Methodenartikel

Analyse van 13C verrijking van vitamine A in biologische monsters door middel van gaschromatografie-verbranding-isotopenverhouding massaspectrometrie

493 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

14 november 2025

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel beschrijft de analyse van serum-, moedermelk- en levermonsters voor 13C-verrijking van retinol en retinylesters voor tracertoepassingen. Hoogwaardige vloeistofchromatografie wordt gebruikt om retinolconcentraties te zuiveren en te kwantificeren, en gaschromatografie-verbranding-isotopenverhouding massaspectrometrie (GC-C-IRMS) wordt gebruikt om de gezuiverde extracten te analyseren.

Samenvatting

Vitamine A is van cruciaal belang voor de gezondheid, maar de beoordeling van de vitamine A-status is een uitdaging. Vitamine A die in het bloed circuleert, wordt homeostatisch gecontroleerd en weerspiegelt vaak geen vitamine A-tekort of -overmaat. Het gebruik van 13C-vitamine A maakt het mogelijk om de totale vitamine A-voorraden in het lichaam te traceren en te kwantificeren en aanvullende informatie over de farmacokinetiek en het metabolisme te verkrijgen. Dit protocol beschrijft de extractie, zuivering en bepaling van 13C-isotopische verrijking van vitamine A in serum-, moedermelk- en weefselmonsters met behulp van gaschromatografie-verbranding-isotopenverhouding massaspectrometrie (GC-C-IRMS). Analyse met behulp van GC-C-IRMS levert gevoelige en nauwkeurige verrijkingswaarden op, met name voor monsters met 13C-verrijkingen in de buurt van natuurlijke abundantieniveaus. Dit maakt flexibiliteit in onderzoeksontwerpen mogelijk om kleinere tracerdoses en farmacokinetische bemonstering op langere termijn te gebruiken. In het kort, aan 0,4 tot 1 ml serum wordt ethanol toegevoegd om eiwitten neer te slaan, C-23 β-apo-carotenol wordt toegevoegd als interne standaard en hexaan wordt gebruikt om retinoïden te extraheren. Het extract wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in methanol en gezuiverd met behulp van HPLC. De retinolfractie wordt vervolgens opnieuw gesuspendeerd in hexaan en geïnjecteerd in het GC-C-IRMS-systeem. Atoom% (At%) wordt direct berekend met betrekking tot koolstofdioxide, dat wordt gekalibreerd tegen een sucrosestandaard met behulp van een elementaire analysator. Andere weefseltypen die door GC-C-IRMS zijn geanalyseerd, zijn onder meer moedermelk en lever na verzeping. Vastefase-extractietechnieken kunnen worden gebruikt om te helpen bij de zuivering van deze of andere complexe matrices. Bovendien kan een elementaire analysator aan het IRMS worden bevestigd om voedselmonsters te analyseren op een totaal gehalte van 13C.

Inleiding

Vitamine A (VA) is een essentiële micronutriënt die nodig is voor het gezichtsvermogen, de immuunfunctie, cellulaire differentiatie en metabolische regulatie. Het optimaliseren van de VA-status blijft een wereldwijde gezondheidsuitdaging, aangezien een tekort of overmaat de gezondheidsresultaten kan aantasten. Een nauwkeurige beoordeling van de VA-status is van cruciaal belang voor klinische of populatiestudies die de juiste interventies begeleiden. De serumretinolconcentratie alleen is echter een slechte biomarker en diagnostisch hulpmiddel, omdat het homeostatisch wordt gereguleerd over een breed scala van totale lichaamsvoorraden (TBS's) en wordt beïnvloed door ontstekingen en andere tekorten aan voedingsstoffen 1,2.

Isotopisch gelabelde tracers hebben het VA-onderzoek drastisch getransformeerd door kwantitatieve beoordeling van TBS's mogelijk te maken met behulp van de retinolisotopenverdunningstest (RID) 3,4,5. Voor RID wordt een VA-tracer verrijkt met 13C of 2H toegediend, die in evenwicht is met de lichaamsvoorraden en de serum (of plasma) retinol-tracer-to-tracee-ratio (TTR) wordt gemeten met behulp van MS. Een isotopenverdunningsvergelijking wordt toegepast met specifieke aannames met betrekking tot het VA-metabolisme om TBS's 5,6 te berekenen.

Talrijke combinaties van chromatografie en MS kunnen worden gebruikt om de serumretinol TTR te bepalen (bijv. GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). Analytische precisie is van cruciaal belang voor nauwkeurige RID-schattingen, omdat TBS'en omgekeerd evenredig zijn met TTR. LC-MS/MS is zeer geschikt voor toepassingen met een hoge doorvoer bij het gebruik van zwaar gelabelde tracers en relatief hoge tracerdoses. Typische LC-MS/MS-methoden rapporteren retinol relatieve standaarddeviaties (RSD's) van 3-6% voor intra-assay en <8% voor inter-assay7, maar er zijn beperkte gegevens over de nauwkeurigheid en precisie van TTR's. Daarentegen biedt massaspectrometrie met gaschromatografie-verbranding en isotopenverhouding (GCCIRMS) een uitzonderlijke precisie voor verrijking met 13C-retinol, met typische RSD's met een isotopendichtheid van 13C/12C van ~0,02-0,05 8,9. Dit maakt een nauwkeurige bepaling van tracerconcentraties mogelijk in monsters waar de verrijking laag is. Het gebruik van IRMS voor RID-toepassingen zorgt voor een adequaat analytisch signaal met minder tracermassa en minder gelabelde atomen in de tracer, wat beide kosten bespaart die gepaard gaan met de tracerdoses.

