Methodenartikel

Extractie van histonen uit klinische monsters voor epigenetisch profileren door middel van massaspectrometrie

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 november 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol maakt efficiënte histonextractie uit verschillende klinische monsters mogelijk voor latere posttranslationele modificatieanalyse door LC-MS/MS. Door robuuste detectie van belangrijke histonmodificaties te faciliteren, dient het als een waardevol hulpmiddel voor uitgebreide epigenetische profilering in grote klinische cohorten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitgebreid experimenteel bewijs ondersteunt de rol van epigenetische mechanismen bij het ontstaan, de progressie en het recidief van kanker. Onder deze reguleren histonvarianten en hun post-translationele modificaties (PTM's) de organisatie en dynamiek van chromatine, en de toegankelijkheid van het genoom, waardoor belangrijke DNA-gebaseerde processen worden beïnvloed, zoals transcriptie, replicatie en DNA-schadeherstel via de zogenaamde histoncode. Ontregelde histon PTM-patronen worden vaak waargenomen bij kankers, waarbij sommige markers als diagnostische en prognostische biomarkers zijn aangetoond. Daarom zijn nieuwe methodologieën die onbevooroordeelde en uitgebreide histon-PTM-profilering in klinische monsters mogelijk maken, zeer waardevol voor het karakteriseren van de epigenetische landschappen van tumoren. Hier presenteren we een protocol voor de efficiënte extractie van histonen uit klinische monsters, waaronder snap freezen, optimal-cutting temperature (OCT) bevroren en formaline-gefixeerde paraffine-embedded (FFPE) biopsieën. Deze benadering levert histoneiwitten op van voldoende hoeveelheid en kwaliteit voor de daaropvolgende bottom-up analyse met behulp van high-performance vloeistofchromatografie gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie (LC-MS/MS). Deze workflow maakt robuuste detectie en kwantificering van belangrijke histonmodificaties, met name lysine-acetylaties en methyleringen, mogelijk bij primaire tumormonsters, waardoor een extra moleculaire laag ontstaat voor de karakterisering van kanker.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de kern van eukaryote cellen assembleren histonen zich met DNA om de nucleosomen te vormen, de fundamentele structurele eenheden van chromatine. Elk nucleosoom bestaat uit ongeveer 146 bp DNA dat is gewikkeld rond een octameer dat bestaat uit twee kopieën van kernhistonen H2A en H2B, samen met twee dimeren van histonen H3 en H4. Daarnaast is er ook een linkerhiston H1 aanwezig die de hogere-orde chromatineorganisatie faciliteert door zowel het nucleosoom als de linker-DNA-stretch tussen nucleosomen1 te binden. Histonen worden versierd met een grote verscheidenheid aan post-translationele modificaties (PTM's) die voornamelijk aanwezig zijn bij hun N-terminale staarten. Deze aanpassingen omvatten methylering, verschillende soorten acylatie (acetylering, propionylering, butyrylering, enz.), fosforylering, SUMOylering, ubiquitylering, ADP-ribosylering en crotonylering, waarvan lysine- en argininemethylering en lysine-acetylering het meest gekarakteriseerdzijn. De specifieke typen, locaties en combinaties van histonmodificaties creëren wat bekend staat als de histoncode. Deze code bestaat uit verschillende post-translationele modificaties (PTM's) op de N-terminale staarten van histonen, die worden toegevoegd en verwijderd door specifieke histone-modificerende enzymen. Deze modificaties worden vervolgens herkend door effectoreiwitten, wat leidt tot veranderingen in chromatinestructuur, zoals verdichting of decondensatie, die uiteindelijk verschillende biologische processen beïnvloeden, waaronder DNA-schadeherstel, replicatie en vooral gentranscriptie 3,4.

DNA-methylering en histon-PTM's behoren tot de meest bestudeerde epigenetische kenmerkenbij kanker. Recent experimenteel bewijs heeft veranderingen aangetoond in de niveaus van verschillende histon-PTM's bij verschillende kankertypen. Opmerkelijk is dat het verlies van H4K20me3 en H4K16ac is gerapporteerd als kenmerken van kanker, aangezien hun niveau in vrijwel alle tumoren werd gedaald ten opzichte van hetnormale weefsel. Onze groep identificeerde het verlies van H3K14ac als een mogelijk kenmerk van kanker door de vermindering ervan in verschillende kankersoorten te kwantificeren vergeleken met normale tegenhangers met behulp van massaspectrometrie (MS)-gebaseerde benaderingen5. Bovendien hebben talrijke studies de prognostische waarde van histon-PTM's benadrukt, waaruit blijkt dat veranderingen in hun globale niveaus, voornamelijk beoordeeld door immunohistochemie in patiëntbiopsieën, correleren met kankerprogressie, histologische beoordeling en therapeutische respons 6,7,8. Daarom is histon-PTM-analyse in kankermonsters belangrijk voor de identificatie van nieuwe diagnostische en prognostische biomarkers, evenals potentiële doelwitten van de zogenaamde epi-drugs8.

