onder een stikstofomgeving overgebracht naar flesjes en vervolgens opgeslagen in een afgesloten exsiccator tot gebruik.
  2. Voeg β-ionon (21 g, 0,12 mol) toe aan 40 ml ether en reageer 's nachts (~15 uur bij 20 °C). Blus op dag 2 de reactie met water en extraheer het ethyl-β-ionylideenacetaat in hexanen en spoel herhaaldelijk met water in een reeks scheidingstrechters om het herstel te maximaliseren. Droog de organische laag (watervrij MgSO4), filtreer en concentraat
    OPMERKING: Dunnelaagchromatografie (TLC) detecteert in dit stadium van de synthese meestal slechts kleine onzuiverheden. Dit kan voor een langere periode worden bewaard bij -80 °C voordat u overgaat tot de volgende stappen.
  3. Reageer ethyl-β-ionylideenacetaat (28 g, 0,11 mol) met 120 ml 1 molair lithiumaluminiumhydride (LiAlH4) in diethylether. Dompel het reactievat onder in een droogijsacetonbad en roer de oplossing continu om β-ionylideen-ethanol te verkrijgen.
    LET OP: Lithium-aluminiumhydride (LiAlH4) is een sterk reductiemiddel. Open een veiligheidsinformatieblad en raadpleeg aanvullende richtlijnen voor het omgaan met matig pyrofore vaste stoffen, zoals LiAlH418,19. Het primaire doel van de meeste veiligheidsmaatregelen is het minimaliseren van het risico van blootstelling van LiAlH4 aan de atmosfeer en het voorkomen van op hol geslagen reacties. Dit houdt over het algemeen in dat deze verbindingen tijdens het hanteren in olie of niet-reactief oplosmiddel worden gesuspendeerd, reactievaten en opslagcontainers met inert gas (zoals stikstof of argon) worden gespoeld, het reactievat wordt gekoeld en LiAlH4 wordt opgeslagen in afgesloten containers die in een droge omgeving worden bewaard. In ons laboratorium wordt lithiumaluminiumhydride gekocht in verzegelde flessen van 1 kies in plaats van in poedervorm, waarbij de vereiste hoeveelheden worden verwijderd met een spuit en de atmosfeer van de fles wordt vervangen door stikstof.
  4. Los 28 g (0,12 mol) β-ionylideen-ethanol op in 300 ml hexanen. Voeg ongeveer 50 g per dag 90% MnO2 toe gedurende 3 dagen (51 g, 52 g en 54 g) en roer het reactiemengsel langer (vaak 2 dagen bij 20 °C). Voeg ten slotte 35 g MnO2 toe en laat een nacht ongeveer 15 uur staan; De reactie is voor ongeveer 90% voltooid. Filtreer en was het β-ionylideen, aceetaldehyde uit de MnO2 met dichloormethaan.
  5. Los ruw β-ionylideen-acetaldehyde (22 g, 0,10 mol) op in 150 ml aceton onder voortdurend roeren en voeg druppelsgewijs 10 ml 1 N natriumhydroxide toe. Laat de reactie 6 uur intrekken.
  6. Extraheer het C18-tetraeenketon met hexanen en was herhaaldelijk met water met behulp van een reeks scheidingstrechters om het herstel te maximaliseren. Droog de resulterende oplossing met een roterende verdamper om ruw cis-trans C18-tetraeenketon te verkrijgen. Omdat het trans-isomeer het meest wenselijk is voor studies bij mensen, moet het mengsel worden gezuiverd op 4% watergedeactiveerde silicagel (300 g) met een langzame gradiënt van 0-10% ethylacetaat in hexaan.
  7. Roer NaH (1,2 g, 0,05 mol) met 50 ml ether. Voeg 13C 2-triethylfosfosoacetaat (11 g, 0,049 mol) opgelost in 50 ml ether druppelsgewijs toe en roer gedurende 2 uur. Los C18-tetraeenketon (12 g, 0,044 mol) op in 50 ml ether en reageer gedurende een nacht gedurende ongeveer 15 uur bij 20 °C.
  8. Blus de reactie met water en extraheer de 14,15-13 C 2-retinoïnezuurethylester met hexanen en spoel met water in een scheitrechter. Droog de organische laag met watervrij MgSO4 en concentraat; Zuiver op 8% watergedeactiveerd neutraal aluminiumoxide (400 g) met een langzame 0 tot 3% diethylether in hexaangradiënt om cis/trans-isomeren te verkrijgen.
    OPMERKING: Vaak bevat de eerste zuivering verontreinigingen zoals beoordeeld door TLC. Verontreinigingen worden gevisualiseerd door de TLC-plaat te laten reageren met jodiumdamp. Wanneer er verontreinigingen aanwezig zijn, is het van cruciaal belang om op 400 g 8% water gedeactiveerd neutraal aluminiumoxide te zuiveren met 100% hexanen om te resulteren in zuivere 14,15-13 C 2-retinoïnezuurethylester.
  9. Verminder 14,15-13 C 2-retinoïnezuurethylester (3,7 g) met 15 ml 1 molaire lithiumaluminiumhydride in een droogijsacetonbad terwijl u roert om 14,15-13 C2-retinol te verkrijgen (Figuur 1).
  10. Los 14,15-13 C2-retinol (3,5 g) op in 20 ml triethylamine. Meng onder het roeren van de oplossing 3,5 ml azijnzuuranhydride met 7 ml triethylamine en voeg druppelsgewijs toe aan de kolf. Laat de kolf een nacht in de koelkast staan voor de vorming van het 14,15-13 C 2-retinylacetaat (ongeveer 15 uur).
  11. Extraheer 3,9 g ruw 14,15-13 C 2-retinylacetaat tot hexanen, droog, concentreer en zuiver op 500 g 8% watergedeactiveerd neutraal aluminiumoxide met een langzame 0-3% diethylether in hexaangradiënt. Bewaak fracties met een ultraviolet zichtbare (UV-Vis) spectrofotometer bij 325 nm. Verwijder alle resterende oplosmiddelen met een roto-verdamper. Evalueer het eindproduct met HPLC- en fotodiodedetectie om de cis/trans-verhouding te bepalen. Een voorbeeld van een geavanceerd gradiëntsysteem om het cis/trans-profiel te scheiden met behulp van ultra-druk vloeistofchromatografie is beschikbaar in aanvullende figuur S1.
    OPMERKING: De cis/trans-verhouding is in dit stadium meestal >95% all-trans .
  12. Los voor opslag all-trans 14,15-13 C 2-retinylacetaat op in sojaolie van voedingskwaliteit zonder andere toevoegingen en bewaar in amberkleurig glas gespoeld met stikstof bij -80 °C en etiketteer als geconcentreerde bouillon.