Dit manuscript schetst een analyse voor 13C-retinol uit bloed, moedermelk en weefsels met behulp van GC-C-IRMS. Afhankelijk van het biologische monster dat wordt getest, begint de analyse van 13C-gelabelde retinol met behulp van GC-C-IRMS met een van de verschillende mogelijke extractiemethoden om de niet-polaire verbindingen te isoleren die de gelabelde retinol bevatten. Voor serummonsters gaat het om een vloeistof-vloeistofextractie door toevoeging van ethanol en hexaan en het verzamelen van de hexaanfractie. Bij het testen van moedermelk worden de monsters eerst verzeept met kaliumhydroxide, gevolgd door een vergelijkbare vloeistof-vloeistofextractie als serum. Deze moedermelkmonsters worden ook gezuiverd met behulp van vastefase-extractiepatronen om de hoeveelheid andere resterende lipiden te verminderen. Als het uit een weefsel (bijv. lever) wordt geëxtraheerd, wordt het monster vermalen met watervrij natriumsulfaat om water te verwijderen, geëxtraheerd met methyleenchloride en gefilterd in een volumetrische of ronde bodemkolf voor roterende verdamping. Een aliquoot wordt gedroogd, opnieuw gesuspendeerd in ethanol, verzeept en geëxtraheerd volgens dezelfde methode als moedermelk. Deze apolaire oplossingen van elk monster worden onder stikstof gedroogd en gereconstitueerd in methanol voor zuivering en kwantificering met behulp van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC).

De gevoeligheid van IRMS maakt het mogelijk om verrijking te bepalen in monsters met een lage monsterverrijking, zoals farmacokinetische monsters voor wiskundige modelleringstoepassingen op lange termijn of extrahepatische weefselmonsters voor het nauwkeurig traceren van het VA-metabolisme. Gepaarde RID-testen met een enkele dosis zijn voorgesteld om de VA-status voor en na interventie te evalueren om de werkzaamheid bij theoretische proefpersonen te bepalen10, wat een veelbelovende benadering zou kunnen zijn als deze bij mensen wordt gevalideerd. IRMS is in staat om VA-tracers te detecteren in de buurt van natuurlijke verrijkingswaarden, wat lange follow-upvensters en flexibiliteit in bemonsteringsprotocollen mogelijk zou maken.

Het is aangetoond dat moedermelk een minder invasieve alternatieve bemonsteringsbenadering is voor VA-statusbeoordeling1. Retinol in moedermelk kan worden gebruikt als bemonsteringsbron voor de RID-test en heeft een sterke correlatie aangetoond met van serum afgeleide RID-waarden bij vrouwen in Zambia met lage VA-voorraden11. Voor weefsels en moedermelkmonsters kunnen vastefase-extractietechnieken helpen bij de zuivering van deze monsters in complexe matrices. IRMS is ook gebruikt om voedselbronnen van VA te onderscheiden en relatieve voedingsbijdragen te bepalen met behulp van veranderingen in de natuurlijke 13C overvloed aan serumretinol 9,12,13. Een elementaire analysator kan ook worden gebruikt met IRMS om voedselmonsters te analyseren op een totaal gehalte van 13C en dit te vergelijken met VA-verrijking.

Bij het gebruik van 13C-labels is het van cruciaal belang om de basislijn 13C retinolverrijking te begrijpen, als gevolg van natuurlijk voorkomende 13C (~ 1.1% van de totale koolstof), die kan variëren afhankelijk van de bronnen van VA die door zowel individuen als populaties worden geconsumeerd. Daarom wordt voor de beste nauwkeurigheid op individueel niveau een baseline bloedmonster aanbevolen. Voor populatie-evaluaties kan een populatiegebaseerde schatting worden gegenereerd met behulp van een willekeurig geselecteerde subgroep of afzonderlijke personen uit dezelfde bevolkingsgroep14.

Protocol

1. Extractie van retinol uit biologische monsters

OPMERKING: Alle procedures voor het hanteren en extraheren van monsters worden uitgevoerd onder geel of UV-gefilterd licht om degradatie te minimaliseren.

