Methodenartikel

Live beeldvorming karakterisering van centromeerbewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana

826 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68569

⸱

24 oktober 2025

 ,  ,  , 
1Université Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, Institute Jean-Pierre Bourgin for Plant Sciences (IJPB), 78000, Versailles, France

In dit artikel

Samenvatting

Chromosoombeweging tijdens de meiotische profase is een slecht begrepen fenomeen dat fundamenteel is voor sporenvorming. Dit protocol beschrijft een methode voor het verkrijgen, analyseren en kwantificeren van centromeerbewegingen tijdens de meiotische profase in mannelijke meiocyten van Arabidopsis thaliana .

Samenvatting

Meiose is een cellulaire deling, essentieel voor seksuele voortplanting. Tijdens de meiotische profase herkennen homologe chromosomen van moederlijke en vaderlijke oorsprong elkaar en associëren ze, een proces dat wordt vergemakkelijkt door hun snelle bewegingen in het nucleoplasma. Meiotische profasebewegingen zijn afhankelijk van de aanhechting van de chromosomen aan de nucleaire envelop en van cytoplasmatische krachten die via de nucleaire envelop naar de chromosomen worden overgebracht. In planten maken de beperkte toegankelijkheid en kwetsbaarheid van mannelijke meiocyten in de helmknoppen live beeldvormingsbenaderingen en chromosoombewegingsanalyse technisch uitdagend. Deze bewegingen zijn inderdaad zeer snel en om ze te analyseren, moeten de optimale acquisitievoorwaarden worden gevonden. Hier wordt een efficiënte methode beschreven om snelle chromosoombewegingen tijdens mannelijke meiotische profase in Arabidopsis thaliana vast te leggen, in time-lapse-films, door de bewegingen van fluorescerend gelabelde centromeren te volgen. Het is gebaseerd op helmknopdissectie en beeldacquisitie met behulp van confocale laserscanningmicroscopie (CLSM), in 3D en in de loop van de tijd. Het verkrijgen van meiotische z-stacks om de 7 s zorgt voor voldoende resolutie om de trajecten van getagde centromeren te reconstrueren en te analyseren. De geëxtraheerde gegevens worden vervolgens verwerkt, waardoor de kwantitatieve analyse van deze chromosomale bewegingen mogelijk wordt. De ontwikkeling van modellen op basis van deze gegevens is essentieel voor het begrijpen van het mechanisme van snelle chromosoombeweging, inclusief de aard en intensiteit van de krachten die dit proces aandrijven.

Inleiding

Meiose is een fundamenteel biologisch proces dat zorgt voor de getrouwe overdracht van genetisch materiaal van de ene generatie op de andere. Het proces van meiose is verdeeld in twee opeenvolgende rondes van celdeling, meiose I en meiose II. Meiose I wordt voorafgegaan door een lange profase waarin homologe chromosomen elkaar herkennen en paren. Tijdens deze verlengde profase vinden tal van biologische processen plaats. Naast het paren van homologe chromosomen, ondergaan deze chromosomen ook een proces dat synapsis wordt genoemd. Synapsis omvat de vorming van een eiwitcomplex dat bekend staat als het synaptonemale complex, dat de homologe chromosomen over hun lengte verbindt. Het synaptonemale complex bevordert homologe recombinatie, gevolgd door de uitwisseling van genetisch materiaal tussen homologe chromosomen en de vorming van cross-overs. Deze brengen een fysieke verbinding tot stand tussen homologe chromosomen, waardoor ze op de juiste manier uitlijnd en uitgebalanceerd zijn

Tijdens homologe chromosoomherkenning is bekend dat snelle profase-chromosoombewegingen (RPM's) een cruciale rol spelen. Studies uitgevoerd in verschillende modelsoorten hebben aangetoond dat tijdens leptoten chromosomen zich hechten aan de nucleaire envelop (NE). Ze zijn verbonden met het cytoplasmatisch cytoskelet via het NE, via het LINC (Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton) eiwitcomplex3. De krachten die in het cytoplasma worden gegenereerd, worden via het LINC-complex naar de chromosomen overgebracht, waardoor chromosoombeweging mogelijk wordt.

