Geoptimaliseerde workflow voor isolatie en langdurige kweek van van de patiënt afgeleide glioomcellen met behoud van originele tumorkenmerken

Samenvatting

Deze studie presenteert een gestandaardiseerd protocol voor het vaststellen van van patiënten afgeleide glioomcellijnen (PDGC's), waardoor hun genetische en fenotypische getrouwheid wordt gegarandeerd. Het door extract geassisteerde adherente kweeksysteem van de basaalmembraanmatrix verbetert de celgroei en homogeniteit, waardoor deze modellen waardevol zijn voor het screenen van geneesmiddelen en GBM-onderzoek.

Samenvatting

Glioblastoom (GBM) is de meest agressieve primaire hersentumor, gekenmerkt door hoge heterogeniteit en resistentie tegen standaardtherapieën. Traditionele glioomcellijnen slagen er vaak niet in om patiëntspecifieke genetische en fenotypische kenmerken te behouden, waardoor hun translationele relevantie wordt beperkt. Om dit aan te pakken, hadden we 50 van patiënten afgeleide glioomcellijnen (PDGC's) opgezet met behulp van een serumvrij neuraal stamcelkweeksysteem. Dit protocol schetst het verzamelen, verwerken en op lange termijn kweken van tumormonsters verkregen van GBM-patiënten, waardoor het behoud van de belangrijkste moleculaire kenmerken wordt gegarandeerd. Onze methodologie omvat enzymatische weefseldissociatie, lysis van rode bloedcellen en door basaalmembraanmatrixextract geassisteerde adherente cultuur, die de levensvatbaarheid van cellen verbetert en high-throughput screening van geneesmiddelen vergemakkelijkt. Karakterisering van PDGC's via sequencing van het hele genoom en transcriptomische sequencing en immunofluorescentiekleuring bevestigt hun behoud van gemeenschappelijke GBM-genetische veranderingen en neurale stamcel- en voorlopermarkers. Bovendien vertonen deze cellen tumorigene potentieel in xenotransplantaatmodellen. Door de kweekomstandigheden te optimaliseren, biedt dit protocol een gestandaardiseerd kader voor het genereren van biologisch relevante GBM-modellen ter ondersteuning van therapeutische ontdekkingen en mechanistische studies.

Inleiding

Glioom, de meest voorkomende primaire intracraniële tumor, is afkomstig van neurale stam- of voorlopercellen die genetische mutaties hebben ondergaan¹. De Wereldgezondheidsorganisatie classificeert gliomen in graad 1-4 op basis van pathologische en moleculaire kenmerken, variërend van laag graad tot hoog graad². Glioblastoom (GBM), een glioom van graad 4, vertegenwoordigt ongeveer 57% van alle gliomen en 48% van alle primaire kwaadaardige tumoren van het centrale zenuwstelsel³. GBM-patiënten hebben een slechte prognose, met een mediane overlevingstijd van minder dan 2 jaar en een 5-jaarsoverleving van slechts 5,4%⁴. De standaardbehandeling omvat maximale veilige resectie gevolgd door radiotherapie en chemotherapie met temozolomidde⁵. Ondanks deze interventies blijft GBM ongeneeslijk vanwege het infiltratieve karakter en de inherente resistentie tegen therapieën, waardoor er een dringende behoefte ontstaat aan nieuwe behandelingsbenaderingen.

