Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In situ Detectie van metabolisch actieve cellen in hepatocellulair carcinoomweefsel met behulp van MTT-gebaseerde cryosectiebeeldvorming

326 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

31 oktober 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we een eenvoudig protocol om de metabolisch actieve cellen in hepatocellulair carcinoomweefsel te detecteren met behulp van MTT-gebaseerde cryosectiebeeldvorming. Deze methode kan ook worden gebruikt om actieve cellen in situ in andere weefsels of organen te detecteren.

Samenvatting

Opkomend bewijs, waaronder eerdere studies, wijst op een subpopulatie van cellen in weefsels van hepatocellulair carcinoom (HCC) die superieure metabole activiteit en stressbestendigheid vertonen. Deze cellen zijn belangrijke aanjagers van tumorprogressie en therapieresistentie. Bestaande methoden voor in situ levensvatbare celdetectie brengen echter vaak de weefselintegriteit in gevaar, veranderen de cellulaire levensvatbaarheid of zijn technisch veeleisend. Deze studie presenteert een nieuwe, eenvoudige, niet-destructieve benadering voor in situ detectie van metabolisch actieve cellen in HCC-weefsels door mitochondriale afhankelijke reductie van 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT) tot onoplosbare formazaankristallen. Door de grootte van weefselfragmenten (1 × 1 × 0,2 cm3), kweekomstandigheden (20% FBS, 1 mg/ml MTT en 3 uur incubatie met intermitterende werveling) en cryosectieparameters (20 μm dikte, 4% PFA-fixatie en DAPI-tegenkleuring) te optimaliseren, werd ruimtelijke kartering van levensvatbare HCC-cellen binnen 5 uur bereikt. Dit kosteneffectieve protocol vereist geen gespecialiseerde apparatuur en handhaaft de weefselarchitectuur, waardoor ruimtelijke identificatie van hoge levensvatbaarheid en stressbestendige celclusters in oppervlaktegebieden mogelijk is. Beperkingen zijn onder meer progressief levensvatbaarheidsverlies na 6 uur en kristalverplaatsing tijdens secties, die kunnen worden beperkt door FBS-suppletie en gecontroleerde bevriezing. Deze methode biedt een praktisch platform voor eencellige isolatie van therapieresistente subpopulaties, waardoor het onderzoek naar HCC-micro-omgevingen wordt bevorderd.

Inleiding

Hepatocellulair carcinoom (HCC), de derde belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd, wordt gekenmerkt door hoge heterogeniteit en recidiefpercentages1. Deze ruimtelijke en temporele heterogeniteit maakt bepaalde celpopulaties in tumorweefsels actiever dan andere op het gebied van metabolisme, proliferatie, progressie, stresstolerantie en resistentie tegen geneesmiddelen. De in situ detectie van levensvatbare cellen in HCC-weefsels heeft een diepgaande klinische en biologische betekenis, aangezien deze cellen prolifererende subklonen, therapieresistente populaties en metastase-initiërende cellen omvatten. Dergelijke levensvatbare cellen kunnen dienen als kritische aanjagers van tumorrecidief, immuunontwijking en therapeutisch falen2.

De huidige technologieën voor ruimtelijke profilering (bijv. ruimtelijke transcriptomics) vereisen echter gespecialiseerde instrumentatie en gaan gepaard met hoge kosten, terwijl traditionele bulkanalyses vaak de ruimtelijke heterogeniteit van levensvatbare cellen en hun dynamische interacties met stromale componenten over het hoofd zien3. Resterende levensvatbare HCC-cellen na resectie vertonen bijvoorbeeld verschillende metabole profielen die niet getrouw kunnen worden gerecapituleerd in gedissocieerde celsystemen4. Het bevorderen van ruimtelijk opgeloste detectietechnologieën is dus absoluut noodzakelijk om de functionele overspraak tussen levensvatbare tumorcellen en hun micro-omgeving te ontrafelen, en uiteindelijk om nauwkeurige therapeutische strategieën te informeren. Hoewel conventionele methoden zoals flowcytometrie of immunohistochemie (IHC) door onze groep zijn gebruikt om de levensvatbare cellen in HCC te detecteren, vereisen ze weefseldissociatie of -fixatie, waardoor de ruimtelijke context verloren gaat en de analyse van cel-celinteracties wordt belemmerd 5,6. Het ontwikkelen van niet-destructieve technologieën met hoge resolutie voor in situ detectie van levensvatbare cellen is dus van cruciaal belang voor het ophelderen van HCC-resistentiemechanismen en het begeleiden van precisietherapieën.