De studie van RPM's is essentieel voor het begrijpen van de fundamentele mechanismen van meiose, met name die welke betrokken zijn bij de herkenning van homologe chromosomen. Het bestuderen van deze bewegingen vereist echter specifieke live imaging-experimenten. De meeste live-beeldvormingsstudies in A. thaliana richten zich op somatische weefsels en vegetatieve organen. Deze studies zijn uitgevoerd om te bepalen hoe cellen aanleiding geven tot organen4. Dergelijke studies zijn uitgevoerd op meristemen5en wortels6. Onlangs hebben enkele teams technieken ontwikkeld voor het observeren van de ontwikkeling van bloemen, waaronder meiose, in real-time in A. thaliana gedurende perioden van meerdere dagen 7,8. Deze protocollen kunnen echter ook veeleisend en moeilijk in te stellen zijn voor grote aantallen monsters.

Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor beeldvorming van levende cellen en analyse van chromosoomdynamiek tijdens meiose in A. thaliana. Door het gebruik van confocale microscopie, een eenvoudige techniek voor monstervoorbereiding, in combinatie met fluorescerende labeling van chromosomen, werd chromosoombeweging vastgelegd met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie over korte tijdsperioden. Het protocol schetst de voorbereiding van plantenweefsel voor beeldvorming, de optimalisatie van beeldvormingsparameters om fototoxiciteit te minimaliseren en de beeldkwaliteit te maximaliseren, evenals de beeldverwerking en gegevensanalyse. Deze methode maakt een nauwkeurige kwantificering van de dynamiek van het centromeer tijdens meiose mogelijk, wat cruciaal is voor het begrijpen van chromosoomgedrag dat ten grondslag ligt aan succesvolle gametenvorming. Deze kennis heeft directe implicaties voor de landbouw, met name voor het verbeteren van gewasveredelingsprogramma's door de studie van chromosoomparing en recombinatieprocessen die de vruchtbaarheid en genetische diversiteit beïnvloeden, te vergemakkelijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van transgene A. thaliana planten die GFP-CENH3 en NUP54-RFP transgenentot expressie brengen 9,10. De CENH3-markering maakt het mogelijk om de beweging van de centromeren te volgen. De NUP54-marker labelt de nucleaire poriën en helpt zo de kern te onderscheiden. Andere markers kunnen worden gebruikt, maar deze moeten bestand zijn tegen fotobleking omdat het monster continu wordt belicht. Om ervoor te zorgen dat de marker geen fotobleken ondergaat, voert u het experiment uit onder dezelfde laseromstandigheden en acquisitieparameters en controleert u of het signaal stabiel blijft tijdens de beeldacquisitie. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Plantengroei en cultuur

  1. Zaai zaden direct in potjes in de kas.
  2. Plaats de potten in een kas onder de volgende omstandigheden: 16 uur dag/8 uur nacht, 20 °C, 70% luchtvochtigheid.
  3. Laat de planten zich ongeveer 4 weken in de kas ontwikkelen. Planten moeten een stadium bereiken waarin ze 5/6 bloemstelen hebben (zie figuur 1A).

2. Helmknoppen ontleden en preparaten

  1. Bereid een glasplaatje voor, plaats een afstandhouder (dubbelzijdige lijm met een perforatie van 9 mm diameter, 0,12 mm diep) in het midden en zorg ervoor dat de beschermfolies aan elke kant worden verwijderd. Deze afstandhouder houdt het monster vast en creëert ruimte tussen de dia en het dekglaasje.
  2. Deponeer 8 μL kraanwater in het midden van de afstandhouder.
  3. Pluk met een tang een bloeiwijze van een van de hoofdstengels (zie figuur 1B) (gebruik geen kleine bloeiwijzen van de opkomende stengels).
  4. Plaats de bloeiwijze op een nieuw dialetje onder een stereomicroscoop voorzien van een liniaal. Selecteer bloemknoppen met een lengte van ongeveer 0,5 mm (figuur 1C).
  5. Open de knoppen voorzichtig met scherpe naalden en trek de kelkblaadjes en bloembladen uit elkaar om alleen de helmknoppen te behouden. Zorg ervoor dat u de helmknoppen niet beschadigt en ook niet laat opdrogen.
  6. Breng de helmknoppen voorzichtig over in het water in de afstandsruimte. Om uitdroging te voorkomen, doet u dit onmiddellijk na het verwijderen van de kelkblaadjes en bloembladen.
  7. Deponeer meerdere trossen helmknoppen in de afstandsholte.
  8. Bedek de dia met een dekglaasje en vermijd luchtbellen. Voeg daarvoor 8 μL water toe aan een dekglaasje en draai het dekglaasje voorzichtig om met de druppel water op de afstandsholte. Zorg ervoor dat de helmknoppen zijn ondergedompeld in in totaal 16 μL water en dat het dekglaasje goed op het afstandsstuk is gelijmd (zie afbeelding 1D; Figuur 2).

