Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Patiëntspecifieke iPSC-afgeleide cornnea-organoïden voor het onderzoeken van door aniridia geassocieerde hoornvliesaandoeningen

155 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68556

⸱

28 juli 2026

 ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, 3Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een protocol voor het genereren van cornea-organoïden uit iPSC's afkomstig van aniridiapatiënten, en creëren een patiëntspecifiek model om corneale aandoeningen te bestuderen. Deze organoïden bootsen belangrijke structurele en functionele kenmerken na en bieden een betrouwbaar in vitro platform voor het onderzoeken van ziektemechanismen, het testen van mogelijke behandelingen en het bevorderen van gepersonaliseerde regeneratieve benaderingen voor anterieure oogziekten.

Samenvatting

Aniridia is een zeldzame aangeboren oogaandoening die wordt gekenmerkt door de gedeeltelijke of volledige afwezigheid van de iris, en wordt vaak geassocieerd met hoornvliesopacificatie en een tekort aan limbale stamcellen. De onderliggende genetische mutaties, die voornamelijk het PAX6-gen beïnvloeden, verstoren zowel de ontwikkeling als de functie van het hoornvlies. De meest voorkomende oogkenmerken naast irisdefecten zijn nystagmus, foveale hypoplasie, staar, glaucoom en aniridia-geassocieerde keratopathie (AAK). Hoewel in vivo modellen waardevolle inzichten bieden in de pathologie van aniridie, zijn patiëntafgeleide in vitro-modellen cruciaal voor het onderzoeken van ziektemechanismen en het evalueren van potentiële therapieën. In deze studie presenteren we een in vitro AAK-model met patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Ons protocol omvat de stapsgewijze differentiatie van iPSC's tot corneale epitheelachtige cellen binnen zelfgeassembleerde driedimensionale organoïden, die de native corneale micro-omgeving nabootsen. Door het optimaliseren van differentiatiecultuurcondities hebben we met succes corneale organoïden gegenereerd die verschillende corneale celpopulaties herbergen, waarmee we de belangrijkste structurele en functionele eigenschappen van het menselijke hoornvlies recapituleren.

Inleiding

Het hoornvlies is een avasculair, transparant weefsel dat de buitenste laag van het oog vormt, bestaande uit voornamelijk drie lagen: een epitheliale buitenlaag, een stromale laag met een collageenrijke extracellulaire matrix bevolkt door keratocyten, en een endotheelcellaag1. Het hoornvlies speelt een essentiële rol in het zicht door interne oculaire structuren te beschermen en licht te breken.

Aniridien is een zeldzame, aangeboren panoculaire aandoening die voornamelijk wordt veroorzaakt door heterozygote mutaties in het gepaarde boxgen 6 (PAX6), een meesterregulator van de oculaire ontwikkeling, en wordt gekenmerkt door gedeeltelijke of volledige afwezigheid van iris2. Naast irishypoplasie of afwezigheid ontwikkelen de meeste patiënten progressieve corneale afwijkingen, gezamenlijk aniridia-geassocieerde keratopathie (AAK) genoemd, waaronder epitheeldefecten, limbale stamceldysfunctie, stromale veranderingen en progressieve hoornvliesopacificatie, wat uiteindelijk leidt tot visuele stoornissen. AAK treft ongeveer 78%–90% van de aniridiapatiënten, met toenemende ernst in de loop van de tijd3. We wilden een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol opstellen om cornea-organoïden te genereren uit aniridia-patiënt-afgeleide geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) om ziekte-relevante hoornvlinzenveranderingen in vitro te modelleren. Hoewel diermodellen en ex vivo studies waardevolle inzichten hebben opgeleverd in de pathogenese van aniridia, beperken soortspecifieke verschillen en beperkte toegang tot patiëntweefsel hun translatie-relevantie.