  1. Extractie uit serum
    1. Pipetteer 1 ml serum (of zoveel als beschikbaar) in een glazen reageerbuis van 13 x 100 mm (of vergelijkbare grootte). Noteer het gebruikte serumvolume.
      OPMERKING: Het gebruik van een verdringingspipet wordt aanbevolen.
    2. Voeg 1,5x het volume van 200 proof ethanol toe.
    3. Voeg 25 μL van de interne standaard toe, zoals C-23 β-apo-carotenol (gesynthetiseerd uit all-trans retinal, abs = 0,9)9. Sluit het monster af en meng gedurende 15 s met vortex.
    4. Voeg 1 ml hexaan toe, meng door vortex gedurende 15 s en centrifugeer gedurende 2 minuten (~1.300 × g) bij kamertemperatuur.
    5. Piket met behulp van een pasteurpipet voorzichtig de bovenste hexaanlaag in een nieuwe glazen reageerbuis (12 x 75 mm of 13 x 100 mm).
    6. Herhaal stap 1.1.4 en 1.1.5 2x en voeg de drie hexaanextracten samen in de tweede tube. Plaats het gepoolde hexaanextract onder een zachte stroom stikstof tot het droog is.
    7. Voeg 100 μL methanol toe aan het gedroogde monster en sluit het onmiddellijk af. Wervel de oplossing op en neer langs de zijkanten van de buis en meng het monster vervolgens gedurende 15 s door middel van een werveling.
    8. Plaats de monsters minimaal 5 minuten in een vriezer van -80 °C.
      OPMERKING: Monsters kunnen in deze stap bij -80 °C bewaard blijven tot de volgende dag.
  2. Extractie van moedermelkmonsters
    1. Ontdooi de melkmonsters volledig en keer ze meerdere keren voorzichtig om ervoor te zorgen dat de monsters uniform zijn. Meet in een centrifugebuis met glazen schroefdop van 10 ml een hoeveelheid melk van 0.5-1.5 ml (standaard 1.0 ml) af en noteer het gebruikte volume.
    2. Voeg 1,5x het volume van 200 proof ethanol toe (met 0,1% butylhydroxytolueen (w:v)), meng met een vortex gedurende 15 s.
    3. Voeg 25 μL van de interne standaard toe, zoals C-23 β-apo-carotenol (gesynthetiseerd uit all-trans retinal, abs = 0,9)15. Sluit het monster af en meng door vortex.
    4. Voeg 0,8x het melkmonstervolume van 50:50 kaliumhydroxide toe aan water (bereid als w:v, bijv. 50 g KOH opgelost in 50 ml water), meng door vortex gedurende 15 s.
      OPMERKING: KOH: water moet worden aangemaakt in plastic containers (bijv. HDPE).
    5. Zeep de monsters gedurende 1 uur in een waterbad van 45 °C en meng kort met een vortex om de 15 minuten.
    6. Voeg koud gedeïoniseerd of omgekeerd osmosewater toe in hetzelfde volume als het startvolume van de melk.
    7. Voeg 1 ml hexaan toe, meng door vortex gedurende 15 s en centrifugeer gedurende 2 minuten (~1.300 × g) bij kamertemperatuur.
    8. Piketeer met behulp van een pasteurpipet voorzichtig de bovenste hexaanlaag op een nieuwe glazen reageerbuis (12 x 75 mm of 13 x 100 mm).
    9. Herhaal stap 1.2.7 en 1.2.8 nog twee keer, waarbij hexaan in de tweede buis wordt gepoold.
    10. Neem elk monster door middel van vastefase-extractie (SPE); begin met het aansluiten van de benodigde SPE-cartridges (PE 500 mg/3 ml -NH2) op het vacuümspruitstuk.
    11. Conditioneer elke cartridge door 3 x 2 ml hexaan door elke cartridge te laten lopen, waarbij u het oplosmiddelniveau nooit onder de bovenkant van het verpakkingsmateriaal laat komen. Verzamel hexaan in een glazen buis van 16 x 75 mm en gooi deze op de juiste manier weg.
    12. Laad de monsters in cartridges en trek door met het vacuüm totdat het oplosmiddel net boven het niveau van het verpakkingsmateriaal is. Spoel elke cartridge met 3 x 2 ml hexaan op dezelfde manier als in stap 1.2.11. Gooi het afvaloplosmiddel weg en vervang de glazen opvangbuizen door nieuwe buizen van dezelfde grootte, gelabeld met de monster-ID.
    13. Was retinol door met 3 x 2 ml methyleenchloride en vang deze fractie op.
    14. Droog het eluaat onder stikstof en reconstitueer in 100 μL methanol (MS-kwaliteit). Meng het monster door middel van een vortex en wervel het oplosmiddel over alle kanten van de buis. Centrifugeer gedurende 20-30 s.
    15. Plaats de monsters minimaal 5 minuten in een vriezer van -80 °C.
      OPMERKING: Monsters kunnen in deze stap bij -80 °C bewaard blijven tot de volgende dag.
  3. Extractie van levermonsters
    1. Vouw in een glazen trechter met een diameter van 8 cm en plaats een Whatman #1 filterpapier van 15 cm in een kegelvorm. Plaats een maatkolf van 50 ml onder de trechter.
    2. Ontdooi het weefsel en weeg 0,5 g, of zoveel monster als beschikbaar is. Noteer het gebruikte weefselgewicht.
    3. Breng de monsters over naar een vijzel en stamper en maal ze fijn met ongeveer 5 g natriumsulfaat.
    4. Voeg 250 μL van een interne standaard toe, zoals C-2315.
      OPMERKING: Veresterde vormen van vitamine A (d.w.z. retinylacetaat, retinylbutyraat) mogen niet worden gebruikt omdat het monster uiteindelijk zal worden verzeept, waardoor de standaard niet te onderscheiden is van endogene retinol.
    5. Giet in een zuurkast 10-15 ml methyleenchloride in de vijzel met het gemalen levermonster en meng voorzichtig met behulp van de stamper.
    6. Giet methyleenchloride door het filtreerpapier in de maatkolf.
    7. Herhaal stap 1.3.5 en 1.3.6 nog twee keer en zorg ervoor dat het totale oplosmiddel in de maatkolf onder de lijn blijft.
    8. Gebruik een pasteurpipet om de resterende inhoud van de mortel in de trechter met methyleenchloride te spoelen. Ga door met het toevoegen van methyleenchloride aan de trechter met de pasteurpipet totdat het oplosmiddel in de maatkolf de lijn bereikt. Sluit de maatkolf af en terwijl u de dop op zijn plaats houdt, keert u de kolf meerdere keren om.
    9. Giet ongeveer 10 ml methyleenchloride-extract in een erlenmeyer van 25 ml. Breng 5 ml van de oplossing over in een glazen centrifugebuis van 10 ml met schroefdop. Droog het monster onder een zachte stroom stikstofgas.
    10. Reconstitueer het monster in 2 ml ethanol + 0,1% butylhydroxytolueen en vortex om het monster te mengen.
    11. Voeg 0,8 ml 50:50 (w:v) kaliumhydroxide toe aan water en meng gedurende 15 s door middel van vortex.
    12. Zeep de monsters gedurende 1 uur in een waterbad van 45 °C en meng kort met een vortex om de 15 minuten.
    13. Voeg 0,1 ml koud gedeïoniseerd of omgekeerd osmosewater toe.
    14. Voeg 1 ml hexaan toe, meng door vortex gedurende 15 s en centrifugeer gedurende 2 minuten (~1.300 × g).
    15. Piketeer met behulp van een pasteurpipet voorzichtig de bovenste hexaanlaag op een nieuwe glazen reageerbuis (12 x 75 mm of 13 x 100 mm).
    16. Herhaal stap 1.3.14 en 1.3.15 nog twee keer en verzamel hexaan in de tweede buis.
    17. Droog het gepoolde hexaan af onder stikstof en reconstitueer in 100 μL methanol (MS-kwaliteit). Meng het monster door middel van een draaikolk en wervel het oplosmiddel over alle kanten van de buis. Centrifugeer gedurende 20-30 s en plaats de monsters minimaal 5 minuten in een vriezer van -80 °C.
      OPMERKING: Monsters kunnen in deze stap bij -80 °C bewaard blijven tot de volgende dag.