Zeer gebruikelijke methoden voor de analyse van histon-PTM's in cellijnen en klinische monsters zijn gebaseerd op antistofgebaseerde technieken, zoals immunoblotting, immunohistochemie en enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9. Echter, antistofgebaseerde methoden hebben verschillende beperkingen, waaronder kruisreactiviteit of, omgekeerd, epitoopmaskering10. Kruisreactiviteit treedt op wanneer antilichamen binden aan onbedoelde doelen met vergelijkbare epitopen, wat leidt tot mogelijke vals-positieven, terwijl epitoopmaskering verwijst naar het missen van detectie van een specifiek epitoop (in dit geval een histon PTM of variant) door de aanwezigheid van andere modificaties op de naburige residuen. Bovendien is de hoeveelheid weefsel die nodig is voor histonmodificatieanalyse met antilichamen vaak hoog, omdat slechts een beperkt aantal PTM's gelijktijdig kan worden gedetecteerd, waardoor er meerdere weefselsneetjes moeten worden verwerkt voor gemultiplexeerde analyses11. Massaspectrometrie (MS) is uitgegroeid tot de voorkeursmethode voor het profileren van histon-PTM's en varianten, waarmee de beperkingen van antistofgebaseerde benaderingen 5,8 worden overwonnen. MS is gebaseerd op het detecteren van een verschil in massa (Δm, deltamassa) tussen de theoretische en experimenteel gemeten massa's van peptiden en eiwitten. Het is onbevooroordeeld, uitgebreid en kwantitatief, omdat het de identificatie en kwantificering van PTM's en varianten mogelijk maakt zonder vooraf kennis van hun locatie te vereisen. Dit maakt MS bijzonder waardevol voor de gevoelige en nauwkeurige analyse van veranderingen in histon (PTM's) bij kanker en andere pathologische aandoeningen8.

Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor histonextractie uit klinische monsters, gekoppeld aan MS-gebaseerde profilering van histon-PTM's, hierna aangeduid als epi-proteomics workflow. Patiëntbiopten worden voornamelijk opgeslagen als verse bevroren (FF) monsters, optimale snijtemperatuur (OCT) bevroren monsters en formaline-gefixeerde paraffine-ingebedde (FFPE) monsters12. Terwijl verse biopten in vloeibare stikstof of voorgekoeld isopentaan worden ingevroren zonder toevoeging van enig conserveringsmedium13, bevatten OCT-bevroren biopten een wateroplosbaar cryoprotectief inbeddingmedium, voornamelijk bestaande uit polyvinylalcohol en polyethyleenglycol, dat het snijdenvan weefsel 14 vergemakkelijkt. FFPE-monsters daarentegen, gefixeerd in formaline en ingebed in paraffine, vormen de meest gebruikte opslagmethode voor klinische monsters, omdat ze meerdere jaren bij kamertemperatuur kunnen worden opgeslagen, waardoor kostbaar onderhoud bij lage of ultralage temperaturen15 wordt voorkomen. Omdat ze vrij zijn van conserveringsadditieven, kunnen snap-frozen biopten direct worden verwerkt voor histonextractie, terwijl OCT-bevroren en FFPE-biopten de eerste stappen van inbeddingsmedium/fixatieve verwijdering vereisen. FFPE-monsters vereisen ook uitgebreide eiwitdecrosslinking en antigeenophaal.

