Methodenartikel

Real-time metabole detectie in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR

DOI:

10.3791/68539

⸱

8 juli 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 2Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, 4Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol integreert een op maat gemaakt bioreactorsysteem met gehyperpolariseerde ¹³C NMR-spectroscopie om het real-time pyruvaatmetabolisme in levende cellen te meten, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid voor metabole studies en toepassingen voor het screenen van geneesmiddelen worden verbeterd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol presenteert een methode om een in eigen huis gebouwd bioreactorsysteem te integreren met hypergepolariseerde 13C nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie om het pyruvaatmetabolisme in levende cellen in realtime te meten. Het protocol schetst de constructie van een bioreactorsysteem dat een nauwkeurige timing van hypergepolariseerde substraatinjectie en NMR-signaalacquisitie mogelijk maakt, terwijl een stabiele celkweekomgeving behouden blijft. De methode detecteert op betrouwbare wijze de metabolische omzetting van pyruvaat naar lactaat binnen een meetvenster van 60 s, terwijl gedurende het hele proces een voldoende signaal-ruisverhouding behouden blijft. De in-situ mengcapaciteit van het systeem versnelt de detectie van NMR-signalen en vermindert de T 1-relaxatieverliezen. Het protocol bevat ook gedetailleerde instructies voor de bereiding van alginaatgels om cellen in te kapselen en in de bioreactor te plaatsen. De voorgestelde methode vertoont een verbeterde reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid in vergelijking met conventionele methoden, wat wijst op mogelijke toepassingen in onderzoeken naar het kankermetabolisme en screening van geneesmiddelen. Verdere verfijningen van het systeem, zoals de toepassing van alternatieve gelmatrices, kunnen de veelzijdigheid ervan in verschillende biologische studies verbeteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gehyperpolariseerde NMR, met name door dynamische nucleaire polarisatie (DNP), verbetert de NMR-signaalintensiteit1 aanzienlijk en maakt het mogelijk om metabolische veranderingen in real-time te volgen met een sterk verbeterde gevoeligheid 2,3. Deze techniek is met succes toegepast in verschillende biologische systemen, waaronder gist 4,5, kankercelmodellen 6,7,8 en micro-organismen 9,10. Het is ook gebruikt om belangrijke metabole routes te monitoren, zoals glycolyse11,12, redoxhomeostase13,14 en pH-regulatie15,16. Naast fundamenteel onderzoek wordt hypergepolariseerde NMR nu gebruikt in klinische beeldvorming door middel van MRI, waardoor metabole beoordeling van de cellulaire schaal tot de schaal van het hele lichaam mogelijk is17. Deze ontwikkelingen onderstrepen de groeiende vraag naar toegankelijke protocollen die het bredere gebruik van hypergepolariseerde NMR in diverse biologische contexten mogelijk maken.

Ondanks zijn veelzijdigheid blijft het implementeren van real-time metabole metingen in levende cellen met behulp van gehyperpolariseerde NMR technisch uitdagend. Conventionele systemen zijn vaak afhankelijk van complexe, laboratoriumspecifieke opstellingen die niet reproduceerbaar zijn en moeilijk te bedienen zijn zonder uitgebreide expertise 8,18,19,20. Dit vormt een grote barrière voor onderzoekers die deze technologie willen toepassen voor biologisch of translationeel onderzoek. Vergeleken met alternatieve methoden zoals optische beeldvorming of massaspectrometrie, maakt gehyperpolariseerde 13C NMR niet-invasieve, tijdopgeloste monitoring van specifieke metabole reacties mogelijk zonder destructieve bemonstering. Het biedt directe biochemische informatie met temporele precisie, waardoor het zeer geschikt is voor dynamische studies van het cellulaire metabolisme.

Om deze beperkingen aan te pakken, presenteert deze studie een praktisch en reproduceerbaar protocol dat speciaal is ontworpen om onderzoekers in staat te stellen hypergepolariseerde NMR-metingen van het metabolisme van levende cellen uit te voeren met minimale technische hindernissen. Er wordt een uitgebreide methode beschreven voor de basismeting van het pyruvaatmetabolisme in levende cellen. Hoewel dit protocol kan worden toegepast op andere 13C-gelabelde sondes, is pyruvaat bijzonder geschikt vanwege zijn snelle cellulaire opname, goed gekarakteriseerde metabole routes en zijn centrale rol in het cellulaire metabolisme. De procedure bestaat uit: (i) voorbereiding van celmonsters, (ii) inkapseling in alginaatgels, (iii) hyperpolarisatie met behulp van een DNP-polarisator, en (iv) real-time 13C NMR-meting in een 400 MHz spectrometer (Figuur 1). Bovendien worden belangrijke parameters voor de bouw van het bioreactorsysteem verstrekt om de reproduceerbaarheid en compatibiliteit met standaard NMR-hardware te garanderen. Het protocol is geoptimaliseerd voor eenvoudige implementatie met behulp van in de handel verkrijgbare componenten en is bedoeld om onderzoekers, vooral degenen die nieuw zijn in de techniek, te helpen bepalen of deze geschikt is voor hun experimentele behoeften.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Opstelling van de bioreactor (Figuur 2A-B)