3. Confocale microscopie time-lapse waarneming – Beeldvorming opstelling

OPMERKING: De manier om de beeldvormingsparameters in te stellen, is afhankelijk van het gebruikte confocale systeem. Zie de sectie Discussie voor meer informatie over de beeldvormingsparameters. Beelden werden verkregen met behulp van CLSM en een 20x wateronderdompelingslens. Het gebruik van een onderdompelingsobjectief in water zorgt voor een betere overeenkomst met de brekingsindex, omdat het biologische monster in water is gemonteerd.

  1. Stel de microscoop in door GFP op te wekken bij 488 nm en deze te detecteren met een hybride detector tussen 494 nm en 547 nm.
    OPMERKING: De offsetversterking van de hybride detector was ingesteld op 100. RFP is opgewonden bij 561 nm en gedetecteerd met een hybride detector tussen 584 en 629 nm. De offsetversterking van de hybride detector was ingesteld op 130. De scansnelheid is 400 Hz en de scan is bidirectioneel. Er wordt een lijngemiddelde van 2 toegepast. De twee kanalen werden gelijktijdig verworven om de acquisitietijd te minimaliseren. Het laservermogen werd ingesteld op 15% voor de 488 nm laser en 30% voor de 561 nm laser.
  2. Lokaliseer de helmknop met behulp van helderveldverlichting.
  3. Bepaal met behulp van het helderveldkanaal het meiotische stadium op basis van de vorm van de cellen.
    OPMERKING: Zygoteen- of pachyteenstadia zijn vereist om RPM's waar te nemen. Variatie van de focus langs de Z-as maakt het mogelijk om de 3D-vorm van de cel te schatten. In het leptoteenstadium vertonen meiocyten een duidelijk vierkante vorm en bevindt de nucleolus zich in het midden van de kern, waardoor ze gemakkelijk te identificeren zijn. Tijdens de zygoteen- en pachyteenstadia beginnen meiocyten een trapeziumvorm aan te nemen en migreert de nucleolus naar de nucleaire envelop. In het diploteenstadium vertonen meiocyten een volledig afgeronde morfologie10.
  4. Visualiseer de helmknop op de software. Het RFP-signaal is ook een goede indicator voor het meiotische stadium van de cellen.
    OPMERKING: Meiocyten in het zygoteen/pachyteenstadium vertonen NUP54-labeling in een halvemaanvorm, wat overeenkomt met een clustering van nucleaire poriën in een beperkt gebied van het NE in deze stadia (Figuur 3A). Draai indien nodig de helmknop zodat deze horizontaal ligt (zie afbeelding 3).
  5. Definieer een afbeeldingsgrootte van 400 px bij 150 px, met een digitale zoom van 4, waarbij de helmknop in de afbeelding wordt gecentreerd.
  6. Bepaal de dikte van het monster dat moet worden afgebeeld om zoveel mogelijk intacte meiocyten te verkrijgen. Het is echter belangrijk om het aantal z-slices te beperken om de acquisitietijd te minimaliseren. Voor een dikte van 15 μm worden 16 z-plakjes gemaakt. Z-stacks werden verkregen met een stapgrootte van 1,04 μm.
  7. Als u continue acquisities wilt uitvoeren, stelt u het tijdsinterval in op nul in de tijdsectie . Met de microscoop en de hierboven beschreven parameters is de acquisitietijd voor 16 plakjes ongeveer 6-8 s. De minimale acquisitieduur is 2 minuten, maar kan oplopen tot 20 minuten.
  8. Start de overname.