Organoïden van humane iPSC zijn uitgegroeid tot krachtige in vitro-systemen voor het modelleren van menselijke ontwikkeling en ziekte 4,5. Corneale organoïden maken met name de vorming mogelijk van driedimensionale weefselachtige structuren die meer lijken op de native corneale architectuur, waaronder gelaagde epitheelorganisatie, stromaal-epitheliale interacties en extracellulaire matrixafzetting, vergeleken met conventionele tweedimensionale monolaagculturen, die ruimtelijke organisatie, fysiologische cel-celinteracties en micro-omgevingscomplexiteitmissen 4,5. Verschillende differentiatiestrategieën, waaronder op SEAM gebaseerde en oculaire voorloper-gedreven benaderingen, zijn gerapporteerd die corneaal-achtig weefsel genereren uit iPSCs6. Deze benaderingen omvatten doorgaans een initiële fase van inductie van oculaire afstamming, gevolgd door progressieve weefselspecificatie en selectie uit heterogene oculaire voorloperpopulaties. Het creëren van organoïden van het hoornvlies biedt de mogelijkheid om verschillende celtypen te bestuderen die aanwezig zijn in hoornvliesweefsel 7,8. Bovendien maken organoïden van de cornea organoïden van aniridiapatiënten van hun iPSC-afgeleide cornea het mogelijk om de genetische achtergrond van de ziekte te bestuderen en bieden ze een unieke kans om aniridia te bestuderen.

In het huidige protocol worden zowel wildtype- als aniridia-afgeleide iPSC-lijnen onderworpen aan een identieke, meerfasige differentiatiestrategie, waarbij sequentiële blootstelling aan differentiatie (DM), retinale differentiatie (RDM) en corneale differentiatiemedia (CDM) over een langdurige, wekenlange kweekperiode wordt uitgevoerd. Een cruciale experimentele stap is de overgang van hechtende kweek naar suspensieomstandigheden, waarbij geselecteerde hoornvliesachtige gebieden worden behouden om de epitheliale zelforganisatie te bevorderen.

Hoewel deze benadering reproduceerbare generatie van corneale-achtige epitheelstructuren ondersteunt die geschikt zijn voor vergelijkende ziektemodellering, reproduceert deze complexe in vivo kenmerken zoals neurale innervatie of volledige limbale nicheorganisatie niet volledig, wat in overweging moet worden genomen bij het beoordelen van de toepasbaarheid van de methode.

In deze context beschrijven we een gestandaardiseerd protocol voor het genereren van cornea-organoïden uit patiënt-afgeleide iPSC's die PAX6-mutaties dragen die geassocieerd zijn met aniridia. Belangrijk is dat de differentiatiestrategie zelf niet wordt aangepast tussen wildtype- en aniridia-afgeleide lijnen; in plaats daarvan ontstaan ziekte-specifieke fenotypes uit de patiëntspecifieke genetische achtergrond binnen een verder uniform experimenteel kader.

Al met al biedt deze methode een robuust en reproduceerbaar platform voor het bestuderen van de ontwikkeling van het hoornvlies en de door aniridia geassocieerde ziektemechanismen en kan het dienen als basis voor toekomstige mechanistische en translationele studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de ethische commissie. De studie is geregistreerd in de database Human Pluripotent Stem Cell Registry (hPSCreg), en de ethische goedkeuringen zijn gedocumenteerd onder het Franse Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation (MESRI; IE-2018-967)9. De iPSC's worden aangeduid met de codes AAKIPSi001-A (AAK1), AAKIPSi002-A (AAK2), AAKIPSi003-A (AAK3) en WT (van gezondheidsdonoren). Bovendien heeft de ethische commissie van de Universiteit van Hacettepe het gebruik van dit onderzoek goedgekeurd, zoals blijkt uit referentienummer 16969557-1213. De menselijke cellijnen die in deze studie werden gebruikt, vereisten bij de verwerving nationale toezichthouders. De goedkeuring werd verleend onder een consortiumkader waarbij een van de auteurs betrokken was. Hoewel het huidige manuscript niet direct gerelateerd is aan dat consortiumproject, zijn de gebruikte biologische materialen verkregen en goedgekeurd binnen dat ethische kader. Daarom werd de goedkeuring van deze universiteit terecht aangehaald om volledige transparantie van regelgeving te waarborgen. Alle details met betrekking tot de materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in een laminaire flowkast (BSL-2) om een steriele omgeving te behouden. Deze opstelling zorgt ervoor dat alle materialen en apparatuur die in de studie worden gebruikt voldoende worden gesteriliseerd, waardoor het risico op besmetting wordt geminimaliseerd en de integriteit van de experimentele resultaten wordt gewaarborgd.