  1. Montage van de NMR-buis
    1. Gebruik een NMR-buis met schroefdop (diameter 10 mm, lengte 178 mm) met een open dop voor het inbrengen van de slang.
    2. Bereid een septum van siliconen/PTFE-injectieflacon (diameter 9 mm) voor en steek er een PEEK-buisje doorheen voor een goede afdichting (aanvullende afbeelding 1).
    3. Steek het septum met chemisch resistente PEEK-slang (binnendiameter 1,0 mm, buitendiameter 1,6 mm, wanddikte 0,3 mm, lengte 1 m) in de opening van de gewijzigde dop.
    4. Plaats het septum tussen de NMR-buis en de open dop en zet het vast door de dop stevig te sluiten. Deze opstelling houdt het septum op zijn plaats en zorgt voor een voldoende afdichting om lekkage tijdens perfusie of injectie te voorkomen.
  2. Slangen voor mediumafgifte instellen (Afbeelding 2C)
    1. Sluit de PEEK-slang aan op de inlaat- en uitlaatpoorten van de NMR-buis om continue perfusie mogelijk te maken. Zet de verbindingen vast met een flensloze fittingset om lekkage te voorkomen.
  3. Installatie van de componenten voor medium opwarming
    1. Sluit de PEEK-slang aan op een peristaltische pomp die kan worden ingesteld op een stabiel debiet van ongeveer 0.2 ml/min, waardoor een continue mediumcirculatie wordt gegarandeerd via een externe circulatiekit. Plaats het middelgrote reservoir in een waterbad dat is ingesteld op 37 °C om de temperatuur op peil te houden.
  4. Toevoeging van een component ter voorkoming van gellekkage
    1. Knip een dichte spons af zodat deze in de diameter van de NMR-buis past. Steek de spons in de bodem van de buis om lekkage van alginaatgel te voorkomen en tegelijkertijd een gemiddelde stroom mogelijk te maken.
  5. Fabricage en invoegen van het 3D-geprinte sponsbevestigingsonderdeel (Figuur 2D-F)
    1. 3D-print een cilindrische houder (buitendiameter 9,1 mm, lengte 20 mm, met een centraal gat van 1,5 mm diameter) met behulp van een fotopolymeerhars die compatibel is met stereolithografisch 3D-printen. De ontwerpspecificaties zijn opgenomen in het bijgevoegde aanvullende dossier 1.
    2. Steek een capillair van borosilicaatglas (buitendiameter 1,5 mm, binnendiameter ongeveer 0,9 mm, lengte 90 mm) door het voorgevormde gat van de 3D-geprinte houder.
    3. Bevestig de spons aan het platform op de houder met behulp van UV-uithardende hars met waterbestendigheid. Hard 30 s uit onder UV-licht om stolling te garanderen.
    4. Steek de gemonteerde houder met spons in de NMR-buis.

2. Celvoorbereiding (start 2 weken voor de meting)

  1. Ontdooi bevroren celvoorraden (SCCVII of HeLa) snel in een waterbad van 37 °C. Breng ongeveer 1 × 106 cellen over in 10 ml RPMI-1640 medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum en 1% (v/v) penicilline-streptomycine.
  2. Kweek cellen bij 37 °C met 5% CO2 en passeer ze elke 2-3 dagen zodra 70%-80% samenvloeiing is bereikt. Ga ongeveer 2 weken door met kweken om ~4 x 107 cellen te verkrijgen, geschat op vijf schaaltjes van 10 cm die zijn gegroeid tot ongeveer 90% confluentie (elk met ~8 x 106 cellen).