4. Beeldanalyse – Centromeer beweging volgen

OPMERKING: Reconstructie van de centromeerbewegingen vereist beeldanalysesoftware die in staat is om 3D-bewegingen te volgen. De software wijst een object toe aan een fluorescerend signaal, op basis van de gedefinieerde parameters, op elk acquisitiemoment. Vervolgens analyseert de trackingtool automatisch bewegende objecten en maakt een afstammingsplot.

  1. Voorbewerking van afbeeldingen
    1. Om de analyse van bewegingen te vergemakkelijken, voert u beeldverwerking na de acquisitie uit. Een adaptief informatie-extractieproces (deconvolutie-algoritme) kan bijvoorbeeld worden gebruikt om fijne structuren en details bloot te leggen en de beeldkwaliteit te verbeteren.
  2. Wereldwijd centromeer volgen
    1. Volg alle centromeren van de afbeelding: Gebruik een spotmodule om automatisch spots te volgen (in de loop van de tijd).
    2. Kies het bronkanaal, groen in dit geval. Geef de XY-diameter, 1 μm, aan voor het centromeer met de markering GFP-CENH3. Objectdetectie identificeert alle objecten in het beeld (Afbeelding 3B).
    3. Pas de kwaliteit van de detectie aan op basis van de signaalintensiteit met behulp van de grafiek onder aan het controlevenster.
    4. Gebruik een auto-regressief algoritme voor het volgen van bewegingen om de trajecten te traceren (Figuur 3C). Door alle trajecten te visualiseren, is het gemakkelijk om meiocyten uit somatische weefsels te identificeren (Video 1).
  3. Centromeren volgen in een enkele meiocyt
    OPMERKING: Controleer met behulp van 3D-visualisatiesoftware de kernen en de trajecten en analyseer alleen kernen die intact zijn en op geen enkel moment tijdens de acquisitie zijn bijgesneden. Analyse van een bijgesneden meiocyt resulteert in foutieve gegevens.
    1. Automatische centromeer tracering
      OPMERKING: Bij het analyseren van een enkele kern wordt het proces opnieuw gestart vanaf het begin.
      1. Gebruik de spotmodule om spots (in de tijd) op de geselecteerde kern te volgen, waarbij een corresponderende Region of Interest (ROI) wordt gedefinieerd met behulp van de optie Segmenteer alleen een Region of Interest en track spots (in de tijd).
      2. Selecteer een ROI die de kern in alle drie de dimensies en in de loop van de tijd op de juiste manier omvat. (Figuur 4A).
      3. Gebruik dezelfde parameters als voor de hele helmknop voor centromeerdetectie (Figuur 4B) en tracking (Figuur 4C).
      4. In een afstammingsplot (Figuur 4F) worden alle trajecten aangegeven. De banen buiten de geanalyseerde meiocyt kunnen worden verwijderd (Figuur 4C). Selecteer de nummers en verwijder ze met de Delete-toets op het toetsenbord. Deze kunnen eenvoudig worden geïdentificeerd met behulp van de 3D-viewer van de software.
    2. Handmatige correctie van centromeertracering
      OPMERKING: In de meeste gevallen moeten de trajecten handmatig worden gecorrigeerd omdat de volgsoftware geen onderscheid kan maken tussen centromeren die te dicht bij elkaar liggen.
      1. Gebruik de modus Bewerken om een object te verwijderen of toe te voegen. Zorg ervoor dat het object in het juiste vlak wordt toegevoegd.
      2. Verbind de nieuwe objecten handmatig in de modus Tracks bewerken met behulp van de afstammingsplot, na een zorgvuldige en grondige persoonlijke analyse van de cel in 3D. Figuur 4E,G toont de gecorrigeerde trajecten op respectievelijk de afbeelding van de meiocyt en op de lineaire plot. Video 2 toont de trajecten van één meiocyt na correctie.
      3. Gegevens exporteren
        1. Exporteer de trackinggegevens naar een spreadsheetprogramma om verdere gegevensverwerking en -analyse te vergemakkelijken. Deze bestanden bevatten meettabellen die het resultaat zijn van de tracking die met de software is uitgevoerd.
        2. Zorg ervoor dat het geëxporteerde werkbladbestand de volgende variabelen bevat: Tijd, die het tijdstip van elke meting registreert; track-ID, die elke track uniek identificeert; Verplaatsing Delta X, Y, Z, die de verandering in positie in drie dimensies op elk tijdstip weergeeft; en Positie X, Y, Z, die de absolute positie van elk object in de ruimte opslaat.