1. Generatie van door mensen geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC) afgeleide cornea-organoïden

  1. Onderhoud en initiële kweek van door aniridia afgeleide menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (AAK1, AAK2, AAK3)10 onder feeder-vrije geconditioneerde media (Figuur 1)
    1. Bereid het volgende van tevoren voor: Bedek één put in een 6-put plaat met 1 mL van een ijskoude extracellulaire matrix (ECM) oplossing bij een concentratie van 0,1 mg/mL. Deze coatingprocedure moet op ijs worden uitgevoerd, niet om de ECM te laten stollen, en moet minimaal 30 minuten bij 37 °C worden geïncubeerd, volgens de instructies van de fabrikant om een juiste substraatvoorbereiding te waarborgen.
    2. Ontdooi een cryopgereserveerde aliquot van 1 x 106 hiPSC (WT, AAK1, AAK2, AAK3). Ontdooi de bevroren cellen niet volledig; Laat in plaats daarvan de bevroren cel-suspensie in het cryoviale water ontdooien totdat ongeveer de helft van het volume bevroren blijft.
    3. Breng de gedeeltelijk ontdooide suspensie onmiddellijk over in 1 mL volledig onderhoudsmedium bij kamertemperatuur (RT) met 10 μM Rho-geassocieerde protetekinase (ROCK) remmer, vooraf gealiquoteerd in een 15 mL buis. Gebruik geen pipet tijdens de overdracht.
    4. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
    5. Daarna worden de cellen opnieuw opgeschorst in 1 mL volledig onderhoudsmedium met een 10 μM ROCK-remmer.
    6. Bepaal de celdichtheid met trypanblauwe uitsluiting. Tel cellen met een hemocytometer na levensvatbaarheidskleuring met trypanblauw. Kort samengevat: meng 20 μL celsuspensie 1:1 met 20 μL 0,4% trypanblauw, gevolgd door de toevoeging van 60 μL PBS, wat resulteert in een definitieve verdunning van 1:5 van de oorspronkelijke celsuspensie. Uit dit mengsel wordt 10 μL in de hemocytometerkamer geladen. Tel levensvatbare (trypan blauw–negatiefe) cellen in vier grote vakjes. Bereken het gemiddelde aantal cellen per vierkant en vermenigvuldig met 5 (cel-suspensieverdunningsfactor) en 10.000 om de uiteindelijke celconcentratie (cellen/mL) te bepalen.
      Cellen/mL = (Gemiddeld aantal cellen per vierkant) x 5 x 104
    7. Zaad de cellen op een voorbekleed ECM-put in een 6-well plaat, zodat een celdichtheid van 2 x 104 cellen /cm2 per put wordt gegarandeerd.
    8. Observeer de celmorfologie en hechting met behulp van fasecontrastmicroscopie bij 10x vergroting. Incubeer vervolgens de 6-wellplaten bij 37 °C met 5% CO₂ om optimale groeicondities te garanderen.
      OPMERKING: ROCK-remmer mag alleen 's nachts worden gebruikt tijdens het passeren of ontdooien van de cellen. Voeg het medium bij dagelijkse verversingen voorzichtig toe langs de wand van de put. Vermijd het verwarmen van het volledige onderhoudsmedium in een waterbad; Houd het medium in evenwicht op kamertemperatuur gedurende 15 minuten voor gebruik.
  2. Spontane differentiatiefase (Dag 0 – 2)
    1. Bereid het differentiatiemedium (DM) voor door het volgende te mengen: 8% KnockOut Serum Replacement (KSR), 1x niet-essentiële aminozuren (NEAA), 1x Glutamax, 1x Penicilline-Streptomycine en Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F-12).
    2. Zodra hiPSC-culturen ongeveer 70%–80% confluentie bereiken, aspireer je voorzichtig en verwijder je het medium om spontanedifferentiatie te induceren, en vervang het vervolgens dagelijks door 1 mL verse DM per put tot dag 3, wanneer de retinale differentiatiefase wordt gestart volgens de experimentele tijdlijn.
  3. Netvliesdifferentiatiefase (Dag 3 – 47)
    OPMERKING: Retinale differentiatiemedium wordt gedurende langere periodes gebruikt om de vorming van heterogene oculaire voorloperpopulaties mogelijk te maken.