2. Monsterzuivering en kwantificering met behulp van hoogwaardige vloeistofchromatografie

  1. Bereid HPLC-systeem 1 voor met een C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) kolom en UV/VIS detector ingesteld op 325 nm.
  2. Bereid de mobiele fase van 92:8 acetonitril:water voor door de volumes acetonitril en water afzonderlijk te meten en vervolgens het water in de acetonitril te gieten. Vacuümfilter de gemengde oplossing om het opgeloste gas te verwijderen.
  3. Schakel het HPLC-systeem 1 in, voer indien nodig een ontluchting van het oplosmiddel uit op de HPLC en stel vervolgens het debiet in op 1 ml/min gedurende ten minste 15 minuten om het systeem volledig in evenwicht te brengen.
  4. Injecteer standaarden in het HPLC-systeem.
    1. Injecteer voor het kwantificeren van retinolconcentraties 25 μL C-23 interne standaardoplossing en noteer het resultaat 3x om te vergelijken met monsters.
    2. Injecteer een retinolstandaard om de exacte retentietijd te bepalen voor het systeem dat wordt gebruikt om de verzameling van fracties en de kwantificering van retinol te begeleiden.
  5. Bereid HPLC-systeem 2 voor (de componenten zijn hetzelfde als systeem 1). Als u voor beide stappen één HPLC-systeem gebruikt, vervang dan de kolom die voor de primaire zuivering wordt gebruikt door een tweede identieke kolom om mogelijke overdracht van verbindingen uit de monsters te minimaliseren.
  6. Voor systeem 2 vacuümfiltert u methanol, ontlucht u de mobiele HPLC-fase en laat u vervolgens 0.7 ml/min gedurende 20 minuten draaien om in evenwicht te komen.
  7. Haal de monsters één voor één uit de vriezer van -80 °C en centrifugeer ze 30 s bij 1.300 × g bij kamertemperatuur.
  8. Injecteer het volledige monster op de HPLC en vermijd gepelleteerd materiaal. Begin met opnemen als u retinol kwantificeert.
  9. Verzamel de retinolpiek in een kleine glazen buis (12 x 75 mm of 13 x 100 mm) terwijl het oplosmiddel door de detector gaat. Verzamel het middelste gedeelte van de piek om de zuiverheid te maximaliseren, meestal absorptiewaarden van meer dan 0,1 absorptie-eenheden (Figuur 1), die kunnen worden aangepast afhankelijk van de retinolconcentratie van het monster. Wacht tot de C-23-piek elueert en stop met opnemen.
  10. Droog monster onder een zachte stroom stikstof.
  11. Voeg 100 μL methanol (MS-kwaliteit) toe aan het gedroogde monster en sluit onmiddellijk af. Wervel de oplossing op en neer langs de zijkanten van de buis en meng het monster vervolgens gedurende 15 s met een draaikolk. Plaats de monsters minimaal 5 minuten in een vriezer van -80 °C.
    OPMERKING: Monsters kunnen in deze stap bij -80 °C bewaard blijven tot de volgende dag.
  12. Haal de monsters één voor één uit de vriezer van -80 °C. Centrifugeer bij 1.300 × g gedurende 30 s.
  13. Injecteer het volledige monster op het HPLC-systeem 2 en vermijd gepelleteerd materiaal.
  14. Terwijl de retinolpiek elueert, verzamelt u het oplosmiddel terwijl het door de detector gaat in een klein glazen flesje (<1 ml) met een conische bodem en schuift u het monsterflesje voorzichtig in een reageerbuisje van 12 x 75 mm.
  15. Zet de vacuümconcentrator aan en laat de condensor 20 minuten afkoelen.
  16. Plaats de monsters in een uitgebalanceerde formatie in de carrousel, zet de warmte-instelling op geen en het vacuüm op 05.1, sluit het deksel en druk op run.
    OPMERKING: Het duurt meestal 10-20 minuten voordat de monsters zijn droog. Voor de gaschromatograaf is het belangrijk dat alle methanol uit de monsters is verwijderd.
  17. Zodra de injectieflacon droog is, brengt u de HPLC-injectieflacon over in een amberkleurige injectieflacon van 4 ml met schroefdop en reconstitueert u het monster met 4-7 μl hexaan.
    OPMERKING: Dit is meestal 7 μL, maar het wordt verminderd wanneer wordt vastgesteld dat het monster tijdens de zuivering een lage concentratie heeft. Levermonsters kunnen veel geconcentreerder zijn, dus reconstitueren in een groter volume. Streef naar tussen 75 ng/μL en 400 ng/μL.
  18. Injecteer 1-5 μL op de GC-C-IRMS om een adequaat signaal te verkrijgen, gebaseerd op de concentratie van het monster die nodig is om ongeveer 75 ng retinol te injecteren.