Onderzoekers gebruiken vaak van mensen afgeleide tumorcellijnen als modellen voor het bestuderen van de ontwikkeling van kanker en therapeutische mechanismen. Klassieke glioomcellijnen die in serumbevattend medium worden onderhouden en in vitro uitgebreid worden gepasseerd, vertonen echter significante veranderingen in fenotypische kenmerken en genetische profielen in vergelijking met tumoren van patiënten ^6,7,8. Bijgevolg slagen preklinische screeningmodellen op basis van deze cellijnen er vaak niet in om therapeutische doelen en moleculen te identificeren die zich effectief vertalen naar klinische omgevingen. Het succes van de GBM-behandeling wordt verder bemoeilijkt door tumorheterogeniteit en plasticiteit⁹. Deze heterogeniteit manifesteert zich niet alleen in transcriptomische subtypes (bijv. proneuraal, mesenchymaal), maar ook in de diverse ontwikkelingstoestanden van samenstellende cellen¹⁰. GBM maakt gebruik van neurologische ontwikkelingsmechanismen en bevat subpopulaties van glioblastoomstamcellen (GSC) die tumorproliferatie stimuleren en een verhoogde resistentie tegen radiotherapie en chemotherapie vertonen^11,12. Het kweken van van patiënten afgeleide glioomcellen in serumvrij neuraal stamcelmedium behoudt effectief het mutatiespectrum en de genexpressiepatronen van de oorspronkelijke tumor met behoud van gedeeltelijke GSC-kenmerken⁸.

Vergeleken met neurosfeercultuurmodellen bevordert de door basaalmembraanmatrixextract geassisteerde adherente cultuur een stabielere en snellere celgroei, waardoor het geschikter is voor chemische en genetische screening¹³. Met behulp van deze aanpak hebben we 50 van de patiënt afgeleide GBM-cellijnen opgesteld en deze gekarakteriseerd door middel van sequencing van het hele genoom, transcriptomische sequencing en screening van de FDA-geneesmiddelenbibliotheek om mogelijke therapeutische strategieën te verkennen. Deze bron bevordert glioomonderzoek, met gedetailleerde resultaten gepubliceerd in onze eerdere studies¹⁴. Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt om patiënt-afgeleide glioomcellijnen (PDGC's) te ontwikkelen.

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van van de patiënt afgeleid glioomweefsel en bloedmonsters die zijn verkregen via ziekenhuissamenwerkingen. Alle bemonsteringsprocedures en experimentele protocollen hebben goedkeuring gekregen van de ethische commissie van het Beijing Tiantan Hospital, Capital Medical University (KY 2020-093-02 en KY 2014-021-02). Patiënten geven voorafgaand aan de operatie ondertekende geïnformeerde toestemming en alle identiteitsgegevens worden geanonimiseerd voordat monsters naar het laboratorium worden overgebracht. Onderzoekers moeten goedkeuring krijgen van hun institutionele ethische commissie en toestemming van de patiënt verkrijgen voordat ze dit protocol implementeren.

1. Voorbereiding vóór monsterverwerking

1. Steriliseer scharen, pincetten en andere instrumenten door te autoclaveren.
2. Bereid PDGC-kweekmedium voor door 47,5 ml DMEM/F12, 500 μl N2, 1 ml B27, 500 μl 100x penicilline/streptomycine, 250 μl 100x glutaminevervanger, 100 μl 2,5 M HEPES, 100 μl 30% glucose, 50 μl 50 ml 50 mM β-mercaptoethanol, 1,5 ml 1 μg/ml epidermale groeifactor (EGF) te combineren, en 1,5 ml 1 μg/ml basale fibroblastgroeifactor (bFGF).
3. Bereid 1x Red Blood Cell Lysis Buffer (ACK) voor door 8,29 g ammoniumchloride, 1 g kaliumbicarbonaat en 37 mg EDTA op te lossen in water en vervolgens te verdunnen tot 1 l.
4. Plaats gesteriliseerde instrumenten, PBS-buffer, afvalcontainers, centrifugebuizen en andere benodigdheden in een bioveiligheidskast en voer gedurende 30 minuten UV-desinfectie uit.
5. Doe vloeibare stikstof in een geïsoleerde container.

2. Afname van patiëntenmonsters

OPMERKING: Voer alle weefselverzamelingsprocedures uit onder strikte steriele omstandigheden om bacteriële besmetting van volgende celculturen te voorkomen. Behoud de aseptische techniek gedurende de hele workflow.