2. Dosisbereiding van olieachtige oplossingen van stabiel isotoop-gelabeld retinylacetaat

OPMERKING: Isotopisch geëtiketteerd retinylacetaat is toegediend in capsules20 of in olieoplossingen die worden geleverd met een 250 μL positieve verdringerpipet21 of medische spuit22 (Figuur 3). We hebben de stabiliteit van capsules getest (Figuur 4), hieronder beschreven.

  1. Los het geëtiketteerde retinylacetaat direct na de synthese op in ~15 ml niet-verrijkte plantaardige olie (bijv. sojaolie van voedingskwaliteit) voordat het begint te kristalliseren en bewaar het in een amberkleurige injectieflacon van 24 ml bij -30 tot -80 °C totdat het klaar is om de laatste doses te bereiden.
    1. Als het geëtiketteerde retinylacetaat is gekocht, breek dan voorzichtig de bovenkant van de vacuümverzegelde ampul af door te scoren met een vijl of verbreek de verzegeling van een fles met schroefdop. Afhankelijk van de benodigde massa, doe je een afgewogen hoeveelheid in een bruine amberkleurige fles van 24 ml en voeg je een kleine hoeveelheid plantaardige olie toe (10 ml is waarschijnlijk voldoende). Sonificeer het mengsel tot het een heldere oplossing wordt.
  2. Schat de hoeveelheid uiteindelijke olie die nodig is door het aantal proefpersonen te vermenigvuldigen met 200 μL. Als er bijvoorbeeld 60 proefpersonen moeten worden ingeschreven, maak dan ongeveer 70 doses aan om genoeg te hebben voor verspilling (ongeveer 10-20%). 70 × 200 μL is dus 14 ml.
    OPMERKING: Vertrouw niet op de massa van de synthetische olie of kristallen. U moet een spectrofotometer gebruiken om de doses te kwantificeren. Alle synthetische vitamine A bevat resterende oplosmiddelen. Deze kunnen worden verdreven door sonificatie of onder een zachte stroom stikstof, maar zijn de belangrijkste reden waarom massa alleen niet kan worden gebruikt om isotopendoses te bepalen.
    Als de geëtiketteerde retinylacetaatoplossingen zeer lang in de vriezer worden bewaard zonder te worden gebruikt, moeten ze opnieuw worden geanalyseerd om te bepalen of er substantiële degradatie is opgetreden.
  3. Om retinylacetaat te kwantificeren:
    1. Schakel de UV-Vis-spectrofotometer in (bij voorkeur scanningspectrofotometer met dubbele straal) en de aangesloten computer, indien van toepassing. Start de UV-Vis-spectrofotometer volgens de instructies van de fabrikant. Laat de spectrofotometer ten minste 30 minuten opwarmen voordat u gaat aflezen.
    2. Zet twee maatkolven en doppen van 25 ml op en vul ze elk met 25 ml hexanen tot bijna aan de lijn. Etiketteer de ene kolf met "Olie" of "Blanco" en de andere met "Vitamine A" of "Dosis"; zet vervolgens de vitamine A-fles opzij tot nadat de lege plekken zijn uitgevoerd.
    3. Giet wat pure sojaolie in een plastic wegwerpbeker en voeg 20-40 μL toe aan de Oliekolf om het systeem leeg te maken.
      OPMERKING: We gebruiken vaak 20 μL, maar zolang het blanco- en isotoopdosisvolume hetzelfde zijn, kan men meer gebruiken.
    4. Keer 4-5x om om de olie en hexanen te mengen, spoel vervolgens beide spectrofotometer kwartscuvetten met deze oplossing en vul beide ~75% vol.
    5. Plaats beide cuvetten in de spectrofotometer en zorg ervoor dat u de doorzichtige voor- en achterkant niet aanraakt (handvat alleen aan de matte zijkanten). Voor de beste nauwkeurigheid richt u de genummerde voorkant van elke bijpassende cuvet naar de gebruiker.
    6. Sluit de lichtblokkerende deur boven de monsters.