5. Gegevensanalyse

OPMERKING: In dit deel wordt de workflow voor gegevensanalyse beschreven met behulp van R11-scripts die zijn uitgevoerd in RStudio12. Ze kunnen worden opgehaald uit de Data INRAE-repository op: 10.57745/V1NNFI. Alle cijfers worden gegenereerd met behulp van ggplot213 om de berekende statistieken te visualiseren. De scripts voeren achtereenvolgens de volgende stappen uit: De meiomove-sub-config. Het R-script wordt eerst uitgevoerd om de R-omgeving te initialiseren, de vereiste bibliotheken te laden en globale variabelen te definiëren. De link naar het script is: https://doi.org/10.57745/V1NNFI

  1. Gegevens lezen en selecteren
    OPMERKING: Het te gebruiken script wordt opgeslagen als: meiomove-sub-loader.R."
    1. Verzamel alle afzonderlijke Excel-bestanden met trackinggegevens en voeg ze samen tot één geconsolideerd bestand.
    2. Sla het samengevoegde bestand op in TSV-formaat (door tabs gescheiden waarden) om compatibiliteit met verdere gegevensverwerkingsstappen te garanderen.
    3. Bereken de x-, y- en z-posities door de verplaatsingswaarden in de loop van de tijd te accumuleren, zodat het ruimtelijke traject van elk gevolgd object nauwkeurig wordt gereconstrueerd. Dit werd gedaan om een bug in de software te compenseren die onjuiste XYZ-posities exporteerde.
  2. Gegevens opschonen
    OPMERKING: Het te gebruiken script wordt opgeslagen als: meiomove-sub-clean.R."
    1. Verwijder korte nummers, gedefinieerd als nummers met een minimale duur van 50 s. Deze tracks bevatten niet genoeg datapunten voor een zinvolle analyse, omdat ze ruis of onnauwkeurigheden kunnen introduceren.
    2. Identificeer en verwijder sporen waarbij de positie (X, Y, Z) in de loop van de tijd constant blijft, aangezien deze artefacten of statische structuren aangeven die niet relevant zijn voor de analyse.
    3. Filter ontbrekende verplaatsingswaarden (NA-vermeldingen) uit om de gegevensintegriteit te waarborgen en rekenfouten in latere stappen te voorkomen.
    4. Detecteer en verwijder sporen waarvan de verplaatsingswaarden die zijn verkregen uit de beeldanalysesoftware aanzienlijk verschillen van de opnieuw berekende waarden, waardoor consistentie en betrouwbaarheid in trackinggegevens worden gegarandeerd.
  3. Correctie van meiotische celdrift
    OPMERKING: Het te gebruiken script wordt ook opgeslagen als: meiomove-sub-clean.R."
    1. Houd rekening met mogelijke drift tijdens de verwerving door onderscheid te maken tussen meiotische en somatische centromeren. Deze stap zorgt ervoor dat waargenomen bewegingen overeenkomen met biologische processen in plaats van experimentele artefacten.
    2. Pas driftcorrectie toe door de posities van meiotische cellen ten opzichte van de somatische cellen aan te passen, die als stabiele referentie dienen.
  4. Output genereren
    OPMERKING: Het te gebruiken script wordt opgeslagen als: meiomove-sub-metrics.R."
    1. Bereken de momentane snelheid bij elke tijdstap om variaties in bewegingssnelheid in de loop van de tijd bij te houden.
    2. Bereken de draaihoek, die de verandering in bewegingsrichting tussen opeenvolgende tijdstappen weergeeft en inzicht geeft in trajectpatronen. Het resultaat wordt opgeslagen als: results/dataframes/metrics-by-step.tsv (Output 1).
    3. Bereken de outreach-ratio met behulp van celltrackR14, die kwantificeert hoe ver een gevolgd object beweegt ten opzichte van zijn startpositie, wat een indicatie geeft van verkennend gedrag. Het resultaat wordt opgeslagen als: results/dataframes/metrics-celltrackr.tsv (Output 2).
    4. Bereken de gemiddelde snelheid voor elk afzonderlijk spoor om de bewegingskenmerken over de gehele observatieperiode samen te vatten. Bereken de gemiddelde draaihoek per spoor om de algehele bewegingsrichting en gedragspatronen te analyseren. Het resultaat wordt opgeslagen als: results/dataframes/metrics-by-id.tsv (Output 3).
    5. Bepaal de positie van het zwaartepunt bij elke tijdstap voor elk celspoor. Het zwaartepunt is het gemiddelde van centromeer posities in een bepaalde meiocyt.