Om de levensvatbare cellen in HCC-weefsels snel in situ te detecteren en weer te geven zonder destructieve behandeling, werd een eenvoudige 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-gebaseerde weefselkweekmethode ontwikkeld. In het kort werden de verse dunne HCC-weefsels (ongeveer 1 × 1 × 0,2 cm3) eerst gedurende 3 uur gekweekt in DMEM-medium met 20% foetaal runderserum (FBS) en MTT (1 mg/ml). Vervolgens, na 4% paraformaldehyde (PFA)-fixatie en DAPI-bevattende montage, werden in OCT ingebedde bevroren weefselobjectglaasjes (20 μm dikte) onderworpen aan microscopische observatie onder fel of UV-licht. De levensvatbare cellen vertonen een paarse, paarsrode of paarszwarte kleur. Met behulp van dit protocol hebben we binnen 5 uur met succes de levensvatbare cellen in HCC-weefsels gedetecteerd. Ondertussen behoudt deze methode de 3D-microarchitectuur, is compatibel met downstream multi-omics-analyse en is eenvoudig, maar ook tijd- en kostenvriendelijk. Deze methode vertoont echter bepaalde beperkingen. De meerstapsprocessen van wassen, snijden en kweken kunnen structurele vervorming en apoptose in weefsels veroorzaken, vooral in monsters met een hoge metabolie, zoals HCC-weefsel in dit onderzoek. Bovendien brengt een grotere dikte van cryosectieplakken de helderheid en vlakheid van microscopische waarnemingen in gevaar.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en goedgekeurd door de Ethische Commissie van het First Affiliated Hospital van Quanzhou (nr. FJMU IACUC2021257). HCC-weefsels werden operatief verwijderd en verzameld in het Quanzhou First Hospital, verbonden aan de Fujian Medical University, met geïnformeerde toestemming van de patiënten. Dit experiment vereist standaard beschermende maatregelen, waaronder het dragen van een laboratoriumjas, een wegwerpmasker en handschoenen.

1. Weefsel preparatie

  1. Plaats een steriel petrischaaltje van 9 cm op ijs. Voeg 30 ml ijskoude fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) toe.
  2. Breng het chirurgisch gereseceerde menselijke HCC-weefsel onmiddellijk over naar de PBS.
  3. Draai de schaal voorzichtig gedurende 5 s om bloedverontreinigingen te verwijderen. Aspireer PBS met behulp van een steriele pipet.
    OPMERKING: Herhaal drie keer.
  4. Breng de tissue over naar het deksel van de petrischaal.
    OPMERKING: De tissues hechten gemakkelijk aan het niet-bevochtigde petrischaaldeksel voor een betere hantering vervolgens.
  5. Snijd het weefsel in ongeveer 1 × 1 × 0,2 cm3 fragmenten met behulp van een steriel chirurgisch mesje (nr. 11).
    OPMERKING: De lengte en breedte van de scherven kunnen worden gewijzigd, maar de diepte moet minder dan 0,2 cm zijn.
  6. Doe de fragmenten terug in een verse schaal van 9 cm gevuld met 30 ml ijskoude PBS.
  7. Draai de schaal voorzichtig gedurende 5 s om bloedverontreinigingen te verwijderen. Aspireer PBS met behulp van een steriele pipet.
    OPMERKING: Herhaal stap 1.7 drie keer. Eén weefselfragment gekookt in PBS (95 °C, 10 min) werd ingesteld als negatieve controle. Voer alle stappen uit onder steriele omstandigheden.

2. Weefselkweek

  1. Voeg 1,8 ml volledig kweekmedium DMEM (voorverwarmd tot 37 °C) met glucose (eindconcentratie = 4,5 g/l) en L-glutamine (eindconcentratie = 2 mM) toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes. Voeg vervolgens 0,6 ml FBS (eindconcentratie = 20% v/v) en 0,6 ml MTT-voorraad (eindconcentratie = 1 mg/ml) toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes.
  2. Breng de weefselfragmenten over in putjes met behulp van een steriele tang.
  3. Plaats de plaat met 6 putjes in de broedmachine. Incubeer gedurende 3 uur bij 37 °C met 5% CO2.
    NOTITIE: Draai de plaat elke 30 minuten voorzichtig 3 s rond. De incubatie kan worden beëindigd zodra het oppervlak van de weefselfragmenten paars of paarszwart wordt.

3. Beëindiging en vastlegging

  1. Zuig het MTT-medium aan. Was weefselfragmenten met ijskoude zoutoplossing.
    OPMERKING: Herhaal vijf keer.
  2. Voeg 2 ml 4% neutraal gebufferde formaline (NBF) toe aan elk putje van een plaat met 6 putjes.
  3. Zet de plaat 1 uur in de koelkast op 4 °C.