Dit protocol beschrijft gedetailleerde methoden voor het extraheren van histonen uit versbevroren, OCT-ingebedde en FFPE-klinische monsters, waarbij voldoende hoeveelheid en kwaliteit wordt gegarandeerd voor downstream MS-analyse door rekening te houden met de specifieke uitdagingen die gepaard gaan met elk type monsterconservering (stap 1). Histonen die uit klinische monsters zijn gezuiverd, worden gescheiden via eiwitgelelektroforese onder denaturerende omstandigheden (SDS-PAGE), gevolgd door een derivatisatiestap, en enzymatisch verteerd om peptiden van een geschikte lengte (4-15 aminozuren) te genereren voor bottom-up massaspectrometrieanalyse16 (stap 2). Meer specifiek worden histonen verteerd met een ArgC-achtige strategie, waarbij trypsine, dat gewoonlijk snijdt aan het C-terminus van ongemodificeerde lysines (K) en arginines (R), alleen wordt geïnduceerd om te snijden bij het C-terminus van arginines, vanwege een eerdere chemische acylering van ongemodificeerde en monomethylatieve lysines met propionanhydride (PRO). Vervolgens worden Arg-C-achtige verteerde histonpeptiden geacylateerd aan hun N-terminale staarten door toevoeging van fenylisocyanaat (PIC). Deze verdere derivatisatie verhoogt de peptidehydrofobiciteit en maakt een betere scheiding van korte histonpeptiden mogelijk door reverse-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC), wat de identificatie en kwantificering van isobare peptidovormen17,18 (stap 3) verbetert. Al met al benadrukken de hier beschreven methoden de kracht van MS-gebaseerde histonprofilering in kankerepigeneticastudies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vers ingevroren en OCT-ingevroren weefselbiopten werden verkregen met geïnformeerde toestemming van patiënten die een operatie ondergingen aan het Europees Instituut voor Oncologie (Milaan), terwijl FFPE-biopten werden verkregen van patiënten die een operatie ondergingen in het Istituto Neurologico Carlo Besta (Milaan). Deze studie werd goedgekeurd door het Ethisch Comité van het Europees Instituut voor Oncologie (Studie UID 2550) en van het Istituto Neurologico Carlo Besta (Studie CET 39/24).

1. Histonextractie uit patiëntafgeleide weefsels (Figuur 1A)

OPMERKING: Om histonen van representatieve tumorcelpopulaties te analyseren en de variabiliteit tussen steekproeven te verminderen, is het raadzaam klinische biopten te gebruiken met een tumorcellulariteit van ten minste 50% en zonder necrotische gebieden en/of uitgebreide immuuninfiltratie.