3. Bereiding van alginaatgel

  1. Bereiding van alginaatoplossing
    1. Los natriumalginaatpoeder van biologische onderzoekskwaliteit op in gedeïoniseerd water om een oplossing van 2% (m/v) te bereiden. Incubeer de oplossing een nacht bij 25 °C of hoger en schud voorzichtig met één stuk. Gebruik een buisrotator die is ingesteld op ongeveer 10-20 tpm om luchtbellen te voorkomen en een gelijkmatige oplossing te garanderen.
  2. Inkapseling van cellen in alginaatgel
    1. Voeg 2 ml 0,25% (v/v) trypsine-EDTA toe aan de schaal van 10 cm. Kantel de schaal om het hele oppervlak te bedekken en zuig het overtollige trypsine-EDTA op.
    2. Incubeer de schaal gedurende 2 minuten bij 37 °C.
    3. Voeg 10 ml kweekmedium toe aan het gerecht. Piket voorzichtig op en neer om de cellen los te maken. Verzamel de volledige celsuspensie in een conische buis van 15 ml.
    4. Neem ongeveer 10 μl van de suspensie en tel het aantal cellen met behulp van een cellenteller. Meestal zijn ongeveer 1 × de 107 cellen nodig voor de volgende procedures, maar het werkelijke aantal moet worden bevestigd door meting.
    5. Centrifugeer de resterende celsuspensie bij 120 × g gedurende 5 min. Verwijder het bovenstaande en suspendeer de celpellet opnieuw in 4 ml 2% (m/v) alginaatoplossing. Pipetteer langzaam om het ontstaan van luchtbellen te minimaliseren.
  3. Gelvorming door calciumverknoping (Figuur 3)
    1. Voeg 10 ml 50 ml CaCl2-oplossing toe aan een centrifugebuis van 50 ml (figuur 3A).
    2. Doe 300 μl van het cel-alginaatmengsel in een spuit van 0,5 ml die is uitgerust met een naald van 30 g van 10 mm en bevestig deze op de dop van de centrifugebuis (afbeelding 3B).
    3. Sluit de dop van de centrifugebuis goed af met de spuit erop bevestigd en centrifugeer het hele geheel voorzichtig op 200 × g gedurende 5 minuten. Verwijder de bovenstaande oplossing na het centrifugeren en suspendeer de met cellen beladen gel opnieuw in het medium (figuur 3C-D).
  4. De gel in de NMR-buis laden
    1. Breng de in de cel ingekapselde gel over in de NMR-buis met behulp van een pasteurpipet. Plaats de sponsbevestiging en zorg voor een goede afdichting.
    2. Verwarm het in stap 1.3.2 voorbereide medium reservoir (met 5% (v/v) D2O) in een waterbad voor tot 37 °C en laat het circuleren met een snelheid van ongeveer 500 μL/h om de omstandigheden te stabiliseren.
    3. Zorg ervoor dat er geen lekken zijn voordat u de NMR-buis in de magneet plaatst. Terwijl u de PEEK-slang recht houdt, steekt u de NMR-buis in de magneet. Pas de gelgrootte, het aantal kralen en de pipetteersnelheid aan op basis van het celtype en de experimentele vereisten.

4. Voorbereiding van een gehyperpolariseerde sonde met behulp van een DNP-polarisator (Figuur 4)

  1. Bereiding van de monsterflacon
    1. Voeg 18 μL [1-13C] pyrodruivenzuur (14,2 M) gedoteerd met 25 mM OX063 toe aan een monsterinjectieflacon. Sluit de injectieflacon aan op het vloeistofpad van het DNP-polarisatiesysteem.
  2. Polarisatie van het monster
    1. Plaats de injectieflacon in de boring van de DNP-polarisator (6,7 T, 1,25 K, 1,2 mbar). Pas microgolfbestraling toe op ongeveer 188 GHz (22 mW) gedurende 60-80 minuten.
  3. Bewakingssignaal tijdens polarisatie
    1. Gebruik de solid-state NMR-spectrometer die in het DNP-systeem is ingebouwd om de signaalintensiteit van 13C te bewaken. Registreer signaalgegevens elke 5 minuten met behulp van de NMR-software (SPINit).
  4. Los de gehyperpolariseerde oplossing op en bereid deze voor
    1. Los het gepolariseerde monster snel op in 3,2 ml voorverwarmde oplossingsbuffer (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg/L EDTA). Zorg ervoor dat de oplossing de biologische temperatuur bereikt (308-313 K, pH ~7) voordat u deze overbrengt voor NMR-meting.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het hanteren van hogedrukcomponenten. Verwarm de oplossingsbuffer voor op ~461 K om een efficiënte overdracht en monsterintegriteit te garanderen.

5. NMR-opstelling

  1. Voorbereiding van de NMR-spectrometer
    1. Laad het monster in de NMR-buis en plaats het in de spectrometer.
    2. Voer vergrendeling, afstemming, matching en shimming uit op de NMR-console met behulp van de geautomatiseerde procedure met ingevoegd sample, om de spectrale resolutie en signaalstabiliteit te optimaliseren.
  2. Instellen van de acquisitieparameters
    1. Laad een 13C puls-acquie-sequentie (bijv. zg2d) met protonontkoppeling ingeschakeld (bijv. 13-CPD).
    2. Stel de fliphoek in op 90° met behulp van een puls van 1 μs (P1). Stel de acquisitietijd in op 1,376 s, de spectrale breedte op 23.663 Hz en het aantal acquisitiepunten (TD) op 65.536. Stel de ontspanningsvertraging (D1) in op 0 s.
    3. Stel het aantal tijdsintervallen (TD1) in op 150 om 150 sequentiële spectra te verkrijgen in pseudo-2D-modus. Stel de versterking van de ontvanger in op een lage waarde (bijv. ~1) om signaalverzadiging van hypergepolariseerde samples te voorkomen.
      OPMERKING: Vanwege de hoge signaalintensiteit van gehyperpolariseerde NMR, stelt u de versterking van de ontvanger in op een lage waarde (bijv. ~1), wat doorgaans overeenkomt met minder dan 1% van de maximaal beschikbare versterking. De ontvangerversterking is een interne, eenheidsloze parameter die de signaalversterking regelt. Te hoge waarden kunnen leiden tot signaalverzadiging.