    1. Bereid het retinale differentiatiemedium (RDM) voor door het volgende te mengen: 8% KSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 2% B27, 1x penicilline-streptomycine en DMEM/F-12.
    2. Na 2 dagen van spontane differentiatie vernieuw je het kweekmedium dagelijks door het DM-medium zorgvuldig te aspireren en te vervangen door 1 mL vers RDM-medium per put. Ga hier in totaal 30 dagen mee door.
      OPMERKING: Er wordt een significante toename van de celdichtheid verwacht gedurende deze periode van 30 dagen. Het is essentieel om microscopische waarnemingen te maken van de celdichtheid in verschillende gebieden van elke put. Om cellifting te voorkomen, moet wassen worden vermeden en moet er voorzichtigheid worden betracht tijdens het wisselen van medium. Voeg het medium toe door de wand van de put. Balanceer het medium op RT gedurende 15 minuten voor gebruik.
    3. Op dag 32 bereiken cellen een schijnbare staat van samenvloeiing en vormen ze meerlaagse 2,5D-aggregaten. In deze fase start je de overgang naar suspensiecultuur door de hele put voorzichtig te schrapen met een pipettip van 1000 μL. Tijdens dit proces fragmenteert u de cellaag in kleine clusters.
      OPMERKING: Hoewel alle cellen van het kweekoppervlak worden vrijgegeven, worden meerlaagse 2,5D-aggregaten bij voorkeur verzameld en overgebracht naar suspensiecultuur (Aanvullende Figuur 1), omdat hun verrijking snellere zelfassemblage en de vorming van grotere organoïden bevordert in vergelijking met losse cellen of monolaagfragmenten.
    4. Onmiddellijk na het schrapen verzamel je de resulterende celclusters en breng je ze over in laag-hechting 6-put kweekplaten met RDM om suspensiecultuurcondities vast te stellen.
    5. Houd cellen in suspensiecultuur nog eens 15 dagen, met dagelijkse middelmatige vervanging met 2 ml verse RDM per put. Vermijd tijdens de eerste 2 dagen van de suspensiekweek middelmatige verandering om verlies van kleine celclusters te voorkomen. Tijdens de suspensiekweek organiseren cellen zich geleidelijk en vormen ze 3D, transparante, corneale structuren, die regelmatig worden gecontroleerd met fasecontrastmicroscopie bij 4x en 10x vergroting.
  4. Fase van de intermediale differentiatie (Dag 48 – 90)
    1. Bereid het corneale differentiatiemedium (CDM) voor door het volgende te mengen: 8% KOSR, 1x NEAA, 1x Glutamax, 1x N2-MAX, 1x Insuline-Transferrine-Selenium, 5 ng/mL FGF2, 10 ng/mL EGF en DMEM/F-12.
    2. Na de eerste 15 dagen (van dag 32 tot dag 47) van ophangcultuur in platen met lage hechting (37 °C, 5% CO₂), vervang RDM door CDM terwijl de aggregaten onder ophangingscondities op dag 47 behouden blijven. Ververs de CDM om de dag met 2 ml per put, zodat organoïden altijd volledig in het kweekmedium worden ondergedompeld. In deze periode verschijnen er geleidelijk transparante, bubbelachtige primordiale (CP) structuurstructuren van het hoornvlies.
    3. Blijf de suspensiekweek in CDM gebruiken tot dag 90, zodat verdere rijping en ruimtelijke scheiding van transparante CP-gebieden van meer ondoorzichtige weefselcompartimenten mogelijk is.
    4. Op dag 90 moet transparante CP-gebieden mechanisch gescheiden worden van meer ondoorzichtige weefselcompartimenten met behulp van gesteriliseerde tangen en pincetten, wanneer CP-specifieke downstream-analyses bedoeld zijn.
      OPMERKING: Mechanische isolatie van CP-regio's wordt uitgevoerd wanneer analyses specifiek CP-verrijkte structuren vereisen. Als andere weefselcompartimenten of de algehele organoïde-architectuur van belang zijn, kunnen organoïden intact blijven om structurele heterogeniteit te behouden.
    5. Zet de suspensiekweek voort in CDM voor ofwel geïsoleerde CP-structuren of intacte organoïden, afhankelijk van het experimentele doel.