4. Cryosectie

  1. Dep de fragmenten voorzichtig op schoon absorberend papier.
  2. Plaats het weefsel in een cryomold gevuld met OCT-verbinding.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met OCT-verbinding.
  3. Vries de tissue in een koelkast op lage temperatuur bij -80 °C gedurende 20 minuten in.
  4. Monteer het bevroren blok op een cryostaathouder bij -20 °C.
  5. Snijd 100 μm secties bij -20 °C totdat het weefseloppervlak bloot komt te liggen.
    OPMERKING: Het weefseloppervlak vertoont een paarsachtige kleur.
  6. Verzamel plakjes van 20 μm met behulp van met lijm beklede dia's.
    OPMERKING: De plakjes tissue moeten in een paarse, paarsrode of paarszwarte tint aanwezig zijn.
  7. Fixeer de plakjes in 4% paraformaldehyde (PFA) op kamertemperatuur gedurende 2 min.
  8. Spoel de dia's voorzichtig af met PBS gedurende 1 minuut.
    OPMERKING: Herhaal drie keer.

5. Bevestiging

  1. Breng 1 druppel DAPI-bevattend (eindconcentratie: 1 μg/ml) montagemedium aan.
  2. Dek af met een dekglaasje.
  3. Plak de randen af met nagellak.
    OPMERKING: Dia's met verzegelde randen kunnen in het donker bij 4 °C worden bewaard als de microscopie niet onmiddellijk wordt uitgevoerd.

6. Microscopie

  1. Visualiseer paarse, paarsrode of paars-donkere formazanafzettingen (levensvatbare cellen) bij een vergroting van 20× onder helderveld met behulp van helderveldmicroscopie.
  2. Detecteer blauwe DAPI (kernen) onder UV-verlichting met behulp van fluorescentiemicroscopie.
  3. Voeg helderveld- en fluorescentiekanalen samen voor ruimtelijke correlatie.
    OPMERKING: De software die hier wordt gebruikt is NIS Element F (versie 4.00.06).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze studie heeft met succes metabolisch actieve cellen in HCC-weefsel gedetecteerd zonder de weefselarchitectuur te verstoren. Ten eerste toonden de helderveldbeelden (Figuur 1A) aan dat het weefseloppervlak een dichte cellulaire dekking en een meerlagige stapeling van cellen over het objectglaasje vertoonde, wat de bewaarde architecturale integriteit van het HCC-weefsel tijdens de kweek en verwerking bevestigt. Met name clusters van cellen in oppervlakkige...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De huidige methodologieën voor in situ levensvatbare celdetectie hebben nog steeds te maken met veelzijdige beperkingen. IHC en immunofluorescentie (IF), die veel worden gebruikt om proliferatiemarkers of apoptose-gerelateerde eiwitten te identificeren, lijden aan verstoring van de membraanintegriteit veroorzaakt door formaldehydefixatie7. Bovendien is de penetratie van antilichamen in dikke weefselsecties suboptimaal8. Fluorescere...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Science and Technology Bureau van Xiamen City (nr. 3502Z20227197), het Startup Fund for Scientific Research van Fujian Medical University (2021QH1240). We danken Xianying Zhang, Jingjing Zhou en Shaocong Weng (Huaqiao University) voor hun technische hulp.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
-80 °C vriezer (rechtopstaand)Thermo Fisher ScientificTSX60086V
Schone werkbank (verticale luchtstroom)AIRTECHSW-CJ-1FD
CO2 incubator (165 L)Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i (bijv. 51030400 / 51033559)
Dekglas (24×50 mm, #1.5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
Kweekpetrischaal (90 mm)NEST752001 (voorbeeld)
Montagemiddel met DAPIBeyotimeP0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (hoge glucose, met pyruvaat)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (gekwalificeerd, VS-oorsprong)Invitrogen (Gibco)A3160501
FluorescentiemicroscoopNikonECLIPSE Ti2-serie
Freesmicrotoom (cryostat)LeicaCM1950
Microscoopglaasjes (plat, 25×75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
MTT-reagens (poeder)BeyotimeST316
Nailpolish (doorzichtig)Beyotime—
NBF (neutraal gebufferd formaline)Beyotime—
OCT-compoundSAKURA (Sakura Finetek)4583
Optische microscoop (rechtopstaand)NikonECLIPSE Ci-serie (bijv. Ci-L)
PBS (500 mL)BeyotimeC0221A
PFA, 4% in PBS (fixeermiddel)BeyotimeP0099
Pipettip (1 mL, low-binding)KIRGENKG1313-L
Pipettip (200 µL)Axygen (Corning)T-200-Y (bulk) / T-200-Y-R-S (gesteriliseerd)
Pipettor (enkelkanaals)Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2 (bereikspecifiek cat#)
SchaarHYSTICmodel varieert (bijv. leverancier ref. 100022208326)
PincetHYSTICmodel varieert

Referenties

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

MTT beeldvormingin kaart brengen van levensvatbare cellentumormicro omgevingtherapieresistentieformazankristallenisolatie van enkelvoudige cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.