  1. Histonenverrijking uit versbevroren weefsels (geschatte duur: 60 min)
    OPMERKING: Alle stappen moeten op ijs worden uitgevoerd.
    1. Ontdooi het weefsel op ijs en snijd een stuk van ongeveer 20-30 mg, meestal ongeveer 2 mm3 weefsel.
    2. Breng het monster over in een buisje van 1,5 mL en snijd het weefsel in kleine stukjes met een schaar (Table of Materials).
    3. Voeg 1 ml Nuclei Isolation Buffer toe (Tabel 1), vers aangevuld met de proteaseremmers die in de Materiaaltabel staan. Meng daarna goed.
    4. Breng het monster over in een Dounce-homogenisator (Table of Materials).
      OPMERKING: Gebruik bij grote weefselstukken een p1000-tip (bij het knippen van de punt met een schaar) om het monster beter te verzamelen.
    5. Homogeniseer het weefsel door eerst de LOSSE en daarna de TIGHT stamper (Table of Materials) te gebruiken totdat de weefselstukjes onzichtbaar zijn voor het blote oog.
    6. Filter het gehomogeniseerde monster door een 100 μm celzeef (Table of Materials) om weefselresten te verwijderen.
    7. Pipetteer krachtig op en neer met een p200 om het plasmamembraan op te lossen en het monster over te brengen naar een nieuwe buis van 1,5 mL.
    8. Pellet de celkernen door centrifugatie op 2.300 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C met een werkbank centrifuge (Materiaaltabel).
    9. Verwijder het supernatant en suspendeer de nucleaire pellets opnieuw in 50-100 μL Nuclei Isolation Buffer, aangevuld met 0,1% SDS om het nucleaire membraan op te lossen (Materiaaltabel).
    10. Voeg 250 U Benzonase-nuclease toe om nucleïnezuren te verteren, meng goed en incubeer 2 minuten bij 37°C (Materiaaltabel).
      OPMERKING: Als het monster nog stroperig is, kan sonicatie ook worden uitgevoerd in een waterbad (instelling: 10 min 30s ON/30s OFF; vermogen: hoog; temperatuur: 4 °C). Na deze stap kunnen monsters worden opgeslagen bij -20 °C.
  2. Histonenverrijking uit OCT-monsters (geschatte duur: 90 min)
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor vier/vijf OCT-secties van 10 μm dik, overeenkomend met 20-60 mg weefsel. Het aantal weefseldoorsneden hangt echter af van het type klinische biopsie en het totale weefseloppervlak. Gezien de schaarste van klinische monsters kan extractie uit een lagere hoeveelheid startweefsel worden uitgevoerd, hoewel dit kan leiden tot een verminderde detectie van histonmodificaties.
    1. Plaats vier/vijf weefselsecties van 10 μm dik, overeenkomend met ongeveer 20-60 mg weefsel, in een buisje van 1,5 mL.
    2. Was de secties 2 minuten met 1 ml ijskoude 70% EtOH (Tabel 1) op een roterend wiel (Materiaaltafel) bij 4 °C.
    3. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C in een werkbankcentrifuge.
    4. Herhaal stappen 1.2.2 en 1.2.3 in totaal 3 keer.
    5. Rehydrateer de monsters in 1 mL dubbel gedestilleerd water (ddH2O) met rotatie (Materiaaltabel) gedurende 2 minuten bij 4 °C.
    6. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 2 minuten bij 4 °C in een werkbankcentrifuge (Materiaaltafel).
    7. Herhaal stappen 1.2.5 en 1.2.6 twee keer met 1x PBS (Table of Materials).
    8. Ga door naar stap 1.1.2 van het verrijkingsprotocol vanuit vers ingevroren monsters.
  3. Histonextractie uit FFPE-monsters (geschatte duur: 8 uur)
    OPMERKING: Het beschreven protocol is ontwikkeld voor vier FFPE-secties van 10 μm dik, die ongeveer overeenkomen met 20-60 mg weefsel. Voor de meeste MS-analyses van histonmodificaties is deze hoeveelheid te hoog en vormt het een veilig startpunt wanneer het materiaal niet beperkend is. Er kan echter ook minder uitgangsmateriaal worden gebruikt, wat vooral relevant is gezien de vaak kleine hoeveelheid weefsel die beschikbaar is bij het analyseren van klinische monsters. Het gebruik van minder uitgangsmateriaal, hoewel mogelijk, vermindert doorgaans de kwantificatiebestendigheid voor laag-overvloedige histonmodificaties (bijv. H3K27ac, of multi-methylated H3K27/K36-peptiden), en dit effect kan variëren afhankelijk van het weefseltype en van monster tot monster. Desalniettemin heeft ons laboratorium eerder aangetoond dat MS-gebaseerde histon PTM-profilering succesvol kan worden uitgevoerd op laser-microdissecte weefselgebieden van borstkanker FFPE-monsters die overeenkomen met slechts 1.000 cellen18.