    7. Klik op de functie Blanco of Basislijn en laat het systeem de basislijnabsorptie van olie en hexanen meten. Dit corrigeert voor de absorptie van de Oil Blank hexanenoplossing. Scan van 260 tot 400 nm; Controleer of de aflezing "nul" is bij 400 nm nadat dit proces is voltooid. Als dit niet het geval is, drukt u op de nulknop en voert u de scan opnieuw uit. Eenmaal voltooid, is het systeem klaar om de absorptie van de retinylacetaatdosis te meten.
    8. Gooi de inhoud van de monstercuvet weg en vul deze met de Dose hexanenoplossing. Plaats het monster op de juiste plek en scan de spectra. Selecteer de piek en lees de absorptie af. Puur retinylacetaat heeft slechts één lambda maximaal bij 325 nm.
      OPMERKING: Als u meer dan één piek heeft of er een heeft bij 280 nm, is het retinylacetaat afgebroken en mag het niet worden gebruikt voor dosering.
  4. Berekeningen voor stap 2.3
    OPMERKING: De E 1%, 1 cm voor retinol is 1.810 bij 325 nm in hexanen. U kwantificeert het retinylacetaat in retinolequivalenten.
    1. Deel de extinctie door 0,181 om de μg/ml oplossing te krijgen.
    2. Vermenigvuldig met 25 ml om de μg in 20 microliter olieoplossing te krijgen.
      OPMERKING: Voorbeeld: De absorptie van 20 μL olie in 25 ml hexanen is 0,295.
      0,295/0,181 = 1,630 μg/ml × 25 ml = 40,75 μg in 20 μl olie
      Als u 286 μg nodig heeft voor de dosis, is dat 140,4 μL. Dit is 1 μmol, maar door het etiket wordt 288 μg 13C2-retinol in de darm aangemaakt. Misschien wilt u een verdunning maken om dichter bij de dosishoeveelheid van 200 μL te komen en de bovenstaande kwantificering opnieuw uit te voeren.
  5. Voorbereiding van capsules om de stabiliteit te testen
    1. Scheid de capsules in de grotere witte bodem en kleinere blauwe doppen.
    2. Plaats de witte capsulebodems in de dozen met pipetpunten (96 capsules per doos) en sluit ze af om te voorkomen dat er stof in de capsules komt en doe de blauwe doppen een nacht in een plastic zak met ritssluiting. Gooi gebarsten capsules weg.
    3. Laat de retinylacetaatolie-oplossing op kamertemperatuur komen. Giet een kleine hoeveelheid (~5 ml) in een kleine ongebruikte plastic beker.
    4. Bereid een repeaterpipet voor door de spuit van 5 ml (waarbij 1 = 100 μL) te vullen en op "2" te zetten om 200 μL per druk op de trekker te doseren.
    5. Laad de retinylacetaatolie in de repeteerpipet door de laadarm omhoog te trekken. Doseer ten minste 4 x 200 μL aliquots terug in de beker om luchtbellen uit de punt te verwijderen.
    6. Doseer 1 x 200 μL aliquot per witte capsulebodem door de punt van de pipet lichtjes aan te raken tegen de binnenwand van de capsule en de trekker in te drukken.
    7. Zodra de repeteerpipet bijna leeg is, zuigt u meer olie op.
    8. Nadat je een hele set van 96 capsules hebt voltooid, doe je de olie terug in de beker en begin je de blauwe doppen lichtjes op elke witte bodem te schuiven, waarbij je ervoor zorgt dat de doppen niet barsten.
    9. Nadat alle doppen op de capsules zitten, tilt u elke capsule eruit, controleert u lichtjes of de dop goed vastzit en plaatst u deze terug in de tipdoos.
    10. Bewaar de capsules bij de gekozen temperaturen en omstandigheden. Duisternis kan worden bereikt door de capsules in rekken onder aluminiumfolie op te slaan. Hieronder staan voorbeelden:
      een.  in de vriezer: -20 °C in het donker
      b.  in de koelkast: 4 °C in het donker
      c. op de bank: 20 °C (kamertemperatuur) in het donker
      d. op de bank maar weggelaten: 20 °C (kamertemperatuur) blootgesteld aan standaard tl-verlichting
      e.  in een oven, waarbij hogere omgevingstemperaturen op andere locaties worden nagebootst: 37 °C in het donker