    6. Bereken de grootte van het zwaartepunt bij elke tijdstap, die een maat geeft voor de ruimtelijke spreiding van centromeren rond hun gemiddelde positie. Variaties in de grootte van het zwaartepunt in de loop van de tijd geven informatie over de wereldwijde consistentie over centromeersporen. Het resultaat wordt opgeslagen als: results/dataframes/metrics-by-cell.tsv (Output 4).
    7. Bereken de kruiscorrelatie van de snelheid om relaties tussen de bewegingsdynamiek van verschillende gevolgde objecten te analyseren, waardoor mogelijk gecoördineerd gedrag wordt onthuld. Het resultaat wordt opgeslagen als: results/dataframes/metrics-correlations.tsv (Output 5).
    8. Bereken de gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD) voor elk spoor, een belangrijke metriek die de gemiddelde vierkante afstand kwantificeert die centromeren afleggen over bepaalde tijdsintervallen (vertragingen) om het bewegingstype te karakteriseren.
      OPMERKING: Door te onderzoeken hoe de MSD met toenemende vertraging evolueert, kan men afleiden of de beweging overwegend diffuus of beperkt is, waardoor inzicht wordt verkregen in het onderliggende dynamische gedrag. Het resultaat wordt opgeslagen als: results/dataframes/metrics-msd.tsv (Output 6).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er werd een snel protocol ontwikkeld om chromosoombewegingen tijdens de profase van meiose in Arabidopsis thaliana te visualiseren, waardoor meerdere time-lapse-acquisities mogelijk zijn en dus de analyse van een grote dataset. Meiocyten die een GFP-marker tot expressie brengen, die de visualisatie van centromeren mogelijk maakt, en een RFP-marker, die de visualisatie van de kern mogelijk maakt, worden afgebeeld voor een duur van 4 minuten volgen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol maakt in vivo beeldvorming en analyse van centromeerbeweging tijdens meiotische profase in Arabidopsis thaliana mogelijk. Dit protocol kan worden geïmplementeerd met een rechtopstaande of een omgekeerde confocale microscoop, waardoor het toegankelijk is voor de meeste laboratoria die zijn uitgerust met confocale technologie. Hoewel confocale systemen variëren in scansnelheid, gevoeligheid, detectoren en het vermogen om golflengten te scheiden, is he...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk heeft de steun gekregen van de technologische platforms PO-Plants en PO-Cyto van het Institut Jean-Pierre Bourgin. Dit onderzoek werd gefinancierd door de ANR (MeioMove ANR-21CE12-0042 : M.G., P.A., L.C., S.L., en DYSCORD ANR-23-CE20-0036-02, M.G., L.C.). Het Instituut Jean-Pierre Bourgin geniet de steun van Saclay Plant Sciences (ANR-17-EUR0007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
KweekgrondTREF (Jiffy)101820/02227861
Confocale microscoopLeicaTCS SP8 AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter)
Confocale softwareLeicaLAS X 3.5.0.18371 software
DekglasjesPaul Marienfeld GmbH10705222x22 No1,5H
PincettenIdeal-Tek4.SA.0Hoge precisie pincetten
GFP:CENH3Ravi et al. 2010Arabidopsis thaliana zaden gebruikt hier
ggplot2 ggplot2: Elegant Graphics for Data Analysis  Referentie13https://ggplot2.tidyverse.org
NaaldhouderHammacherNaaldhouder voor lus, lengte 170 mm
ImarisOxford instrumentsImaris 9.7.2Beeldanalyse - "Spot" module
LensLeicaHC PL APO CS2 20×/0.75 IMM
LightningLeicaAdaptive DeconvolutionAutomatische intelligente informatie-extractie uit confocale data
LampenVEGELEDApollo LL252-Gen2
NaaldenWatkins&DoncasterE3 pins.0124"(.31mm) x 25mm
NUP54:RFPCromer et al. 2024Arabidopsis thaliana zaden gebruikt hier
PottenTEKU (POPPELMANN)VDF 7x7x6,5 cm
RRCore TeamR: A language and environment for statistical   computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria.  Referentie11https://www.R-project.org/  
RstudioPosit Team RStudio: Integrated Development Environment for R. Posit Software, PBC, Boston, MA. Referentie12http://www.posit.co/
GlijbanenKNITTEL GLASS10000326x76x1,0mm
AfstandhoudersThermo-fisherSecure-Seal Spacer, 8 putjes, 9 mm diameter, 0,12 mm diepsnijd elke afstandhouder individueel
StereomicroscopenNikonSMZ800