    1. Plaats vier FFPE-secties van 10 μm dik, overeenkomend met ongeveer 20-60 mg weefsel, in een buisje van 1,5 mL.
    2. Voeg 1 mL paraffineoplosmiddel toe aan het monster en de vortex (Materiaaltabel) op maximale snelheid gedurende 30 seconden, totdat paraffine volledig is opgelost.
      VOORZICHTIG: Paraffineoplossende reagentia zijn mutagen, kankerverwekkend en ontvlambaar, dus ze moeten onder een chemische kap worden gebruikt.
      OPMERKING: Paraffineoplossing wordt bereikt wanneer paraffinestukken niet langer met het blote oog zichtbaar zijn, en het paraffineoplosmiddel een witachtige, homogene kleur heeft.
    3. Centrifugeer 16.000 x g gedurende 3 minuten bij RT in een werkbankcentrifuge en gooi het supernatant af. Om ongewenste aspiratie van monsters tijdens het verwijderen van supernatant te voorkomen, kunnen vacuümpompen/pipetten worden afgesloten met een kleinere tip (bijv. p200, p10 tips).
    4. Herhaal stap 1.3.2 en 1.3.3 nog drie keer (in totaal 4x) om volledige paraffineverwijdering te garanderen. Of weeg het volledig gedeparaffiniseerde monster om een indicatieve uitlezing te krijgen van de hoeveelheid verwerkte weefsel.
    5. Voeg 1 mL 95% EtOH-oplossing toe (Tabel 1) en vortex op maximale snelheid gedurende 30 seconden, om volledige weefselresuspensie te garanderen.
    6. Centrifugeer 16.000 x g gedurende 3 minuten bij RT in een werkbankcentrifuge en gooi het supernatant af. Weeg het gedehydrateerde monster ook om een indicatie te hebben van de hoeveelheid droog weefsel die wordt verwerkt.
    7. Herhaal stap 1.3.5 en 1.3.6 met 70%, 50% en 20% EtOH (Tabel 1) en ddH2O om het monster te rehydrateren.
    8. Voeg 200 μL extractiebuffer toe (Tabel 1).
      OPMERKING: Als er grotere stukjes weefsel aanwezig zijn, knip ze dan in kleinere stukken met een schaar. Afhankelijk van de hoeveelheid weefsel kunnen kleinere/grotere volumes extractiebuffer worden toegevoegd om een goede monsterlyse te garanderen. Voor bijzonder kleine pellets die worden hersuspendeerd in een volume extractiebuffer kleiner dan 100 μL, kan sonicatie worden uitgevoerd met een sonicatieapparaat (Materiaaltafel) (30 s AAN/30 s UIT-vermogen: hoog, 10 cycli).
    9. Homogeniseer weefsel in extractiebuffer door sonicatie met een digitale sonificator (Materiaaltabel) met een 3 mm microtip (>15 cycli, 5s ON/2 min OFF, vermogen: 15-30%).
      OPMERKING: Monsters kunnen als correct gehomogeniseerd worden beschouwd wanneer er geen zichtbare weefseldeeltjes zichtbaar zijn in de oplossing en de extractiebuffer een uniforme, niet-troebele kleur vertoont. Houd samples op RT tijdens sonicatiecycli. IJs kan de neerslag van SDS in de extractiebuffer veroorzaken, waardoor de weefselhomogenisatie wordt belemmerd. Een juiste sonicatie is cruciaal om volledige weefsellysis en eiwitextractie te bereiken. Plaats de microtip op de juiste hoogte in de monsterbuis (deze mag de onderkant van de buis niet raken, waardoor plastic deeltjes vrijkomen, en mag niet op het luchtextractiebuffer-interface zitten, waardoor schuim en belletjes ontstaan).
    10. Na homogenisatie incubeer je monsters bij 95 °C gedurende 45 minuten in een thermomixer. Open elke 15 minuten het deksel van de buizen zodat formaldehyde kan verdampen.
    11. Incubeer monsters bij 65 °C gedurende 4 uur in een thermomixer. Open het deksel elke 20-60 minuten zodat formaldehyde kan verdampen.
    12. Centrifugeer 16.000 x g voor 1 minuut bij RT in een werkbankcentrifuge en breng het supernatant over in een nieuwe buis.
      OPMERKING: Monsters kunnen op dit punt worden opgeslagen bij -20 °C.