1. Verzamel preoperatief bloedmonsters en snijd tumorweefsel weg uit de hersenen van de patiënt. Voor grote, sterk infiltratieve tumoren waarbij het moeilijk is om de tumor te onderscheiden van het omringende normale weefsel, moet de resectie van peritumoraal weefsel worden gemaximaliseerd met behoud van kritieke functionele hersengebieden. Scheid ongeveer 500-2.000^mm3 van het tumorkernweefsel en plaats deze in centrifugebuisjes van 15 ml met 10 ml onderkoeld conserveringsmedium.
2. Sluit de monsterbuisjes af, plaats ze in een ijsdoos en transporteer ze snel naar het laboratorium voor verwerking.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het interval tussen het verzamelen van het monster en de verwerking niet langer is dan 6 uur bij 4 °C. Sluit tijdens het verzamelen van monsters verbrand weefsel en gebieden met tumornecrose zorgvuldig uit. Het oppervlak van weefselincisies wordt vaak verschroeid door het elektrische mes dat tijdens de operatie wordt gebruikt, wat de levensvatbaarheid van de cellen in cultuur in gevaar kan brengen.

3. Verwerking van bloedmonsters

1. Centrifugeer bloedmonsterbuisjes bij 1.000 × g gedurende 10 minuten en gooi de bovenste plasmalaag weg.
2. Breng de resterende witte bloedcellen en rode bloedcellaag over in een centrifugebuis van 50 ml. Voeg 10 ml 1x ACK toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de rode bloedcellen te lyseren.
3. Voeg 40 ml PBS toe om de lysis te beëindigen, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.000 × g .
4. Gooi de supernatant weg, voeg 3 ml 1x ACK toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur voor een tweede lysisstap van rode bloedcellen.
5. Voeg 12 ml PBS toe om de lysis te beëindigen, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.000 × g .
6. Gooi het supernatant weg, suspendeer de pellet van de perifere mononucleaire bloedcel (PBMC) in 1 ml PBS, breng over naar een centrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 510 × g .
7. Gooi het bovenstaande weg, vries de PBMC-pellet in vloeibare stikstof in en bewaar bij -80 °C.

4. Verwerking van tumorweefsel

1. Verwijder de weefselconserveringsoplossing uit de monsterbuis en was het weefsel in PBS om zichtbare bloedstolsels en necrotisch weefsel te verwijderen. Voer een tweede PBS-wasbeurt uit op het resterende tissue.
2. Knip het meest intacte weefselgedeelte weg en fixeer een nacht in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C.
   LET OP: De grootte van het gefixeerde weefsel is ongeveer 10 mm. Sla deze stap over als de steekproef klein is.
3. Snijd 2-4 kleine stukjes tissue, doe ze in een centrifugebuis van 1,5 ml, vries ze in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.
   OPMERKING: De grootte van kleine weefselstukjes varieert doorgaans van 5 tot 10 mm, afhankelijk van de hoeveelheid DNA en RNA die nodig is voor sequencing.
4. Plaats het resterende tumorweefsel in een centrifugebuis van 1,5 ml en hak het met een schaar fijn tot een fijne pasta terwijl u het op ijs bewaart.
5. Voeg 1-3 ml celloslatingsoplossing toe en breng het gehakte weefsel over naar de spijsverteringsbuis. Verteer het weefsel met behulp van een weefseldissociator bij 37 °C gedurende 16 minuten.
6. Voeg 3x volume PBS toe om de vertering te stoppen en breng de celsuspensie over naar een centrifugebuis met een celzeef van 70 μm. Maal het weefsel voorzichtig door de zeef met een klein staafje om de celverzameling te maximaliseren. Centrifugeer bij 510 × g gedurende 10 minuten en verwijder het supernatant.
7. Voeg 1-3 ml 1x ACK toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de rode bloedcellen te lyseren. Voeg 4x volume PBS toe om de lysis te stoppen, meng voorzichtig en centrifugeer op 510 × g gedurende 10 minuten om het supernatant te verwijderen.
8. Resuspendeer cellen in PDGC-medium en zaai een deel van de celsuspensie in kweekplaten. Plaats de platen in een hypoxische broedmachine van 37 °C. Vries de resterende cellen in in een kweekmedium met 10% DMSO.
   OPMERKING: Doorgaans zaaien we voor weefselmonsters van ongeveer 10-20 mm ongeveer 1/3 tot 1/10 van de celsuspensie in een schaal van 6 cm met 3 ml kweekmedium, en de overige cellen worden gecryopreserveerd in 2-4 flesjes, afhankelijk van de celopbrengst.
9. Smeer platen in door basaalmembraanmatrixextract toe te voegen aan ijskoude PBS in een verhouding van 1:100 en incubeer platen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een schudbroedmachine. Gooi de PBS weg voordat u PDGC-kweekmedium toevoegt.
   OPMERKING: Voer alle daaropvolgende celpassage en kweek uit met behulp van met extract beklede platen van de basaalmembraanmatrix.
10. Breng de gekweekte cellen na 2 dagen over naar met extract beklede platen van de basaalmembraanmatrix om celhechting en groei mogelijk te maken.