3. Dosis toediening

OPMERKING: De verdringingspipet is rechtstreeks vergeleken met tuberculinespuiten om de nauwkeurigheid en precisie onder technici te bepalen (Afbeelding 5).

De doses worden toegediend met behulp van 250 μl Rainin-pluspipetten of tuberculinespuiten van 1 ml.

  1. Ontdooi de bevroren doses of plaats ze in een koelbox met ijspakken als u naar de veldlocatie gaat. Tijdens het transport ontdooien de doses meestal.
  2. Haal de amberkleurige glazen injectieflacon uit de koeler en open. Bewaar de injectieflacon in een "mok" of beker om te voorkomen dat deze omvalt.
  3. Steek de pipetpunt of tuberculinespuit in de olie en zuig een kleine hoeveelheid op. Druk de zuiger snel in om eventuele luchtbellen te verplaatsen. Zuig langzaam de benodigde hoeveelheid volume op in de pipet of spuit. Zorg ervoor dat er geen bubbels zijn.
  4. Veeg de buitenkant van de punt af met een tissue. Raak het uiteinde van de pipetpunt of spuit niet aan, omdat hierdoor de vloeistof wordt opgezogen.
  5. Steek de punt in de mond van de deelnemer, laat de olie in zijn mond lopen en instrueer de persoon om zijn mond te sluiten en door te slikken.
    OPMERKING: Het is handig als deelnemers hun hoofd iets naar achteren kunnen kantelen voor de dosering.
  6. Dien na de dosis een "chaser" of een vette snack toe die ten minste 10 g vet bevat. Dien voor jonge kinderen 1 ml niet-versterkte olie toe, geleverd op een plastic lepel als jager. Voor oudere kinderen en volwassenen zijn een halve boterham met pindakaas, gebakken witte aardappel of een stokbrood met chocopasta goede vervolgsnacks.
    OPMERKING: Er moet informatief onderzoek worden gedaan om te bepalen welke snack lokaal acceptabel is.

Resultaten

Beginnend met in de handel verkrijgbare β-ionon, werd 28 g ethyl-β-ionylideenacetaat gesynthetiseerd. Na reductie werd 22 g β-ionylideenacetaldehyde onder basisomstandigheden gereageerd met aceton om C18-tetraeenketon te verkrijgen; Er werd 12 g gezuiverd C18-tetraeenketon verkregen, wat ~90% all-trans was. Dit werd vervolgens gereageerd met het carbanion van 13C 2-triethylfosfonoacetaat met behulp van een gemodificeerde Wittig-Horner-procedure om twee 13C's toe te voegen op posities 14, 15 van het retinolmolecuul. De resulterende ethylester (opbrengst van 3,7 g) werd gereduceerd tot de alcohol en veresterd tot 13C 2-retinylacetaat met azijnzuuranhydride opgelost in triethylamine. De synthetische vitamine werd gezuiverd op 8%-water-gedeactiveerd aluminiumoxide met behulp van zeer vluchtige organische oplosmiddelen-hexanen en diethylether. Het resulterende preparaat werd gekarakteriseerd met behulp van UV-Vis-spectroscopie, TLC en HPLC. Voor langdurige opslag wordt het geëtiketteerde retinylacetaat opgelost in sojaolie bewaard bij -80 °C.

Het succesvolle synthetische schema voor 14,15-13 C 2-retinylacetaat dat hierboven is beschreven, is weergegeven in figuur 2. Het totale traject dat begint met β-ionon bestaat uit zeven stappen. De eerste opbrengst was 0,9 g all-trans 14,15-13 C 2-retinylacetaat. Cis/trans-isomeerfracties (1,2 g) werden gecombineerd en gezuiverd op 300 g 8% watergedeactiveerd neutraal aluminiumoxide om te resulteren in een extra 0,3 g all-trans 14,15-13 C 2-retinylacetaat.