Referenties

  1. Zickler, D., Kleckner, N. Meiotic chromosomes: Integrating structure and function. Annu Rev Genet. 33 (1), 603-754 (1999).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances between homologs. Annu Rev Genet. 57 (1), 1-63 (2023).
  3. Kim, H. J., Liu, C., Dernburg, A. F. How and why chromosomes interact with the cytoskeleton during meiosis. Genes (Basel). 13 (5), 901(2022).
  4. Harline, K., Roeder, A. H. K. An optimized pipeline for live imaging whole Arabidopsis leaves at cellular resolution. Plant Methods. 19 (1), 10(2023).
  5. Prunet, N. Live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers. J Vis Exp. (122), e55156(2017).
  6. Peng, Z., Jiao, Y., Wang, Y. Live imaging of Arabidopsis shoot primordia via a confocal laser scanning microscope. STAR Protoc. 4 (2), 102217(2023).
  7. Prusicki, M. A., et al. Live cell imaging of meiosis in Arabidopsis thaliana. eLife. 8, e42834(2019).
  8. Valuchova, S., et al. Imaging plant germline differentiation within Arabidopsis flowers by light sheet microscopy. ELife. 9, e52546(2020).
  9. Ravi, M., Chan, S. W. L. Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination. Nature. 464 (7288), 615-618 (2010).
  10. Cromer, L., et al. Rapid meiotic prophase chromosome movements in Arabidopsis thaliana are linked to essential reorganization at the nuclear envelope. Nat Commun. 15 (1), 5964(2024).
  11. R: A language and environment for statistical computing. , at https://www.R-project.org/ (2021).
  12. RStudio: Integrated development environment for R. , at http://www.posit.co/ (2025).
  13. Wickham, H. Data Analysis. ggplot2. , 189-201 (2016).
  14. Wortel, I. M. N., et al. CelltrackR: An R package for fast and flexible analysis of immune cell migration data. Immunoinformatics. 1 - 2, 100003(2021).
  15. Lee, C. -Y., et al. Mechanism and regulation of rapid telomere prophase movements in mouse meiotic chromosomes. Cell Rep. 11 (4), 551-563 (2015).
  16. Nozaki, T., Weiner, B., Kleckner, N. Rapid homologue juxtaposition during meiotic chromosome pairing. Nature. 634 (8036), 1221-1228 (2024).
  17. Fang, Y., Spector, D. L. Centromere positioning and dynamics in living Arabidopsis plants. Mol Biol Cell. 16 (12), 5710-5718 (2005).
  18. Arpòn, J., Gaudin, V., Andrey, P. A method for testing random spatial models on nuclear object distributions. Plant Chromatin Dynamics: Methods and Protocols. 1675, 493-507 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

ChromosoombewegingConfocale MicroscopieDissectie van de HelmknoppenFluorescente LabelingTime lapse ImagingChromosoomtrajecten

Gerelateerde artikelen