5. Celcultuur en passage

1. Zodra cellen zich aan kweekplaten hechten, verwijdert u niet-aanhangende cellen en vervangt of vult u het kweekmedium elke 2-3 dagen aan.
   OPMERKING: Het hechtingsvermogen varieert tussen verschillende cellen. Zelfs in aanwezigheid van extract van basaalmembraanmatrix kan een klein deel van de cellen niet-klevend blijven, zoals BNI7-11, waarvoor een continue suspensiecultuur nodig is. Bovendien vertonen sommige cellen een semi-aanhangend groeipatroon, zoals BNI20. Daarom is een zorgvuldige observatie van de celstatus essentieel. Voor niet-aanhangende cellen kan een toename van zwevende cellen worden opgemerkt. Als de celaggregaten verschijnen als donkere, katoenachtige structuren en in de loop van de tijd geen significante veranderingen vertonen, zijn ze meestal niet in staat tot expansie op lange termijn.
2. Wanneer cellen samenvloeien, voegt u een celdissociatieoplossing toe om de cellen los te maken. Beëindig de dissociatie met 3x PBS en centrifugeer bij 250 × g gedurende 3 min. Passage de cellen in een verhouding van 1:2 tot 1:4. Vries de resterende cellen in in een kweekmedium met 10% DMSO.
3. Ga door met passeren gedurende ten minste 10-20 generaties om een stabiele cellijn tot stand te brengen.
   1. Documenteer de celmorfologie met afbeeldingen tijdens elke passage en noteer passagenummers. Label de initiële celbevriezing duidelijk met gedetailleerde informatie (bijv. passagenummers).
   2. Zodra de cellijn stabiliseert, verzamelt u 2-3 buisjes celpellets (300.000-1.000.000 cellen/buisje) en bewaart u deze bij -80 °C.

6. Latere experimentele operaties

1. Voor PFA-gefixeerde monsters dehydrateert u de monsters, na een nacht fixeren, door een gegradueerde reeks ethanoloplossingen door opeenvolgende onderdompeling in 60% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol en twee verversingen van 100% ethanol, elk gedurende 40 minuten. Verwijder vervolgens de monsters in twee keer xyleenwisselingen, elk gedurende 40 minuten, en infiltreer vervolgens met twee keer de paraffineoplossing, elk gedurende 40 minuten. Wikkel ten slotte de gedehydrateerde en geïnfiltreerde monsters in paraffineblokken in voor daaropvolgende secties en kleuring¹⁵.
2. Voor PBMC-pellets, tumorweefsel of tumorcelmonsters die zijn bewaard bij -80 °C, extraheer DNA en RNA voor verschillende omics-onderzoeken, waaronder sequencing van het hele genoom, exoomsequencing, bulk-RNA-sequencing en eencellige RNA-sequencing indien nodig.
3. Gebruik stabiele PDGC-cellijnen voor het opzetten van xenotransplantaatmodellen in muizen, high-throughput drugsscreening, mechanismeonderzoek en andere gerelateerde experimenten.
   1. Om het intracraniële orthotope xenotransplantaatmodel van PDGC's vast te stellen, dissocieert en telt u de cellen, en suspendeert u ze vervolgens opnieuw in een 1:1-mengsel van basaalmembraanmatrixextract en ijskoude PBS tot een uiteindelijke concentratie van 100.000 cellen/μL. Injecteer 5 μL van de celsuspensie stereotactisch in het linker striatum van 6-8 weken oude immunodeficiënte muizen met behulp van een microspuit en een standaard stereotactisch instrument. Stel de injectiecoördinaten ten opzichte van het bregma als volgt in: +0,5 mm anterieur-posterieur (AP), -1,9 mm mediaal-lateraal (ML) en -3,6 mm dorsaal-ventrale (DV).
   2. Genereer PDGC's die luciferase tot expressie brengen en zet intracraniële xenotransplantaten op voor bioluminescentiebeeldvorming van tumorgroei.
      1. Verpak het luciferase-tdTomato-reporter-gen in lentivirale deeltjes en infecteer vervolgens PDGC's met het verpakte lentivirus om een stabiele expressie tot stand te brengen¹⁶.
      2. Sorteer na infectie tdTomato-positieve cellen door middel van flowcytometrie om een stabiele celpopulatie te verkrijgen die luciferase tot expressie brengt.
      3. Injecteer D-luciferine voorafgaand aan de beeldvorming intraperitoneaal in een dosis van 10 μl/g lichaamsgewicht met behulp van een 15 mg/ml D-luciferine-oplossing. Verdoof de muizen met isofluraan en wacht 10 minuten na injectie met D-luciferine. Plaats de muizen in het bioluminescentiebeeldvormingssysteem. Stel de belichtingstijd in op de automatische modus tijdens de beeldvorming¹⁷.