6. NMR-meting

  1. Voorbereiding voor meting
    1. Vul het gehele pad van de inlaatslang van de inlaatslang naar de NMR-buis met oplossingsbuffer om luchtinsluiting te voorkomen (Figuur 2B). De inlaatslang wordt gebruikt voor zowel mediumperfusie als hypergepolariseerde sonde-injectie.
    2. Controleer zorgvuldig of er geen luchtbellen aanwezig zijn in de inlaatslang of in de NMR-buis, aangezien bellen in dit gebied de signaalopname tijdens NMR-metingen kunnen verstoren.
  2. Bereiding voor injectie van gehyperpolariseerde oplossing
    1. Stop de peristaltische pomp om de mediumcirculatie tijdelijk te stoppen voordat de hypergepolariseerde oplossing via de inlaatslang wordt geïnjecteerd.
    2. Begin ongeveer 10 s met de spectrale acquisitie voordat het gehyperpolariseerde substraat wordt opgelost om ervoor te zorgen dat het signaal onmiddellijk na aankomst op de NMR-detectieplaats na injectie wordt opgevangen.
    3. Zuig 1 ml van de oplossing op met een spuit wanneer deze de DNP-polarisator verlaat.
  3. Injectie van de gehyperpolariseerde oplossing en bevestiging van het signaal
    1. Zet de driewegklep bij de inlaat van de bioreactor in stand B om de hypergepolariseerde oplossing in de NMR-buis te injecteren.
    2. Zet de klep na injectie terug naar stand A om de mediumcirculatie te hervatten en terugstroming te voorkomen.
    3. Bevestig een succesvolle injectie en aankomst van het substraat door een toename van het Free Induction Decay (FID)-signaal in de acquisitiesoftware waar te nemen.

7. Gegevensverwerking en -analyse

  1. Verwerking van spectrale gegevens
    1. Laad het tijdopgeloste NMR-spectrum in de gegevensverwerkingssoftware. Als de gegevens zijn opgeslagen in ser-bestandsindeling, zoekt u het juiste bestand en laadt u het.
  2. Analyse van de spectra
    1. Voer de Fouriertransformatie (FT) uit om de ruwe FID om te zetten in het frequentiedomein. Pas fasecorrectie handmatig of automatisch toe. Voer basislijncorrectie uit om vervormingen te verwijderen.
  3. Visualisatie van metabolietconversie
    1. Zet de tijdverloopsignalen voor pyruvaat C1 (~171 ppm) en lactaat C1 (~183 ppm) in kaart.
  4. Kwantificering van metabole conversie
    1. Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) voor de pyruvaat- en lactaatpieken.
    2. Bepaal de verhouding [Lactaat]/[Pyruvaat] door de AUC van lactaat te delen door die van pyruvaat.
      OPMERKING: AUC wordt gebruikt in plaats van piekhoogte om de invloed van rinkelende artefacten veroorzaakt door het grote hypergepolariseerde [1-¹³C] pyruvaatsignaal te minimaliseren. De AUC-waarden worden verkregen door de eenvoudige optelling van signaalintensiteiten binnen het gedefinieerde integratiebereik voor elke piek.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werd een gefabriceerd systeem gekoppeld aan gehyperpolariseerde 13C NMR-spectroscopie om het pyruvaatmetabolisme in levende cellen in realtime te meten. De belangrijkste signalen die in het 1D 13C NMR-spectrum werden gedetecteerd, kwamen overeen met pyruvaat (ongeveer 171 ppm) en lactaat (ongeveer 183 ppm)21, waardoor we de metabole omzetting van pyruvaat in lactaat onder fysiologische omstandigheden kunnen evalueren (Figuur 4).