3. Monsteranalyse met GC-C-IRMS

  1. Bereid de GC voor met een kolom (100% dimethylpolysiloxaan, niet-polair, 15 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm film) en het heliumdebiet van 1,2 ml/min.
  2. Voer systeemcontroles uit om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn en dat de IRMS-bron goed is gericht op massa's 44, 45 en 46.
    Injecteer elke dag 2 μL van een 75 ng/μL 13C-verrijkte retinolstandaard als de eerste injectie om de retentietijd te bepalen en de systeemprestaties te verifiëren.
  3. Laad in de acquisitiesoftware de instrumentmethode, typ de naam voor de sample en druk op sample uitvoeren. Het GC-C-IRMS-systeem voert een pre-injectiesysteem-installatieroutine uit. Zodra het groene Ready to Inject-lampje aan de voorkant van de GC oplicht, injecteert u het vooraf bepaalde monstervolume in de programmeerbare temperatuurverdampende PTV-injector, verwijdert u de spuit en drukt u op de Start-knop .
  4. Gebruik de PTV-injector in de PTV Splitless-modus, met de beschermkolom aan de bovenkant van het injectorinzetstuk voor een gesimuleerde injectie op de kolom. Stel het injectorprogramma in om te beginnen met een begintemperatuur van 50 °C, houd het 1.05 minuten vast, verhoog het tot 200 °C met een snelheid van 14.5 °C/s, houd het 1 minuut op 200 °C, ga over naar 300 °C bij 14.5 °C/s, houd vervolgens vast om de injector 4 minuten te ontluchten met een heliumsplitstroom van 50 ml/min voordat u terugkeert naar 50 °C voor de volgende injectie.
  5. Programmeer de GC-oventemperatuur op een begintemperatuur van 50 °C, houd deze 1 minuut vast, loop 30 °C/min op tot 150 °C, vervolgens 15 °C/min tot 265 °C, vervolgens tot 295 °C bij 40 °C/min, houd vervolgens 2.50 minuten vast alvorens af te koelen tot 50 °C voor de volgende injectie.
  6. Zorg ervoor dat elk chromatogram begint met drie pulsen CO2 (99,999% zuiverheid), gekalibreerd tegen sucrose (IAEA-CH-6). Toegang tot resultaten in de acquisitiesoftware.
  7. Inspecteer na elke injectie elk chromatogram om te controleren of de retinolpiek aanwezig is en of de integratie geschikt is. Gebruik de software om de retinolpieken zoveel mogelijk automatisch te integreren om mogelijke vertekening door handmatige integraties te minimaliseren. Gebruik standaard start- en eindhellingsdetectie-instellingen van 20 mV/s.
    OPMERKING: Een piekamplitude van 200 mV of lager is te klein om een nauwkeurige meting van de 13C-verhouding te geven.
  8. Exporteer chromatogramgegevens naar een spreadsheetprogramma. Neem de volgende essentiële gegevenscategorieën op: Voorbeeldnaam, piekretentietijd, piekamplitude bij massa 45 en AT%.
    OPMERKING: De gegevens die worden geëxporteerd, kunnen worden gespecificeerd met behulp van een gedefinieerde exportmethode. De δ waarde is gunstig voor het gemak van interpretatie, maar niet vereist voor berekeningen.