Resultaten

Figuur 1 geeft een uitgebreid overzicht van de workflow van het protocol. Patiëntmonsters omvatten perifeer bloed en tumorkernweefsel. Bloedmonsters ondergaan centrifugatie om plasma te verwijderen, gevolgd door twee ACK-lysisrondes om PBMC's te verkrijgen die dienen als controles voor sequentieanalyses. Tumormonsters worden PBS-gewassen om bloedstolsels en necrotische gebieden te verwijderen voordat ze in kleine fragmenten worden verwerkt. Meerdere weefself...

Discussie

De heterogeniteit van GBM brengt aanzienlijke behandelingsuitdagingen met zich mee. Conventionele GBM-cellijnen ontwikkelen vaak homogene genetische achtergronden en verliezen tumorkenmerken van de patiënt na uitgebreide kweek in serumbevattend medium, waardoor hun translationele waarde wordt beperkt. Het optimaliseren van GBM-kweekomstandigheden en het standaardiseren van workflows voor de verwerking van patiëntmonsters zijn essentieel voor het maximaliseren van beperkte klinische midde...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
70 μm cell strainer	Falcon	352350
Accutase cell detachment solution	BioLegend	423201
Ammonium chloride	Aladdin	60-92-4
Anti- Sox2 antibody	Merckmillipore	AB5603
Antifade Mounting Medium with DAPI	Beyotime	P0131
Anti-Nestin antibody	NOVUS	NB100-1604
B27 without vitamin supplemet	Gibco	12587010
BD FACSAria Fusion Flow Cytometer	BD Biosciences	/
Cell culture dish	NEST	705001
D-Luciferin, Potassium Salt	Invitrogen	L2916
DMEM/F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glucose	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	glutamine substitute
Hematoxylin-Eosin staining Kit	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
Human bFGF	Origene	TP750002
Human EGF	Novoprotein	C029-500μg
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	hypothermic preservation medium
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	bioluminescence imaging system
Matrigel	Corning	356231	basement membrane matrix extract
Microsyringe	Hamilton	80300
N2 Supplement	Gibco	17502048
Nunclon Sphera 6-Well Plate	Thermo Scientific	174932	ultra-low attachment plates
Paraformaldehyde	Sangon Biotech	A500684-0500
PBS buffer	Solarbio	P1010-100*2L
Penicillin/Streptomycin	Solarbio	P8420/S8290
Potassium bicarbonate	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD tissue dissociator	RWD Life Science	DSC-410
Standard stereotaxic instrument	RWD Life Science	68801
Tissue sample processing tube	RWD Life Science	SCT-100
β-mercaptoethanol	Sigma	M3148-100mL