Om de stabiliteit van retinylacetaat in capsules te bepalen, werd retinylacetaat (1 g ) opgelost in hexanen en gezuiverd door middel van openkolomchromatografie met 300 g 8% watergedeactiveerd aluminiumoxide met hexanen als oplosmiddel. Het retinylacetaat werd gecontroleerd door middel van TLC- en UV-Vis-spectroscopie en alleen de zuivere fracties werden gebruikt. Dit proces is identiek aan het proces dat wordt gebruikt bij de synthese en zuivering van 13C 2-retinylacetaat in het Tanumihardjo-laboratorium voor de RID-test zoals hierboven beschreven. Het gezuiverde retinylacetaat werd opgelost in sojaolie, het organische oplosmiddel werd verwijderd door een roterende verdamper en er werd meer olie toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 7,5 μM (om 1,5 μmol per 200 μL op te leveren, het middelpunt tussen de dosis voor een volwassene en een kind voor de RID-test wanneer GCCIRMS wordt gebruikt voor analyse). De concentratie werd bepaald door middel van UV-Vis-spectroscopie zoals hierboven beschreven.

Een aliquoot van 200 μl van de olie werd verdeeld in cellulosecapsules van maat 3 (maximaal volume 300 μl) voor het stabiliteitsonderzoek. De capsules van elke dosis werden onder vijf voorwaarden bewaard. Duisternis werd bereikt door de capsules in rekken onder aluminiumfolie op te slaan. Voor elke aandoening werden capsules (150) bereid voor een totaal van 750 capsules: i) in de vriezer: -20 °C in het donker; ii) in de koelkast: 4 °C in het donker; iii) op de bank: 20 °C (kamertemperatuur) in het donker; iv) op de werkbank maar niet weggelaten: 20 °C (kamertemperatuur) blootgesteld aan standaard tl-verlichting; v) in een oven, waarbij hogere omgevingstemperaturen op andere locaties worden nagebootst: 37 °C in het donker.

In het onderzoek naar de stabiliteit van de capsule werden op elk tijdstip drie capsules van elke toestand gemeten (-20 °C, 4 °C, kamertemperatuur donker, kamertemperatuur licht, 37 °C). Alle capsules mochten op kamertemperatuur komen (capsules op kamertemperatuur werden eerst geanalyseerd); Temperatuurvariatie veroorzaakt absorptievariatie. Capsules werden afgemeten tot 480 dagen. De capsules bleven negen maanden stabiel bij -20 °C en 4 °C (figuur 4).

Er is een methodevergelijking uitgevoerd om tuberculinespuiten voor eenmalig gebruik te vergelijken met de verdringerpipetten van Rainin als referentiestandaard. De verdringerpipet van Rainin werd gekalibreerd met water, waarbij rekening werd gehouden met de lokale temperatuur en druk, en vervolgens getest met drie punten in drievoud om het beoogde olievolume te bepalen dat bij de instelling van 200 μl op een geteerde weegboot werd gedoseerd. Het uitgifteprotocol werd uitgevoerd door 10 technici, variërend in ervaringsniveau. Voor elke technicus werden acht spuiten in drievoud getest en vergeleken met de pipetreferentie. De zijkanten van de pipet werden afgeveegd met een tissue en de olie werd onder een hoek in de weegboot gedoseerd, zodat er maximale olie vrijkwam. Technici waren blind voor de resultaten van de uitgedeelde massa gedurende het hele protocol; De oliemassa werd geregistreerd door een afzonderlijke technicus. Het proces werd herhaald met 200 μL sojaolie met behulp van acht tuberculinespuiten (bijv. Norm-Ject).

R statistische software werd gebruikt om een variantiecomponentmodel (FitVCA)22 te passen (Figuur 5). Gemeten variabiliteitsfactoren waren onder meer technicus, spuit binnen technicus en replicatiefout. De gemiddelde (95% BI) genormaliseerde toedieningswaarde van spuiten in vergelijking met het toedieningsvolume van de pipet was 0,996 (0,912, 1,08). Variantie van replicaatfout was goed voor 64,8% van de totale variantie, wat aangeeft dat de grootste bron van variabiliteit afkomstig was van herhaalde metingen binnen dezelfde spuit. Het percentage variantie van technicus en spuit binnen de technicus was veel lager en droeg respectievelijk 22,9% en 12,3% bij.