Spectrale kwaliteit en signaaldynamiek
Representatieve resultaten van herhaalde metingen op hetzelfde monster met behulp van SCCVII-cellen - een plaveiselcelcarcinoomlijn van muizen die vaak wordt gebruikt in gehyperpolariseerde MRI-onderzoeken - worden weergegeven in figuur 5. De eerste meting vertoonde een duidelijke toename van het lactaatsignaal, wat wijst op actieve metabole conversie. Daaropvolgende metingen met tussenpozen van 1,5 uur toonden echter een progressieve afname van de metabole activiteit. Deze tijdsafhankelijke vermindering weerspiegelt waarschijnlijk biologische stress of aanpassing veroorzaakt door de initiële pyruvaatinjectie. Met name is een vergelijkbare voorbijgaande metabole modulatie in vivo gerapporteerd met behulp van gehyperpolariseerde MRI en EPRI, waarbij de oxygenatie van de tumor tijdelijk afnam na toediening van pyruvaat22. Deze resultaten tonen aan dat de herhaalbaarheid van deze metingen het mogelijk maakt om dynamische metabolische veranderingen op niet-destructieve wijze te volgen - een voordeel dat moeilijk te bereiken is met destructieve methoden23.

Om de toepasbaarheid van dit protocol op andere celtypen te evalueren, werden aanvullende metingen uitgevoerd met behulp van HeLa-cellen, een veelgebruikte menselijke kankercellijn. Zoals te zien is in figuur 6, vertoonden HeLa-cellen ook een duidelijke omzetting van pyruvaat naar lactaat. Hoewel de signaalintensiteit geleidelijk afnam als gevolg van de T 1-versoepeling, bleef de signaal-ruisverhouding gedurende de acquisitieperiode van de jaren 60 voldoende. Deze bevindingen suggereren dat het huidige protocol breed toepasbaar is en kan dienen als een veelzijdig hulpmiddel voor real-time metabole profilering in verschillende celtypen.

Hoewel snel signaalverval een inherente beperking is van DNP-gebaseerde NMR, minimaliseert ons in-situ mengsysteem de vertraging tussen oplossing en meting, waardoor de detectiegevoeligheid wordt verbeterd. Verdere verfijningen, zoals het optimaliseren van de samenstelling van de gelmatrix, kunnen de toepasbaarheid van deze methode uitbreiden naar een breder scala aan biologische systemen.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch diagram van de algehele workflow van celcultuur tot hypergepolariseerde NMR-meting. Het proces begint met celkweek (~2 weken), gevolgd door de bereiding van alginaatgel (~60 min) om cellen in te kapselen voor een stabiele meting. Vervolgens wordt hyperpolarisatie uitgevoerd met behulp van een DNP-polarisatiesysteem (~60 min) en wordt NMR-meting uitgevoerd met behulp van een 400 MHz NMR-spectrometer (~5 min). De foto's aan de rechterkant tonen de bijbehorende instrumenten die in deze workflow worden gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bioreactoropstelling voor gehyperpolariseerde NMR-meting. (A) Schematisch schema van de opstelling van de bioreactor. Het kweekmedium wordt via inlaat A in de NMR-buis ingebracht en vervolgens naar het afval geleid. Alginaatkralen met levende cellen worden in de NMR-buis geplaatst. Tijdens gehyperpolariseerde NMR-metingen wordt de gehyperpolariseerde sonde geïnjecteerd via inlaat B, aangeduid als de gehyperpolariseerde sonde-inlaat. (B) Foto van de gehele opstelling van de bioreactor, met de inlaat- en uitlaatslang duidelijk gelabeld. (C) Close-up van de schakelaar van de inlaatslang, met inlaat A (mediumperfusie) en inlaat B (hypergepolariseerde sonde-injectie). (D) CAD-ontwerp en (E) representatieve foto van het 3D-geprinte sponsbevestigingsonderdeel dat in de NMR-buis is geplaatst. Het onderdeel bevat een gat voor het geleiden van een glazen capillair dat de hypergepolariseerde substraatoplossing levert en een platform om een spons vast te houden. Het onderdeel zelf past niet strak tegen de binnenwand van de NMR-buis; (F) in plaats daarvan wordt er een spons omheen gestoken om het gat op te vullen. Deze structuur stabiliseert het onderdeel en zorgt ervoor dat het afvalmedium door de spons naar boven kan stromen, waardoor er geen extra uitlaatopening nodig is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Preparaat van alginaatgel. (A) Schematische illustratie en (B) foto van het apparaat voor de vorming van alginaatgelballen. De linker afbeelding toont de hele opstelling, inclusief de centrifugebuis met een spuit die aan het aangepaste deksel is bevestigd. De afbeelding rechtsboven toont een deksel met een klein gaatje voor de punt van de spuit, terwijl de afbeelding rechtsonder een deksel toont met een vierkante opening voor een stabiele positionering van de spuit. De centrifugebuis is voorgevuld met 10 ml calciumchloride-oplossing, waardoor de alginaatoplossing die de spuitpunt verlaat, kan gelellen, waardoor alginaatgelballen worden gevormd. (C) Representatief microscopisch beeld van de morfologie van alginaatgelballen. (D) Representatief microscopisch beeld van de morfologie van alginaatgelballen die HeLa-cellen bevatten. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Schematische weergave van de voorbereidingsstappen voor NMR-meting en hyperpolarisatie. Tijdens het DNP-opbouwproces van ~60 minuten wordt de NMR-instelling parallel uitgevoerd om vertragingen te minimaliseren. De voorbereiding omvat het laden van alginaatparels in de NMR-buis, gevolgd door 1H lock-aanpassing, vulvulling en sonde-afstemming om ervoor te zorgen dat het systeem klaar is voor onmiddellijke meting. Na oplossing en in situ menging onthult tijdopgeloste 13C NMR-spectroscopie duidelijke pyruvaat- en lactaatpieken. De pieken waargenomen bij ongeveer 171 ppm, 179 ppm en 183 ppm komen overeen met respectievelijk pyruvaat, pyruvaathydraat en lactaat. Voor de NMR-meting werden ongeveer 4 × 107 HeLa-cellen ingekapseld in alginaatgel gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Tijdopgeloste detectie van pyruvaat- en lactaatsignalen bij herhaalde metingen. Gehyperpolariseerde 13C NMR-spectra van hetzelfde SCCVII-celingekapselde monster werden met tussenpozen van 1,5 uur verkregen om de haalbaarheid van herhaalde niet-destructieve metingen te evalueren. Pyruvaat (open cirkels) en lactaat (gevulde cirkels, geschaald met 1000×) piekintensiteiten worden voor elke acquisitie in de tijd uitgezet. (A) Eerste meting. (B) De tweede meting, na 1,5 uur, laat een duidelijke vermindering van de lactaatproductie zien. (C) De derde meting, na nog eens 1,5 uur, bevestigde een aanhoudend lage metabole activiteit. Kwantitatieve analyse op basis van de oppervlakte onder de curve (AUC) toonde aan dat de verhouding [Lactaat] / [Pyruvaat] daalde van 0,00134 (eerste meting) tot 0,00019 (tweede) en 0,00027 (derde). De uiteindelijke celconcentratie in de alginaatgel was ongeveer 1,0 × 107 cellen/ml (4 × 107 cellen in 4 ml). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6 : Omzetting van pyruvaat in lactaat in HeLa-cellen. Tijdopgeloste hypergepolariseerde 13C NMR-signalen van pyruvaat en lactaat werden gemeten in levende HeLa-cellen. De signaalintensiteit van pyruvaat wordt genormaliseerd tot de maximale waarde op tijdstip nul. De intensiteit van het lactaatsignaal wordt geschaald met een factor 103 voor zichtbaarheid. Kwantitatieve analyse op basis van de oppervlakte onder de curve (AUC) toonde een [Lactaat]/[Pyruvaat] verhouding van 0,00121. De uiteindelijke celconcentratie in de alginaatgel was ongeveer 7,5 × 106 cellen/ml (3 × 107 cellen in 4 ml). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 