2. Karakterisering van corneale organoïden

  1. Morfologische en structurele evaluatie van organoïden
    1. Monitor organoïden van het hoornvlies regelmatig met brightfield-microscopie op 4x en 10x vergroting. Evalueer grootte, transparantie en algehele morfologie op bepaalde tijdstippen en documenteer structurele veranderingen door beeldverwerving.
  2. Karakterisering gebaseerd op immunofluorescentie
    1. Cornea-organoïde fixatie
      1. Bereid 4% PFA en 30% sucroseoplossingen voor vóór fixatie. Neem het cornea-organoïde uit de kweek met een autoclav-schep. Breng het organoïde over in de 4% PFA in een buisje van 1,5 mL en incubeer het 20 minuten op kamertemperatuur.
      2. Na de incubatie verwijder je de PFA voorzichtig uit de buis zonder het hoornvliesorganoïde te beschadigen. Voeg 1 ml 30% sucroseoplossing toe aan de buis en plaats deze op 4 °C. Na 24 uur bereid je 5 mL buizen en vloeibare stikstof voor voor OCT-fixatie voor en label.
      3. Gooi de sucroseoplossing voorzichtig uit de buis. Breng de organoïde over in de steriele schep. Verwijder met een 20 μL pipet voorzichtig de overtollige sucroseoplossing uit de organoïde.
      4. Giet OCT in de 5 mL buisdop en plaats de organoïde in de OCT. Gebruik een andere steriele schep om de organoïde in de OCT-bevattende dop te brengen.
      5. Voeg OCT toe om het oppervlak van het organeoïde van het hoornvlies te bedekken. Pop de ballonnen in de OCT met een naald om duidelijke delen van het organoïde te verkrijgen.
      6. Sluit de dop van de 5 mL buizen en doop met een pincet in de vloeibare stikstof. Bewaar de monsters in -20 °C tot het in secties wordt geplaatst.
      7. Snijd ze in op 5 μm dikte met een cryostaat en bewaar ze ook bij -20 °C tot het kleuren is. Houd een consistente doorsnededikte en weefseloriëntatie om reproduceerbare kleuring te garanderen.
    2. IF-kleuring
      1. Om organoïde secties van het hoornvlies voor te bereiden op IF-kleuring, was je de glaasjes 3 keer met PBS-T (0,3% Triton X-100) op RT gedurende 10 minuten.
      2. Maak de glaasje schoon met vloeipapier en maak een rand met PAP-pen. Voeg een geschikte hoeveelheid blokkeringsoplossing toe om het weefselgedeelte volledig te bedekken (meestal 100 – 200 μL per dia, afhankelijk van de grens van de PAP-pen) en incubeer het 1 uur bij RT.
      3. Aspireer de blokkeringsoplossing en maak een rand met de PAP-pen. Voeg de 150 μl primaire Ab (PAX6, p63, OCT3/4, NANOG, Na+/K+-ATPase, AQP1, CK3, CK5, CK14, CK19, N-cad, KERA, COLIV, de verdunningsrates staan vermeld in de Table of Materials) oplossingen op de glaasje en incubeer deze 1 uur bij RT.
      4. Was 2x met PBS-T (0,3% Triton X-100) bij RT gedurende 10 minuten. Maak de rand opnieuw met een PAP-pen.
      5. Voeg de 150 μl secundaire Ab-oplossing (Anti Rabbit-488, Anti Mouse-594, de verdunningssnelheden staan vermeld in de Materiaaltabel) toe aan de glaasglaas en incubeer deze bij RT onder donkere omstandigheden gedurende 2 uur. Was 2x met PBS-T (0,3% Triton-X) bij RT gedurende 10 minuten. Maak de slides schoon en monteer met een DAPI-oplossing.
      6. Voor ongedifferentieerde iPSC's voer je blokking en permeabilisatie uit na fixatie en ga je verder met kleuring volgens hetzelfde protocol. Visualiseer gekleurde monsters met fluorescentie- of confocale microscopie met 4x en 10x vergroting.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Stamheid van menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's)