Subgroepanalyse werd uitgevoerd door technici op te splitsen in twee groepen (n = 5/groep) op basis van ervaring. De gemiddelde genormaliseerde spuittoediening was vergelijkbaar tussen beide groepen, maar het CI van 95% was smaller voor technici met meer ervaring; 1.001 (0.939, 1.063) en 0.998 (0.900, 1.100), respectievelijk. Bij meer ervaren technici kwam de meeste variantie van spuit binnen technicus (57.0%) en replicatiefout (42.9%), terwijl voor minder ervaren technici de meeste variantie kwam van technicus (32.7%) en replicatiefout (67.2%).

figure-results-1
Figuur 1: De structuur van retinol met de koolstofatomen genummerd. De 13C's worden meestal toegevoegd in de posities 14 en 15 voor gebruik met gaschromatografie-verbranding massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Het synthetische schema van 14,15-13 C 2-retinylacetaat dat wordt gebruikt in retinolisotopenverdunningstests wanneer massaspectrometrie van gaschromatografie-verbranding en isotopenverhouding wordt gebruikt voor serum- of moedermelkanalyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Afbeelding 3: Een tuberculinespuit van 1 ml zonder dood volume aan de punt en de pipet met positieve verplaatsing van 250 μl die wordt gebruikt voor de dosering in tracerstudies. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Afbraakcurven van retinylacetaat bewaard in capsules onder vijf verschillende omstandigheden. De omstandigheden zijn -20 °C, 4 °C, 20 °C (kamertemperatuur) in het donker, 20 °C (kamertemperatuur) onder standaard tl-licht en 37 °C. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Variantiecomponentenanalyse van de dosisafgiftehoeveelheid waarbij tuberculinespuiten van 1 ml worden vergeleken met een pipet met positieve verplaatsing van 250 μl onder 10 technici die blind waren voor de resultaten tijdens de evaluatie. Waarden zijn gedoseerde oliemassa (200 μL) uit spuiten genormaliseerd naar de positieve verdringingspipet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Een voorbeeld van de laatste zuiverheidscontrole van het 14,15-13C-retinylacetaat door middel van ultradruk vloeistofchromatografie. De bijbehorende spectra zijn kenmerkend voor de cis/trans-vormen van de vitamine. De UPLC-condities waren Oplosmiddel A 70:25:5 (acetonitril:water:isopropanol) met 10 mM ammoniumacetaat en Oplosmiddel B was 75% acetonitril, 25% isopropanol. De gebruikte kolom was een Acquity UPLC, BEH C18 1,7 μM, 2,1 x 100 mm kolom. De kolom was ingesteld op 29 °C en het debiet was 0,4 ml/min. De gradiënt begon met 100% oplosmiddel A en werd 5,0 minuten aangehouden, gevolgd door een overgang naar 98% oplosmiddel B gedurende 7 minuten en 8 minuten vastgehouden voordat hij terugkeerde naar 100% oplosmiddel A gedurende 1 minuut en werd vastgehouden voor een evenwicht van 4 minuten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hoewel er commerciële bronnen zijn van gedeutereerd en 13C-gelabeld retinylacetaat, zijn er meerdere synthetische routes voor retinol in de literatuur voor bekwame organische chemici. We kozen een synthetisch pad voor gedeutereerd retinylacetaat om te volgen en hebben de nodige aanpassingen gemaakt om 13C toe te voegen aan de ruggengraat van het retinolgedeelte, die hierboven zijn beschreven. De synthese van 14,15-13 C 2-retinylacetaat werd bereikt met behulp van een procedure in zeven stappen, te beginnen met in de handel verkrijgbare β-ionon. β-Ionon is een van nature voorkomend plantaardig bestanddeel en draagt bij aan geuren, zoals van rozen. De meest cruciale stap in de synthetische route is de vorming van het C18-tetraeenketon. Deze tussenverbinding moet ten minste 90% zuiver zijn voor de volgende stappen om goede opbrengsten te produceren.

De etikettering werd uitgevoerd met behulp van een gemodificeerde Wittig-Homer-procedure met in de handel verkrijgbaar 13C 2-triethylfosfonoacetaat. De gelabelde verbindingen worden gebruikt in de RID-test om TBS te bepalen en TLR te schatten. De methode maakt gebruik van GCCIRMS voor de analyse van retinol gezuiverd uit serum of moedermelk van personen die zijn gedoseerd met fysiologische niveaus van de geëtiketteerde verbindingen. De meest voorkomende doses zijn 1 μmol voor kinderen en 2 μmol voor volwassenen. Hoewel GCCIRMS-analyse gevoelig is voor isotopenverrijking, vereist de serumanalyse een minimum van 400 μL serum om voldoende retinolmassa te verkrijgen voor introductie op de GC.

De 13C-RID-test is gebruikt in klinische studies23,24 en in groepen Afrikaanse kinderen25 met toekomstplannen om het toegankelijk te maken voor bevolkingswerk. We voerden de experimenten uit met capsules en spuiten om te onderzoeken of deze aanpassingen geschikt zijn voor bevolkingswerk. De capsules moesten rechtop staan, anders lekten ze; We verwierpen al snel het idee dat ze in gewone amberkleurige pillenflesjes konden worden bewaard voor gebruik in het veld. De capsules waren slechts ~9 maanden stabiel bij koelkast- en diepvriestemperaturen. De productie van verzegelde capsules kan de stabiliteit verbeteren door een kleine blootstelling aan de atmosfeer tijdens opslag te verminderen. Het gebruik van capsules moet worden getest en gevalideerd door gebruikersgroepen voordat ze worden geïmplementeerd.