Aanvullende figuur 1. Representatieve beelden van het septum van de injectieflacon dat in het bioreactorsysteem wordt gebruikt. (A) Siliconen/PTFE septum (9 mm diameter) voor gebruik. (B) Hetzelfde septum in daadwerkelijk gebruik, met PEEK-slang ingebracht door doorboorde gaten. De elasticiteit van het septummateriaal zorgt ervoor dat het opnieuw kan afdichten rond de slang, waardoor luchtdichte omstandigheden behouden blijven tijdens hypergepolariseerde substraatinjectie. Klik hier om deze figuur te downloaden

Aanvullende figuur 2: Tijdopgelost gehyperpolariseerd 13C NMR-spectrum verkregen na externe menging. Representatief in de tijd opgelost spectrum van [1-13C] pyruvaatmetabolisme gemeten met behulp van een benchtop NMR-systeem na externe menging van gehyperpolariseerd pyruvaat en cellen buiten de NMR-buis. Klik hier om deze figuur te downloaden

Aanvullend bestand 1: CAD-ontwerp van de cilindrische houder. Klik hier om dit bestand te downloaden

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kritieke stappen van het protocol
Het succes van dit protocol hangt af van verschillende cruciale stappen. Ten eerste is het belangrijk om te zorgen voor een goede oplossing en overdracht van gehyperpolariseerd 13C pyruvaat om een hoge signaal-ruisverhouding te behouden. Om de vroege metabole omzetting van pyruvaat naar lactaat vast te leggen, moet de timing van de injectie van de gehyperpolariseerde sonde en de NMR-acquisitie worden gesynchroniseerd. Bovendien is het belangrijk om de levensvatbaarheid van de cellen tijdens het experiment te behouden. Afwijkingen van deze parameters kunnen leiden tot verminderde metabolische activiteit en signaalverlies.