Om de stamheid van de menselijke iPSC's die in de experimenten werden gebruikt te beoordelen, voerden we brightfield-beeldvorming, immunokleuring en qRT-PCR-analyse uit. We evalueerden de expressie van belangrijke pluripotentiemarkers, waaronder OCT3/4, SOX2 en NANOG, die kerntranscriptiefactoren zijn die nodig zijn voor het behoud van pluripotentie en zelfvernieuwi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vergelijkende analyse tussen controleorganoïden en die afkomstig van aniridiapatiënten toont defecten in epitheelstratificatie, abnormale extracellulaire matrixafzetting en gestoorde expressie van het PAX6-gen 9.

De groeisnelheid van iPSC's afkomstig van verschillende aniridia-patiëntenmonsters, specifiek AAK1-, AAK2- en AAK3-lijnen, vertoont variabiliteit, wat mogelijk de onderliggende genetische diversiteit weerspiegelt, voor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben dit niet bekendgemaakt.

Dankbetuigingen

Deze studie wordt gefinancierd door TÜBİTAK 121N276 en het Europees Gezamenlijk Programma voor Zeldzame Ziekten en wordt gedeeltelijk ondersteund door de Europese Unie (Horizon 2020 ERA Chair Program, RareBoost Project Grant nr.: 952346). A.C.K. wordt ondersteund door de YÖK 100/2000 PhD-beurs en TÜBİTAK-BİDEB 2211A-beurzen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10 mL serologische pipettenZA BioteknoLabselect SP-003-10
15 mL Conical Tubes Labselect CT-002-15A
2 mL serologische pipettenLabselect Labselect SP-003-2
5 mL serologische pipettenCleanteksBiofil GSP010005
50 mL Conical TubesGolden Gate CT-002-50
50 mL serologische pipettenBIOFILLGSP020050
Anti Muis 594Jackson Immuno715-585-150Verdunningsbereik: 1:100 - 1:800
Anti Konijn 488 Jackson Immuno711-545-152Verdunningsbereik: 1:100 - 1:800
Autoclaaf VAPOUR-Line liteVWR chemicalsVAPOUR-Lineeco 25
B27 SupplementGIBCO12587010met vitamine A
Benchtop CentrifugeEppendorf5702
Benchtop microscoop DMI1OlympusCKX41
Biologische veiligheidskasten Klasse IIThermoSafe 2020
Bovine Serum Albumine (BSA)Sigma-AldrichA8806
CellBanker 1Worthington IndustriesLABS-20K