4. Berekening van de totale lichaamsvoorraden van vitamine A en de leverconcentraties

  1. Retinol isotopen verdunning vergelijkingen.
    OPMERKING: De geprefereerde isotopenbalansvergelijking en de bijbehorende notatie die door sommige onderzoekers wordt gebruikt, zijn gebaseerd op aanbevelingen van de International Union of Pure and Applied Chemistry16. We merken op dat sommige onderzoeksgroepen notatie gebruiken die probeert het historische gebruik van factoren die in RID-vergelijkingen worden gebruikt, te behouden. We merken ook op dat factoren en ondersteunende literatuur kunnen verschillen in de vraag of ze directer van toepassing zijn op berekeningen voor TBS's of lever-VA-concentraties, afhankelijk van de onderzoeksopzet, het experimentele model en de analytische resultaten.
    1. Bepaal de serumretinol TTR aan de hand van de isotopenconcentratie van 13C CO2 na verbranding volgens de volgende vergelijking:
       figure-protocol-1    
      Waarbij F de isotopenabundantie is (ook bekend als isotopenhoeveelheidsfractie, afgekort 'x') van de tracerdosis (Fa), serumretinol bij baseline (Fb) en serumretinol na dosering en menging met de lichaamspool (Fc). De gebruikte mengperioden zijn meestal ongeveer 14-21 dagen voor mensen, maar kunnen korter of langer zijn, afhankelijk van de specifieke onderzoeksopzet.
    2. Gebruik RID-vergelijkingen om VA TBS te berekenen volgens de volgende basisvergelijking.
      figure-protocol-2
      Waar
      figure-protocol-3
      OPMERKING: Factoren die worden gebruikt voor absorptie en opslag zijn onder meer i) dosisopslag op het moment van evenwicht (dosisabsorptie), doorgaans geschat tussen 75% en 90% voor gezonde personen. De schatting kan worden verlaagd als er een ontsteking aanwezig is. ii) Dosisbehoud; Constante: e-kt; k = ln(2)/halfwaardetijd van retinol; 32 tot 136 dagen voor kinderen; 140 dagen voor volwassenen); t = dagen sinds toediening (meestal 14-21 dagen); verdeling van de serum/levertracer: TTRserum / TTRlever; 0,65-0,9 met VA-opname tijdens de mengperiode; 0,9-,1 bij gebruik van een lage tracerdosis, gecontroleerde VA-inname en nuchtere bemonstering.
      figure-protocol-4
    3. Bereken de VA-concentraties van de lever met aanvullende aannames voor het levergewicht en de fractie van VA TBS in de lever.
      figure-protocol-5
      Waar
      figure-protocol-6
      De verhouding tussen lever en lichaamsgewicht wordt gewoonlijk geschat als een leeftijdsspecifieke constante: zuigelingen: 4-4,2%; kinderen: 3%; volwassenen: 2,4%; TBS-fractie in de lever varieert met de vitamine A-status. Eerder gebruikte schattingen zijn marginale of lage VA-status: 0,5; adequate VA-status: 0,8-0,9.

Resultaten

Een voorbeeld van een serummonsterchromatogram gecontroleerd bij 325 nm wordt gegeven voor protocolsectie 2 (Figuur 1). Afhankelijk van het specifieke systeem en de gebruikte kolom, is de typische retentietijd voor retinol 4-6 minuten en 6-8 minuten voor de interne standaard. Het groen gearceerde gebied toont het doelverzamelbereik voor de retinolfractie om onzuiverheden te minimaliseren. De extractie-efficiëntie van retinol uit serum is doorgaans ≥ 85%, terwijl verzeepte moedermelk- en weefselmonsters doorgaans een lagere efficiëntie hebben, gemiddeld ~70-80%. Kleine hoeveelheden retinol cis-isomeren kunnen worden waargenomen bij het elueren kort voor of na de belangrijkste all-trans-piek tijdens HPLC-zuivering. Er werd geen noemenswaardig cis-isomeer waargenomen in de steekproef in figuur 1 , maar deze is te zien in aanvullende figuur 1 van referentie17. Vaak wordt een extra isomeer afgescheiden tijdens de tweede HPLC-zuivering (niet afgebeeld) of tijdens de GC-scheiding (Figuur 2).

Voorbeeld GC-C-IRMS-chromatogrammen voor een standaard, serummonster en blanco worden getoond voor protocolsectie 3 (Figuur 2)9. Elk monster bevat referentie-CO2 -pieken met 13C-verrijking gekalibreerd volgens een IAEA-sucrosestandaard (IAEA-CH-6).

De experimentele IRMS-precisie (CV%) voor isotopendichtheid van 13C/totaal C voor: 1) referentie-CO2 was 0,012 voor stabiliteit en 0,031 voor lineariteit (n = 10 elk); 2) retinolstandaard was 0,036 voor inter-day stabiliteit en 0,022 voor intra-day lineariteit (n = 4 elk); en 3) experimenteel was 0,073 ± 0,061 in de baseline- en acht dieetbehandelingsgroepen bij gerbils (n = 46 in 9 groepen)9.

Hieronder ziet u een voorbeeld van hoe de resulterende serum GC-C-IRMS-gegevens worden gebruikt om TBS- en lever-VA-concentraties te berekenen die 14 dagen na toediening van de dosis worden bepaald met behulp van de RID-vergelijking voor methode 4:

Kenmerken van de studiedeelnemers:

Leeftijd:4 jaar
Lichaamsgewicht:16,0 kg
Fa (2 koolstofatomen gelabeld plus natuurlijke overvloed):0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Toegepaste tracerdosis:1,0 μmol
Tijd sinds dosering:14 dagen
VA halfwaardetijd:32 dagen
Absorptie:0.8
Verhouding van TTR in serum/lever (dieet niet gecontroleerd):0.9
TBS-fractie in de lever:0.8