Tabel 1: Buffersamenstelling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

2. Histonresolutie via SDS-PAGE en in-gel vertering

  1. SDS-PAGE (Figuur 1B; geschatte duur: 2 uur)
    1. Om de zuiverheid van histonen te beoordelen en hun hoeveelheid te schatten, laad je 1/10 van de histonenextracten op een gel van 17% polyacrylamide (SDS-PAGE; Tabel 1) naast bekende hoeveelheden recombinante histonen, zoals geïllustreerd in Figuur 1B.
      OPMERKING: In plaats van 1/10 van histonextracten te laden, kan 15-50 μg eiwitten, gemeten door assays die hoge detergentconcentraties verdragen, zoals de bicinchoninezuur (BCA) eiwitassay19 , worden geladen. Houd er echter rekening mee dat histonverrijking over totaal eiwitten sterk kan variëren tussen versbevroren, OCT-bevroren en FFPE-monsters, en dat kwantificatie van histonenhoeveelheid alleen kan worden gebaseerd op SDS-PAGE. 1, 0,5 en 0,25 μg recombinante histon H3.1 (Materiaaltabel) kunnen als referentie worden geladen om de histonhoeveelheid nauwkeuriger te kwantificeren.
    2. Meng de monsters met lithiumdodecylsulfaat (LDS) laadbuffer, of met equivalente laadbuffers voor SDS-PAGE (bijv. Laemmli-buffer) met toevoeging van dithiothreitol (DTT; Materiaaloverzicht) bij een eindconcentratie van 10 mM.
    3. Denaturemonsters bij 95°C gedurende 5 minuten in een thermomixer.
    4. Na de eiwitscheiding op de SDS-PAGE kleurt u de gel met Coomassie-kleuring (Table of Materials).
    5. Schat de histonopbrengst door visuele of software-ondersteunde 20-kwantificatie van histonbanden in klinische monsters vergeleken met recombinante histon H3 geladen bij bekende hoeveelheden.
  2. Histon in-gel vertering (Figuur 2; geschatte duur: 2 dagen)
    OPMERKING: ArgC-achtige vertering wordt gebruikt voor MS-analyse van histon-PTM's omdat standaard trypsine-vertering extreem korte peptiden genereert, vanwege de hoge frequentie van lysine- en arginineaminozuren in hun sequentie, wat de LC-MS-detectie van peptiden en PTM-identificatie belemmert. Door lysines chemisch te modificeren, wordt de tryptische splijting op deze plaatsen voorkomen, wat resulteert in splijting aan het C-terminus van arginines alleen, waardoor langere peptiden (4-15 aminozuren) ontstaan die gemodificeerde lysines binnen de sequentie bevatten; Over het algemeen faciliteert dit protocol de detectie en meting van gemodificeerde histonpeptiden van MS en is het grondig beschreven in talrijke publicaties8,17,21.
    OPTIONEEL: Een interne standaard (bijv. zwaar gelabelde spike-in, synthetisch gelabelde peptiden22) kan worden gemengd met histonmonsters in een verhouding van 1:1 om een nauwkeurigere peptidekwantificering in MS te bereiken (Figuur 2B).
    1. Laad 3-5 μg histonmonster op een 17% polyacrylamide gel, gebaseerd op de geschatte histonkwantificatie uitgevoerd in stap 2.1.5 (Figuur 2B).
    2. Na SDS-PAGE visualiseer je eiwitten door de gel te kleuren met Coomassie-kleuring.
      OPMERKING: Om besmetting te voorkomen die de LC-MS/MS-analyse kan verstoren, is het aan te raden de volgende stappen uit te voeren in een keratinevrije omgeving, zoals een speciale afzuigkap, aangezien keratine een sterke MS-verontreiniging is.
    3. Exciseer gelbanden die overeenkomen met het molecuulgewicht van kernhistoneiwitten (gelband tussen 10 en 18 kDa, rekening houdend met het volgende molecuulgewicht voor elke kernhistonen: H3 ongeveer 17 kDa, H2A-H2B ongeveer 14 kDa, H4 ongeveer 11 kDa) met behulp van een scalpel (Materiaaltabel) en snijd banden door in stukken van elk ongeveer 1 mm3 .
    4. Met behulp van het scalpel breng je de gelstukjes over in een buisje van 1,5 mL.
      OPMERKING: Om gelstukken volledig te bedekken, kunnen de hieronder aangegeven volumes worden vergroot, waarbij de reagensstoichiometrie behouden blijft.
    5. Ontkleur de gelstukken door een oplossing van 50% acetonitril (ACN) toe te voegen in ddH2O (Tabel 1). Plaats het in een thermomixer die op 1.400 rpm staat voor 10 minuten RT en gooi daarna het supernatant weg.
    6. Herhaal stap 2.2.5 totdat de gelstukjes volledig gekleurd zijn.
    7. Dehydrateer de gelstukjes door 100% ACN toe te voegen (Table of Materials). Incubeer met mengen op 1.400 rpm voor 10 minuten RT en gooi daarna het supernatant weg.
    8. Herhaal stap 2.2.7 totdat de gelstukjes wit en hard lijken, dus volledig uitgedroogd.
    9. Droog de gelstukken 5 minuten bij RT in een vacuümcentrifuge (Materiaaltabel).
      OPMERKING: Histonen zijn arm aan cysteïnes (slechts twee cysteinen worden gevonden in histon H3 op posities 96 en 110 (UniprotKB ID P68431), en slechts één cysteïne wordt gevonden in histon H2B op positie 154 (UniprotKB ID B4DR52)). Bovendien zijn deze cysteinen aanwezig in peptiden die niet detecteerbaar zijn bij ArgC-achtige vertering bij bottom-up MS, waardoor chemische adducten van thiolgroep23 geen artefact zijn in MS-analyse van histonen, en er geen cysteïnereductie- en alkyleringsstappen worden uitgevoerd in het beschreven protocol.