Wijzigingen en probleemoplossing van de methode
Hoewel dit protocol een robuuste aanpak biedt voor real-time metabole monitoring, kunnen bepaalde wijzigingen de toepasbaarheid ervan verbeteren. Door bijvoorbeeld de fliphoek van de NMR-acquisitie aan te passen, kunnen signaalintensiteit en polarisatieverval in evenwicht worden gebracht om de gegevensverzameling te optimaliseren. Hoewel er een methode is geïntroduceerd om alginaatgels van een bepaalde grootte stabiel te bereiden, kan de grootte van de te maken gels eenvoudig worden aangepast door een spuit of naald te kiezen. Dit kan bijdragen aan het reproduceren van een hypoxische omgeving24 en voorkomen dat cellen uit de NMR-buis ontsnappen. Bovendien wordt de alginaatgel dicht en stroperig in de NMR-buis, vooral in het NMR-meetgebied. Als er lucht binnenkomt bij het injecteren van het kweekmedium of de hypergepolariseerde sonde uit de PEEK-buis, blijft deze waarschijnlijk op de NMR-meetplaats, wat zal leiden tot een afname van de kwaliteit van het spectrum.

Beperkingen van de methode
Hoewel hypergepolariseerde metingen het voordeel hebben van een hoge gevoeligheid van NMR-signalen, hebben ze inherente beperkingen. Vanwege de T1-relaxatie van gehyperpolariseerd 13C pyruvaat is de duur van metabole metingen beperkt tot ongeveer 1 minuut, waardoor de waarneming van metabole verschuivingen op lange termijn wordt beperkt. Bovendien is het moeilijk om een celmonster enkele uren nadat het eenmaal is gemeten te meten, wat te maken kan hebben met het druppelen van een grote hoeveelheid pyruvaat in één meting. Dit is hetzelfde als het feit dat verwante groepen een dag later spectra hebben gemeten18, en het meetinterval moet zo lang zijn.

Belang van de methode ten opzichte van bestaande technieken
Vergeleken met conventionele metabole assays heeft onze methode een voordeel ten opzichte van eindpuntmetingen zoals massaspectrometrie en biochemische assays omdat het real-time inzicht geeft in het cellulaire metabolisme. Hoewel vergelijkbare gehyperpolariseerde NMR-spectra kunnen worden verkregen zonder gebruik te maken van een bioreactor, is de mogelijkheid om onmiddellijk met metingen te beginnen met in situ menging gunstig, gezien de snelheid van ontspanning. Bovendien kunnen cellen vóór injectie in een stabiele omgeving worden ingesteld, waardoor de reproduceerbaarheid en kinetische nauwkeurigheid van metabole analyse worden verbeterd. Dit voordeel wordt ondersteund door een aanvullend experiment (aanvullende figuur 2), waarbij in de tijd opgeloste spectra werden verkregen met behulp van een benchtop NMR-systeem na externe menging. In deze opstelling leidde een vertraging van ongeveer 30 s tussen het mengen en het verkrijgen van het signaal tot aanzienlijk polarisatieverlies, wat met name de detectie van lactaat beïnvloedde. Dit bevestigt dat in situ menging de getrouwheid van kinetische metingen verbetert onder omstandigheden met snel T1-verval . Het is echter vermeldenswaard dat de signaalintensiteit in deze in-situ opstelling lager was, waarschijnlijk als gevolg van verdunning veroorzaakt door mediumperfusie - een probleem dat nog moet worden geoptimaliseerd.

Belang en mogelijke toepassingen
Deze methode kan de weg vrijmaken voor toepassingen bij het begrijpen van de metabolische eigenschappen van diverse levensvormen. Real-time meting van metabole fluxen stelt onderzoekers in staat om de effecten van metabole remmers dynamisch te beoordelen. Door deze aanpak te integreren met andere meettechnieken kan de nauwkeurigheid van de analyse van het intracellulaire metabolisme verder worden verbeterd.

We stellen ons een praktische experimentele workflow voor waarin destructieve, high-throughput metabolomics worden gebruikt om kandidaat-routes te identificeren, gevolgd door real-time validatie met behulp van gehyperpolariseerde 13C NMR om de enzymfunctie en fluxdynamiek in levende cellen te evalueren. Deze benadering maakt de directe detectie van voorbijgaande metabole reacties onder fysiologische omstandigheden mogelijk - iets wat moeilijk te bereiken is met behulp van immunoassays of fluorescentiesensoren, die doorgaans statische metabolietniveaus meten of exogene sondes vereisen. Hoewel fluorescentiebeeldvorming en immunoassays onmisbaar zijn voor respectievelijk ruimtelijke lokalisatie en high-throughput screening, biedt hypergepolariseerde NMR een complementaire functionele uitlezing die de reactiekinetiek op een niet-destructieve manier vastlegt. Deze strategie faciliteert niet alleen mechanistische inzichten op cellulair niveau, maar dient ook als een brug naar diagnostische toepassingen op weefsel- of organismeschaal. Met name het vermogen om functionele metabole verschuivingen in realtime vast te leggen, kan de vroege opsporing van metabole stoornissen en therapeutische responsen in complexe biologische systemen ondersteunen.