Berekening:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Dosisbehoud = e-kt met halfwaardetijd van 32 dagen en bemonsteringstijd van 14 dagen
k = ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
t = 14
e-kt = e-0.02166 x 14= 0.738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Voor de berekening van de VA-concentraties in de lever:
Levergewicht (g) = 1.000 × lichaamsgewicht (kg) × 3% (schatting voor kinderen)
Levergewicht = 1.000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Lever VA-concentratie = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Figuur 1: HPLC-chromatogram van menselijk serummonster. HPLC-systeem 1 met isocratische mobiele fase 90:10 MeOH:H2O en detectie op 325 nm. De retinolpiek wordt verzameld voor absorptiewaarden van meer dan ~0,1 (groen gearceerd gebied). De interne standaard C-23 β-apo-carotenol wordt gebruikt om de serumretinolconcentratie (indien gewenst) tijdens deze stap te kwantificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 2: GC-C-IRMS-chromatogrammen die de bepaling van retinol 13 C/12 C aantonen. GC-C-IRMS-chromatogram van (A) retinolstandaard, (B) retinol gezuiverd uit serum en (C) blanco-injectie aangepast van Gannon et al.9. Drie sporen zijn voor massa 44 (overeenkomend met 12C16O2), 45 (overeenkomend met 13C16O2 of 12C16O17O) en 46 (komt voornamelijk overeen met 12C16O18O, die wordt gebruikt om massa 45 te corrigeren voor 17O bijdrage). Drie brede pieken vóór 200 s zijn CO2 -referentiepieken gekalibreerd op een Sucrose 13C referentiemateriaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De beschreven methoden voor het meten van 13C-verrijking van retinol met behulp van GC-C-IRMS kunnen waardevolle gegevens opleveren voor het evalueren van dieetinterventies,18 modellering van vitamine A-kinetiek,19,20,21 klinisch onderzoek, of bevolkingsstudies met RID voor verbeterde schattingen van VA-status 22.

In deze test wordt retinol, gezuiverd uit een biologisch monster, door de GC-kolom gedragen door helium van onderzoekskwaliteit (>99,99999% zuiverheid) met een temperatuurgradiënt, waardoor het wordt gescheiden van de resterende onzuiverheden in het monster. De retinol wordt verbrand om CO2 en water te vormen en het water wordt verwijderd. De CO2 wordt naar het IRMS vervoerd, waar de massa's 44, 45 en 46 worden gemeten en de δ en AT% worden bepaald ten opzichte van een CO2 -gasreferentie, die bovendien is gekalibreerd tegen de sucrosestandaard (IAEA-CH-6).

Bij de bereiding van de retinol voor injectie moet de geëxtraheerde retinol van de grootste zuiverheid zijn om reproduceerbare isotopenverhoudingen te bereiken en om de levensduur van het analytische platform tussen grondige reinigingen te maximaliseren. Oplosmiddelen die voor extractie worden gebruikt, moeten van de hoogst beschikbare zuiverheidsgraad zijn, meestal van MS-kwaliteit. Al het glaswerk, zoals extractiebuisjes, pasteurpipetten en HPLC-injectieflacons moeten nieuw zijn omdat ze moeilijk voldoende te reinigen zijn voor MS-analyse. Het is belangrijk om glazen buisjes en pipetten te gebruiken in plaats van plastic om weekmakers in de extracten die zich ophopen op de GC en verbrandingskolommen te minimaliseren.

Afhankelijk van de specifieke onderzoeksopzet en de steekproefbron kunnen wijzigingen in deze workflow voor monsteranalyse worden aangebracht. Eén HPLC-systeem kan bijvoorbeeld waarschijnlijk worden geoptimaliseerd voor retinolzuivering. Onze ervaring is dat hiervoor water in de mobiele fase nodig is, en dat er ofwel een mobiele fasegradiënt nodig is, ofwel een langere droogtijd van het monster voorafgaand aan de injectie op de GC-C-IRMS. We ontdekten dat het gebruik van twee HPLC-systemen met korte isocratische methoden de analytische vereisten in evenwicht brengt en tegelijkertijd duidelijke signalen op het GC-C-IRMS verkrijgt (Figuur 2). Het gebruik van LC-MS/MS zou een meer gestroomlijnde analytische workflow voor RID-monsters kunnen bieden7. De gevoeligheid van GC-C-IRMS heeft echter duidelijke voordelen van het kunnen gebruiken van lagere dosis- en isotopenlabelhoeveelheden, het kwantificeren van tracers op langere tijdstippen en het analyseren van monsters met een lage monsterverrijking.

Beperkingen van deze methode zijn onder meer het vereisen van meerdere instrumenten, bekwame technische behandeling en beperkingen van de monsterdoorvoer als gevolg van langere monstervoorbereidingstijden. De personele tijd die nodig is om elk monster voor te bereiden, kan worden verbeterd door een HPLC te implementeren met geautomatiseerde fractieverzamelingsmogelijkheden, aangezien de HPLC-zuiveringsstappen gebruik maken van isocratische methoden, wat resulteert in consistente retentietijden voor analyten. De methode kon worden geoptimaliseerd om slechts één HPLC-zuivering te gebruiken. We gebruiken twee systemen parallel om de doorvoer te verhogen en het drogen van monsters te vergemakkelijken voorafgaand aan reconstitutie in hexaan en injectie op de GC-C-IRMS.