De uiteindelijke olieoplossingen zijn stabiel bij kamertemperatuur gedurende ~2 maanden, maar zodra ze beginnen af te breken, gaat de degradatie snel door. Er is geen gedeeltelijke activiteit die acceptabel is voor RID-tests, aangezien de gedoseerde hoeveelheid wordt gebruikt bij de berekening van TBS. Het is het beste om de oplossingen op ijspakken tijdens gebruik in het veld te bewaren en ze zo snel mogelijk na voltooiing van de dosering opnieuw in te vriezen. Het is het beste om slechts een paar doses meer mee te nemen dan nodig is voor de dag en de rest bevroren te houden. Invriezen en ontdooien hebben geen invloed op deze oplossingen omdat de olie zelf antioxidanten bevat. De olieoplossingen zijn robuuster dan bloedmonsters, maar moeten nog steeds te allen tijde in het donker worden bewaard en worden ingevroren wanneer ze niet worden gebruikt.

De doses worden toegediend met behulp van 250 μl Rainin-pluspipetten of tuberculinespuiten van 1 ml. Luchtverplaatsingspipetten zijn niet geschikt voor doses die zijn opgelost in olie. Ons laboratorium heeft deze twee methoden experimenteel vergeleken (zie Representatieve resultaten). Toediening met de pipet of spuit is vergelijkbaar met enkele afwijkingen. Pipetten met positieve verplaatsing van RAININ worden aanbevolen voor onderzoek of klinische studies, maar spuiten kunnen ook worden gebruikt voor werk op basis van de populatie. Spuiten met weinig dood volume in de punt worden aanbevolen om de dosisprecisie te maximaliseren (bijv. Norm-Ject).

Berekeningen voor de RID-test omvatten de hoeveelheid toegediende dosis, en de fout in de toegediende dosis is evenredig met de fout in de resulterende schatting van TBS. Voor het gebruik van tuberculinespuiten versus positieve verdringingspipetten lag de gemiddelde genormaliseerde toediening van spuiten dicht bij 1, wat aangeeft dat spuiten een nauwkeurige dosisafgifte kunnen bieden voor bevolkingsonderzoeken. De 95%-betrouwbaarheidslimieten waren ongeveer ± 8% van de doeldosisafgifte. Technici met meer eerdere ervaring met de spuiten hadden een smaller BI van 95% (± 6%) en een lagere variantiebijdrage van de technicus in vergelijking met technici met minder ervaring (± 10%). Dit suggereert dat een trainingsprotocol en validatie met voertuigolie moeten worden uitgevoerd voordat ze in het veld worden geïmplementeerd. Deze resultaten verdienen verdere validatie in elk laboratorium dat tuberculinespuiten voor eenmalig gebruik wil gebruiken als een kosteneffectieve en tijdbesparende toedieningsmethode om de doses toe te dienen in dosis-respons- en RID-tests in populatiestudies.

We hebben gekozen voor de verdringingspipet voor onderzoek en klinische studies met behulp van de RID-test om de nauwkeurigheid op individueel niveau te maximaliseren, aangezien de gerapporteerde nauwkeurigheid en precisie ≤1% bedragen. Ter vergelijking: de gemodificeerde relatieve dosis-responstest is kwalitatief en er zijn geen berekeningen gebaseerd op de toegediende dosis1. Daarom hebben we aanbevolen om spuiten te gebruiken voor de test in populatieonderzoeken en om de dosis op te lossen in ongeveer 0,7 ml vehiculum.