Er is ook vooruitgang geboekt bij de ontwikkeling van metabole sondes die gericht zijn op diverse metabole routes en synthetische substraten die zijn ontworpen voor specifieke enzymen, waardoor de mogelijkheden voor metabool onderzoek worden uitgebreid25,26. Bovendien kan vooruitgang in hyperpolarisatietechnieken, zoals het rechtstreeks toedienen van gehyperpolariseerde substraten van de polarisator naar de NMR via een magnetische tunnel27, de signaalretentie verbeteren en de potentiële toepassingen van deze methode in biomedisch onderzoek uitbreiden.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant Number 23KJ2179 en 24K17833 (aan T.U.), 23K27561 (aan Y.T.); MEXT Q-LEAP [JPMXS0120330644 (naar Y.T.)]; en MEXT Bevordering van de ontwikkeling van een gezamenlijk gebruiks-/onderzoekssysteemproject: Coalition of Universities for Research Excellence Program (CURE) Grant Number JPMXP1323015488 (Spin-L-programma nr. spin24XQ007).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
[1-13C] pyruwzuurzuurCambridge Isot ope Laboratories, Inc.CLM-8077
3D-printerElegooSaturn 2
CalciumchlorideNacalai Tesque, Inc.06729-55
D2OSigma-Aldrich151882
Externe circulatieset voor pompAS ONE1-4141-02
Fetaal bovien serumGibco10270106
Flenset fittingsetGL Sciences Inc.6010-46390
Glazen capillair met kernNarishigeGDC-1.5Innerlijke diameter ~0,9 mm, lengte 90 mm
MagneetcirculatiepompAS ONE1-4141-01
MestReNovaMestrelab ResearchNMR spectrale verwerkings- en analysesoftware
My Shot-spuitNipro Corporation82770,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 stuks
OX063 Oxford Instruments Co. Ltd.  en Polarize IVS Co. Ltd. -
PEEK-buisAS ONE3-780-05
penicilline-streptomycineNacalai Tesque, Inc.26252-94
Peristaltische Bio Mini-pompATTO1221200Hoge precisie, breed debiettype voor stabiel mediumdebiet
HarsSiraya TechSmoky Black
RPMI-1640-mediumNacalai Tesque, Inc.30264-85
Siliconen/PTFE-vial septumGL Sciences Inc.1030-50009
Natriumalginaat 80-120FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation194-13321
SPINit-softwareRS2DNMR-software in de DNP-polarisator
Sponzen--Commercieel verkrijgbare spons op maat gesneden voor gelstabilisatie
Drieweg stopkraanAS ONE3-6247-04
TopSpinBrukerNMR dataverzameling en verwerkingssoftware
Trypsine-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific07086-74
UV-hardende harsBONDICBD-SKCJ
WaterbadAS ONE1-5832-41Thermische Robot TR-serie TR-1α voor het handhaven van een temperatuur van 37 °C
Wilmad NMR-buis met schroefdopSigmaZ271977Frequentie 400 MHz, diameter 10 mm, L 178 mm.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  2. Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function. Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).
  3. Balzan, R., et al. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J Vis Exp. (108), e53548(2016).
  4. Liu, M., Hilty, C. Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR. Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).
  5. Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast. Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).
  6. Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).
  7. Rao, Y., et al. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).
  8. Mathiassen, T. B. W., et al. Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system. J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).
  9. Meier, S., et al. Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life. Molecules. 29 (17), 4133(2024).
  10. Sriram, R., et al. Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate. ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).
  11. Park, J. M., et al. Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo. J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).
  12. Singh, J., et al. Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules. NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).
  13. Bohndiek, S. E., et al. Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo. J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).
  14. Yamamoto, K., et al. Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine. Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).
  15. Düwel, S., et al. Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid. Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).
  16. Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester. Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).
  17. Eills, J., et al. Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance. Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).
  18. Keshari, K. R., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism. Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).
  19. Sriram, R., et al. Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor. NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).
  20. Mangas-Florencio, L., et al. A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy. Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).
  21. Hill, D. K., et al. Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data. PLoS One. 8 (9), e71996(2013).
  22. Saito, K., et al. 13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors. Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).
  23. Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI. Mol Cancer. 15, 43(2016).
  24. Read, G. H., et al. Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).
  25. Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. Hyperpolarized NMR probes for biological assays. Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).
  26. Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging. Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).
  27. Milani, J., et al. A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids. Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Pyruvaatmetabolismebioreactorsysteemcelinkapselingalginaatgeldynamische kernpolarisatielactaatconversiemetabole profileringdrugscreening

Gerelateerde artikelen