Hoewel GC-C-IRMS extreem gevoelig is voor het bepalen van isotopenverhoudingen, vereist het meer totale retinolmassa van het monster voor een adequaat retinolsignaal. De monstervereisten zijn afhankelijk van zowel de monsterhoeveelheid als de VA-concentratie van het monster. Doorgaans is 75 ng retinol gericht op een sterke piek, waardoor variaties in GC-overdracht en verbrandingsefficiëntie mogelijk zijn. In de praktijk hebben we onder optimale bedrijfsomstandigheden een adequaat signaal verkregen met monsters die resulteren in GC-C-IRMS-injecties van slechts 25 ng. Dit komt overeen met een serummonster met een lager volume (~0,4 ml), een lage retinolconcentratie (~0,5 μmol/l) en kleine verliezen in de extractie- en zuiveringsprocedures. Bij de analytische ontwikkeling van de RID-methode was een grote verbetering het overstappen op een PTV-injector. De lage starttemperatuur voorkomt dat het hexaan dat het monster draagt, te snel uitzet, waardoor gesimuleerde injecties van monsters op de kolom mogelijk zijn. Door rechtstreeks in de kolom te injecteren, wordt het signaal van de retinol gemaximaliseerd met als nadeel een iets slechtere piekvorm en constanter onderhoud.

Moedermelk is voorgesteld als vervanging voor serummonsters in de RID-test. Dit is gevalideerd bij Zambiaanse vrouwen die borstvoeding geven en die grotendeels een lage voorraad VA11 hadden. Het moet nog worden gevalideerd bij vrouwen met een hogere inname van voorgevormde VA, zoals men zou vinden in landen met een hoog inkomen of in populaties die meerdere bronnen van VA consumeren, waaronder inname via de voeding, voedselverrijking en suppletie.

VA-beoordeling van moedermelk heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere biochemische indicatoren van de VA-status. Het verzamelen van moedermelk is vaak gemakkelijker dan bloed omdat flebotomisten niet nodig zijn en het verzamelen van moedermelk meestal als minder invasief wordt beschouwd voor proefpersonen23. Het gebruik van informele moedermelkmonsters is handig en vereist slechts 5 ml melk. Bovendien hoeven monsters niet onmiddellijk te worden verwerkt, wat de verwerkingstijd van monsters verkort, vooral in veldomgevingen. Standaardisatie van de monsterafname voor volle moedermelkmonsters is echter van cruciaal belang, omdat de concentraties vet en retinol in de achtermelk hoger zijn dan in de voormelk, en de concentraties melkvet en retinol de neiging hebben te variëren met het tijdstip van de dag en het interval sinds de laatste voeding 1,24. Voor informele monsters wordt de retinolconcentratie het best uitgedrukt per g melkvet. Melkvet moet idealiter net na afname worden bepaald met behulp van de creamatocrietmethode25. Monsters moeten worden afgeschermd van licht. Aliquots (meestal 1 tot 5 ml) voor HPLC-analyse moeten worden bereid op het moment van verzameling, omdat melk na invriezen en ontdooien niet homogeen is.

Er zijn twee primaire omstandigheden waarin het meten van de 13C-verrijking van de VA in de lever mogelijk en interessant kan zijn. De meest voorkomende situatie is bij het gebruik van 13C-gelabelde retinol in dierstudies wanneer de lever wordt verzameld. De berekende TBS'en van VA zullen worden vergeleken met de concentratie van VA in de lever zoals bepaald door HPLC/UPLC, maar de 13C-verrijking van de levervoorraden zijn ook nuttig om te bepalen hoe de tracer in circulatie wordt verdeeld ten opzichte van langetermijnvoorraden. Bovendien is het in sommige unieke omstandigheden mogelijk om leverbiopsiemonsters te verkrijgen van mensen die toestemming hebben gegeven en ook een gelabelde dosis vitamine A hebben ingenomen26,27. Deze monsters zijn ook nuttig voor het valideren en testen van 13C-retinolmenging. De verwerking van levermonsters begint met het malen van een afgemeten monster met watervrij natriumsulfaat om water op te vangen en het weefsel af te breken. Dit wordt vervolgens met 50 ml methyleenchloride door filterpapier geëxtraheerd. Een fractie wordt gedroogd onder stikstof en gereconstitueerd in ethanol met 0,1% butylhydroxytolueen toegevoegd als conserveermiddel. Het monster wordt verzeept en geëxtraheerd met dezelfde procedure die wordt gebruikt voor moedermelk.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door NIH-R01 DC019357 en het IAEA Coordinated Research Project E43035.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
13C Referentie materiaal traceerbaar naar de VPDB-LSVEC schaal (Sucrose)International Atomic Energy AgencyIAEA-CH-6 National Institute of Standards and Technology naam: RM 8542
Acetonitril (HPLC kwaliteit)Fischer ScientificUN1648
Ethanol (pure 200 proof, anhydrous, ≥99.5%)Sigma459836
Glazen pasteur pipettenWillekeurig
Glazen reageerbuisjesWillekeurig
Helium (onderzoekskwaliteit, (>99,9995% zuiverheid)Willekeurig
HexanenSigma178918
Methanol (MS kwaliteit)VWRMSPP-A-456
Morser en stamper, keramiekWillekeurig
Positieve verplaatsingspipet 3-25 µLGilsonFD10002
Positieve verplaatsingspipet 10-100 µLGilsonFD10004
Positieve verplaatsingspipet 50-250 µLGilsonFD10005
Positieve verplaatsingspipet 100-1000 µLGilsonFD10006
KaliumhydroxideFisher ScientificUN1813
Kwalitatieve filterpapier #1 150 mmWhatman1001-150
AfscheidingsflenzenWillekeurig
Natriumsulfaat, watervrijFischer ScientificS415-212
Volumetrische kolven (50 mL)Willekeurig

Referenties

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

Herprints en machtigingen

Tags

Vitamine A verrijking13C vitamine Aretino de extractieserumanalyseanalyse van moedermelkHPLC zuiveringelementairenanalyservaste fase extractie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.