    10. Voeg 15 μL van 7,7 m propionaanhydride (PRO) oplossing (Tabel van Materialen) en 26 μL van 1 M ammoniumbicarbonaat (AmBic) (Materiaaltabel) toe aan elke buis en incubeer monsters in een thermomixer die staat ingesteld op 350 rpm gedurende 10 minuten bij 37 °C.
      OPMERKING: Aangezien anhydrides opgelost in een reactieve buffer de neiging hebben te verdampen, bereid geen mastermix van PRO en AmBic, maar voeg ze afzonderlijk toe aan elk monster om de juiste concentratie PRO in elke buis constant te houden.
    11. Bedek gelstukken volledig door 1 M AmBic toe te voegen (aanbevolen volume: 80 μL) en incubeer monsters door te mengen bij 1.400 rpm gedurende 4 uur bij 37°C in een thermomixer. Verwijder daarna alle vloeistof.
      OPMERKING: 1 M AmBic wordt toegevoegd om een basale pH te behouden, ideaal voor het katalyseren van de propionylering van ongemodificeerde en monomethylatieve lysines door PRO.
    12. Was drie keer met ddH2O, waarbij je monsters tussendoor in RT incubeer gedurende 10 minuten terwijl je in een thermomixer op 1.400 rpm mengt. Gooi na elke wasbeurt vloeistof weg.
    13. Voeg 50% ACN toe en incubeer in een thermomixer op 1.400 rpm gedurende 15 minuten bij RT. Gooi de vloeistof daarna weg.
    14. Dehydrateer de gelstukken volledig door 100% ACN toe te voegen en incubeer op 1.400 rpm gedurende 15 minuten bij RT in een thermomixer. Gooi de vloeistof daarna weg.
    15. Herhaal stap 2.2.14 totdat de gelstukken wit en droog lijken.
    16. Droge gelstukken 5 minuten bij RT in een vacuümcentrifuge.
    17. Voeg aan elk monster 4 μL trypsine-oplossing toe (Tabel 1) en 20 μL verteringsbuffer (Tabel 1) en incubeer 10 minuten op ijs om trypsine in gelstukken te absorberen.
      OPMERKING: Deze incubatie - uitgevoerd met geconcentreerde trypsine-oplossing en Digestiebuffer (50 mM AmBic in ddH2O, wat een basispH creëert die ideaal is voor trypsine-splitsing) - maakt het mogelijk dat het enzym door de gelstukken wordt opgenomen vóór activatie bij 37 °C.
    18. Wanneer geconcentreerd trypsine volledig is opgenomen, bedek je de gelstukken grondig met een extra verteringsbuffer (indicatief volume: 80 μL) en incubeer je het bij 37 °C een nacht in een thermomixer.
    19. Om verteerde peptiden uit de gelstukken te extraheren, voeg je 100 μL 100% ACN toe en incubeer je bij 1.400 rpm gedurende 20 minuten bij RT in een thermomixer.
    20. Verzamel het supernatant en doe het over in een nieuwe 1,5 mL buis.
    21. Voeg 80 μL 100% ACN toe aan gelstukken en incubeer op 1.400 rpm voor 10 minuten RT in een thermomixer.
    22. Verzamel supernatant en combineer het met dat in Stap 2.2.20 verzameld, en concentreer vervolgens de peptiden in een vacuümcentrifuge tot een volume tussen 1 en 5 μL.
      OPMERKING: Het gebruik van een vacuümcentrifuge maakt de verdamping van het organische oplosmiddel (ACN) mogelijk. Het wordt echter aanbevolen het monster in dit stadium niet volledig te drogen, omdat dit de volgende derivatisatiestap negatief kan beïnvloeden. Als het monster droog is, suspendeer het dan opnieuw in ddH2O water en sonicaat het 5 minuten in een waterbad.
    23. Voeg ddH2O toe aan elk monster aan een eindvolume van 15 μL, voeg vervolgens 2 μL van 1 M triethylammoniumbicarbonaat toe (Materiaaltabel) en 3 μL fenylisocyanaat (PIC) oplossing (Tabel 1) en incubeer bij 350 rpm gedurende 90 minuten bij 37 °C in een thermomixer.
      VOORZICHTIG: PIC is mutageen en kankerverwekkend, dus het wordt aanbevolen het onder een chemische kap te behandelen. Omdat PIC zeer reactief en vluchtig is, wordt aanbevolen om geen meestermix van triethylammoniumbicarbonaat en PIC te bereiden, maar het is aan te raden elk reagens afzonderlijk toe te voegen om de aanwezigheid van de exacte PIC-concentratie te waarborgen.
    24. Voeg aan elke buis 8 μL 1% trifluorazijnzuur (TFA; Materiaaloverzicht) om de derivatisatie met PIC te stoppen.
    25. Verdun elk monster met 100 μL Buffer A (Tabel 1) en laad deze op C18-traptips (bereid zoals beschreven in24 of gekocht bij verschillende leveranciers).
    26. Draai de monsters op 2.100 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C in een zwaairotorcentrifuge om histonpeptiden aan de C18-hars te laten binden.
      OPMERKING: Monsters kunnen enkele maanden op Stage tips worden bewaard bij 4 °C.
    27. Voeg 30 μL elutiebuffer toe (Tabel 1) aan C18 Stage Tips en plaats tips in een nieuwe 1,5 mL buis. Draai monsters op 1.000 x g gedurende 10 minuten in een centrifuge op een werkbank bij 4 °C om histonpeptiden te elueren.
    28. Concentreer monsters tot een volume tussen 1 en 3 μL met een vacuümcentrifuge, voeg vervolgens 1% TFA toe om een eindvolume van 6 μL te bereiken.
    29. Laad 5 μL peptideoplossing in een 96-put microplaat voor MS-analyse (Table of Materials) en sluit deze af met een afdichtingsmat (Table of Materials).