Dekglasjes 24 mm x 50 mmISOLAB280
Cryomatrix, OCTFisher Healthcare30226281
CryovialBioSigmaN403522
DAPINEOFROXX 1322
DAPINEOFROXX 15390,5 ug/mL
DMEM/F12 MediaGIBCO 31330-038
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS)Gibco141901441X
EGFGIBCOPHG0311
Ethanol 100%Sigma64-17-5
Ethanol 70%Sigma64-17-5Ethanol verdunningen
Extracellulair Matrix (ECM)Corning354277LDEV-free
FGF2GIBCOPHG0024
GlutaMaxGIBCO35050061
GoTaq Master MixPromegaM7123
IncubatorMemmert INCO 153 med44043
Insulin-Selenium-TransferrinGIBCO41400045
KnockOut Serum (KOSR)GIBCO10828028
Microtoom RM2235LeicaRM2235
Montagemediumabcamab104135
mTSER MediaSTEMCELL85850
Mutiwell Cultuur Platen (6-well)CORNING   3516
N2 SupplementR&DAR003
Niet-essentiële aminozuren (NEAA)LONZABE13-114E
P20, P200 en P1000 pipettenGilsonF167350
ParaffineVWR chemicals10048502
Paraformaldehyde Sigma-AldrichF8775
Primer Antilichaam Aquaporin mAbabcamab9566Verdunningsbereik: 1:50-1:200
Primer Antilichaam CK14Santa Cruz Biotechnology sc-53253Verdunningsbereik: 1:50-1:500
Primer Antilichaam CK19ProteinTech14965-1-APVerdunningsbereik: 1:150-1:600
Primer Antilichaam CK3NOVUSNBP2-91997 0.1 MLVerdunningsbereik: 1:50-1:200
Primer Antilichaam CK5Thermo MA517057Verdunningsbereik: 1:200-1:1000
Primer Antilichaam Collageen Type IVabcamab6586Verdunningsbereik: 1:100-1:500
Primer Antilichaam KeratocanBiossbs-11054RVerdunningsbereik: 1:50-1:200
Primer Antilichaam Na/K - ATPaseSanta Cruz Biotechnologysc-21712Verdunningsbereik: 1:50-1:500
Primer Antilichaam N-Cadherinabcamab76011Verdunningsbereik: 1:50-1:500
Primer Antilichaam p63SANTACRUZ   sc-25268Verdunningsbereik: 1:50-1:500
Primer Antilichaam Pax6NovusNBP2-44576Verdunningsbereik: 1:50-1:200
RNA isolatiekitMacherey–Nagel 740984.50
Rock Inhibitor (Y-27632)TOCRIS1254
GlijbanenStarFrostMBB-0302-55AZelfklevend, gemalen
Roestvrijstalen pincetten nr:5Sigma F6521-1EA
Roestvrijstalen scalpel steriele N 21Swann-Morton1033060
The OneScript Plus cDNA Synthese Kit Applied Biological MaterialsG236
Triton-X100NEOFROXX 8500
TRIzol reagensThermo15596026
Trypan blauwGIBCO15250061