De RID-test is een gevoelige methode om TBS te kwantificeren en TLR te schatten, de referentiestandaard om de vitamine A-status te evalueren. Het is in veel onderzoekstoepassingen gebruikt met behulp van deuterium- of 13C-etikettering. Huidige en toekomstige toepassingen zullen de RID-test gebruiken in klinische settings en populatiesubgroepen in enquêtes. Vereenvoudiging van de dosering zal voor deze toepassingen belangrijk zijn.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten met de inhoud van dit manuscript.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door NIH-R01 DC019357 en het IAEA Coordinated Research Project E43035. We danken Nicholas Keuler van de Statistical Consulting-groep van de Universiteit van Wisconsin-Madison voor zijn hulp bij de analyse van de vergelijking van de spuitmethode voor eenmalig gebruik.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
azijnzuuranhydrideSigma Aldrich242845
acetonSigma Aldrich179124
aluminiumoxideSigma Aldrich199974
bekersElkeElk glasbedrijf 
beta-iononSigma AldrichW259500
etherSigma Aldrich673811
glas-PasteurpipettenElkeElk glasbedrijf 
hexaanSigma178918
gelabeld triethylfosfonoacetaatSigma Aldrich293202
lithiumaluminiumhydride-oplossingAcros organics199511000
mangaanoxideSidma Aldrich310700
pipetten met positieve verplaatsingRainin17008579
retinylacetaatSigma AldrichR4632
scheidingskolvenElkeElk glasbedrijf 
silicagelSigma Aldrich1.07734
natriumhydrideAldrich223441
natriumhydroxideFisher ScientificS318-100
spectrofotometerElke scanDubbelstraals wordt verkieslijk geacht
triethylamineSigma Aldrich471283
triethylfosfonoacetaatAldrichT61301
tuberculine-seringNorm-Ject19G334
plantaardige oliesojabonenolieKruidenierswinkel
maatkolven (25 ml)ElkeElk glasbedrijf 

Referenties

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND) - Vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Tanumihardjo, S. A., Kaliwile, C., Boy, E., Dhansay, M. A., van Stuijvenberg, M. E. Overlapping vitamin A interventions in the United States, Guatemala, Zambia, and South Africa: case studies. Annals NY Acad Sci. 1446 (1), 102-116 (2019).
  3. Sheftel, J., Loechl, C., Mokhtar, N., Tanumihardjo, S. A. Use of stable isotopes to evaluate bioefficacy of provitamin A carotenoids, vitamin A status, and bioavailability of iron and zinc. Adv Nutr. 9 (5), 625-636 (2018).
  4. Bergen, H. R., Furr, H. C., Olson, J. A. Synthesis of tri-, tetra-, and penta-deuterated forms of vitamin A. J Labelled Cpd Radiopharm. 25 (1), 11-21 (1988).
  5. Tanumihardjo, S. A. Synthesis of 10, 11, 14, 15-13C4- and 14, 15-13C2-retinyl acetate. J Labelled Cpd Radiopharm. 44 (5), 365-372 (2001).
  6. Tanumihardjo, S. A. Vitamin A status assessment in rats using 13C4-retinyl acetate and gas chromatography-combustion isotope ratio mass spectrometry (GCCIRMS). J Nutr. 130 (1), 2844-2849 (2000).
  7. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med. 242 (15), 1508-1514 (2017).
  11. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med. 234 (2), 140-147 (2009).
  12. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in 6 diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  13. Newton, S., et al. Vitamin A status and body pool size of infants before and after consuming fortified home-based complementary foods. Arch Public Health. 74, 10(2016).
  14. Pinkaew, S., et al. Triple-fortified rice containing vitamin A reduced marginal vitamin A deficiency and increased vitamin A liver stores in school-aged Thai children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  15. Nimmannun, K., et al. Breast milk retinol concentrations reflect total liver vitamin A reserves and dietary exposure in Thai lactating women from urban and rural areas. J Nutr. 152 (12), 2689-2698 (2023).
  16. A campus laboratory fire involving lithium aluminum hydride. , https://ehs.stanford.edu/reference/campus-laboratory-fire-involvinglithium- aluminum-hydride (2025).
  17. Merlic, C. A., Ferber, C. J., Schroder, I. Lessons learned− lithium aluminum hydride fires. ACS Chem. Health Saf. 29 (4), 362-365 (2002).
  18. Chandra, T., Zebrowski, J. P. A safety guidance document for lithium aluminum hydride (LAH) reduction: A resource for developing specific SOPs on LAH manipulations. ACS Chemical Health & Safety. 31 (2), 162-171 (2024).
  19. Procedures for safe use of pyrophoric solids accessed. , https://ehs.ucsc.edu/programs/research-safety/documents/ucla-pyrophoric-solid.pdf (2025).
  20. Tang, G., et al. Green and yellow vegetables can maintain body stores of vitamin A in Chinese children. Am J Clin Nutr. 70 (6), 1069-1076 (1999).
  21. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  22. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2024).
  23. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  24. Sheftel, J., et al. Findings in 3 clinical trials challenge the accuracy of the Institute of Medicine's estimated average requirements for vitamin A in children and women. Am J Clin Nutr. 113 (5), 1322-1331 (2021).
  25. Suri, D., et al. Association between biomarkers of inflammation and total liver vitamin A reserves estimated by 13C-retinol isotope dilution among preschool children in five African countries. J Nutr. 153 (3), 622-635 (2023).

Herprints en machtigingen

Tags

Vitamine A-status13C-retinylacetaatlevervitamine Agaschromatografieisotoopratio-massaspectrometrieWittig-Horner-synthesedunne-laagchromatografieUV-Vis-spectroscopiehogedrukvloeistofchromatografie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.