Referenties

  1. Hassell, J. R., Birk, D. E. The molecular basis of corneal transparency. Exp Eye Res. 91 (3), 326-335 (2010).
  2. Daruich, A., et al. Congenital aniridia beyond black eyes: From phenotype and novel genetic mechanisms to innovative therapeutic approaches. Prog Retin Eye Res. 95, 101133(2023).
  3. Eden, U., Riise, R., Tornqvist, K. Corneal involvement in congenital aniridia. Cornea. 29 (10), 1096-1102 (2010).
  4. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  5. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  6. Yin, X., et al. Engineering Stem Cell Organoids. Cell Stem Cell. 18 (1), 25-38 (2016).
  7. Foster, J. W., et al. Cornea organoids from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 7, 41286(2017).
  8. Susaimanickam, P. J., et al. Generating minicorneal organoids from human induced pluripotent stem cells. Development. 144 (13), 2338-2351 (2017).
  9. Koc, A. C., et al. Patient-derived cornea organoid model to study metabolomic characterization of rare disease: aniridia-associated keratopathy. BMC Ophthalmol. 25 (1), 14(2025).
  10. Ilmarinen, T., et al. Production and Limbal Lineage Commitment of Aniridia Patient-Derived Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cells. 41 (12), 1133-1141 (2023).
  11. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  12. Okur, F. V., Cevher, I., Ozdemir, C., Kocaefe, C., Cetinkaya, D. U. Osteopetrotic induced pluripotent stem cells derived from patients with different disease-associated mutations by non-integrating reprogramming methods. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 211(2019).
  13. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).
  14. Lima Cunha, D., Arno, G., Corton, M., Moosajee, M. The Spectrum of PAX6 Mutations and Genotype-Phenotype Correlations in the Eye. Genes (Basel). 10 (12), 1050(2019).
  15. Hayashi, R., et al. Co-ordinated ocular development from human iPS cells and recovery of corneal function. Nature. 531 (7594), 376-380 (2016).
  16. Gonzalez, G., Sasamoto, Y., Ksander, B. R., Frank, M. H., Frank, N. Y. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 7 (2), (2018).
  17. Ji, H. P., et al. MicroRNA-28 potentially regulates the photoreceptor lineage commitment of Muller glia-derived progenitors. Sci Rep. 7 (1), 11374(2017).
  18. Hatou, S., et al. Role of insulin in regulation of Na+-/K+-dependent ATPase activity and pump function in corneal endothelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (8), 3935-3942 (2010).
  19. Higa, K., et al. Aquaporin 1-positive stromal niche-like cells directly interact with N-cadherin-positive clusters in the basal limbal epithelium. Stem Cell Res. 10 (2), 147-155 (2013).
  20. Chen, Q., et al. Stromal fibroblasts derived from mammary gland of bovine with mastitis display inflammation-specific changes. Sci Rep. 6, 27462(2016).
  21. Soiberman, U., Foster, J. W., Jun, A. S., Chakravarti, S. Pathophysiology of Keratoconus: What Do We Know Today. Open Ophthalmol J. 11, 252-261 (2017).
  22. Lima Cunha, D., et al. Restoration of functional PAX6 in aniridia patient iPSC-derived ocular tissue models using repurposed nonsense suppression drugs. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 240-253 (2023).
  23. Harding, P., et al. Variant-specific disruption to notch signalling in PAX6 microphthalmia and aniridia patient-derived hiPSC optic cup-like organoids. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871 (6), 167869(2025).
  24. Cunha, D. L., Smits, J., Zhou, H. Q., Moosajee, M. Transcriptomic analysis of aniridia iPSC-derived limbal epithelial stem cells reveals early changes linked to the limbal niche. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (8), 2821(2023).
  25. Harding, P., et al. Generation of human iPSC line (UCLi013-A) from a patient with microphthalmia and aniridia, carrying a heterozygous missense mutation c.372C>A p.(Asn124Lys) in. Stem Cell Res. 51, (2021).
  26. Theerakittayakorn, K., et al. Differentiation Induction of Human Stem Cells for Corneal Epithelial Regeneration. Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).
  27. Bar-Nur, O., et al. Small molecules facilitate rapid and synchronous iPSC generation. Nat Methods. 11 (11), 1170-1176 (2014).
  28. Maiti, G., et al. Single cell RNA-seq of human cornea organoids identifies cell fates of a developing immature cornea. PNAS Nexus. 1 (5), pgac246(2022).
  29. Dorot, O., et al. The antipsychotropic drug Duloxetine rescues PAX6 haploinsufficiency of mutant limbal stem cells through inhibition of the MEK/ERK signaling pathway. Ocul Surf. 23, 140-142 (2022).
  30. van Velthoven, A. J. H., et al. Future directions in managing aniridia-associated keratopathy. Surv Ophthalmol. 68 (5), 940-956 (2023).
  31. Kocak, G., et al. Generation of Anterior Segment of the Eye Cells from hiPSCs in Microfluidic Platforms. Adv Biol (Weinh). 8 (5), e2400018(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

GeneeskundeEditie 233Editie 233Deze maand in JoVEEditieorgano deziektemodel

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.