3. HPLC-MS/MS en data-analyse (Figuur 3)

OPMERKING: De hierbij beschreven parameters zijn geschikt voor een ESAY-nLC 1200 vloeistofchromatografiesysteem dat via een EASY Spray-kolom is verbonden met een Q Exactive Plus Orbitrap massaspectrometer (Table of Materials), maar vergelijkbare/equivalente instrumenten kunnen ook worden gebruikt, met ad-hoc parameters.

  1. HPLC-MS/MS (geschatte duur: 90 minuten per monster)
    1. Injecteer 3 μL van de 5 μL histonpeptiden van stap 2.2.29 (overeenkomend met ongeveer 0,25-0,8 μg, gebaseerd op histonkwantificatie met SDS-PAGE) op een C18-nanokolom (Materiaaltabel) bij een constante stroom van 500 nl/min in Buffer A.
    2. Pas een lineaire gradiënt van 55 minuten toe van 10%-45% Buffer B bij een debiet van 250 nL/min om peptiden te scheiden.
    3. Verkrijg de MS/MS-gegevens in data-afhankelijke modus (DDA) om automatisch te schakelen tussen MS1 en MS2 met behulp van de speciale softwarepakketten (Table of Materials).
      OPMERKING: Voor acquisitie- en algemene instellingen, zie Tabel 2.
  2. RAW MS data-analyse
    OPMERKING: In dit protocol wordt de kwantificatie van histon-PTM's uitgevoerd met behulp van EpiProfile, een open script (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), gebruiksvriendelijk en geschikt voor standaardanalyses zoals beschreven voor H3- en H4-lysinemethylaties en acetylaties. EpiProfile kan echter worden aangepast om analyses uit te voeren van minder standaard aanpassingen en op basis van verschillende voorbeeldvoorbereidingsprotocollen door meer ervaren gebruikers. Let op: EpiProfile vereist een MATLAB-licentie om25 runs te hebben.
    1. Analyseer de verkregen RAW-gegevens met EpiProfile 2.0-software (PRO-PIC versie)25 (Table of Materials) en kwantificeer histonpeptiden door de opties te selecteren histone_normal, wanneer analyse wordt uitgevoerd zonder labels, en histone_SILAC, wanneer je de SUPER-SILAC spike-in gebruikt. Stel ndebug = 0.
    2. Voor elk histonpeptide (bijv. H3_3-8) bereken je de relatieve abundantie (%RA) van elke gemodificeerde peptidovorm (bijv. H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) door het geëxtraheerde ionenchromatogram (XIC), berekend door EpiProfile, te delen door de som van alle XIC's die voor dat peptide zijn berekend.
      OPMERKING: Optioneel kunnen XIC's die door EpiProfile zijn berekend worden gevalideerd door inspectie van MS-spectra en handmatige kwantificering van histonpeptiden met behulp van een speciale spectra-indeling zoals beschreven in18,26.
    3. Voor elke peptidoform bereken je de licht-zwaar (L/H) verhouding door de %RA van elk inheems, licht peptide te delen door de %RA van het overeenkomstige zware peptide afkomstig van de SUPER-SILAC-mix, die in elk monster is gespiked.
    4. Transformeer de L/H-verhoudingen naar een logaritmische schaal. Om significante verschillen in peptidoforme abundantie tussen monsters te benadrukken, kan statistische analyse worden uitgevoerd en kunnen de L/H-verhoudingen over alle monsters visueel worden weergegeven als heatmaps en verstrooiingsdiagrammen, zoals in Figuur 4.

Tabel 2: Lijst van de acquisitie-instellingen en van de algemene instellingen die worden gebruikt voor LC-MS/MS met het systeem dat in dit protocol wordt gebruikt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben histonextractie uitgevoerd uit versbevroren en OCT-bevroren borstkankermonsters en uit FFPE-meningeoommonsters volgens het hierboven genoemde protocol. Zoals geïllustreerd in Figuur 1A, hebben we voor bevroren monsters OCT verwijderd, wanneer aanwezig, en we hebben monsters gehomogeniseerd in een nuclei-isolatiebuffer met een mild detergent (0,1% Triton stap 1.1), waardoor kernisolatie mogelijk is. Vervolgens extraherden we histonen met toevoeging ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier beschreven methode biedt een eenvoudige en robuuste workflow om histonen efficiënt te isoleren uit klinische monsters die zijn opgeslagen als vers bevroren, OCT-bevroren en FFPE-biopsieën, voor het profileren van hun modificatielandschappen door middel van MS-analyse. Het daaropvolgende monstervoorbereidingsprotocol via SDS-PAGE-scheiding en PRO-PIC in-gel digestie met trypsine zorgt voor effectieve verwijdering van detergenten, zouten en andere MS-verontreinigingen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij erkennen chirurgen en clinici van het European Institute of Oncology en Istituto Neurologico Carlo Besta voor het uitvoeren van FF-, OCT-bevroren en FFPE-weefselbiopten. Wij danken Roberta Noberini voor de wetenschappelijke en methodologische discussie tijdens de manuscriptvoorbereiding en onze financiering: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (subsidienummer IG-2023-28767) en Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemische stoffen
Histolemon RS voor HistologieCarlo Erba4549122.5 L
Acetonitrile (ACN)Carlo Erba4123411L
Ammoniumbicarbonaat (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Ammoniumpersulfaat (APS)WDR1.012.010.500500 g
Aprotinine protease-remmerSigma Aldrich A11535 mg
Benzonase-nucleaseMerkE101425 KU
Bisacrylamide 30% 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
Buffer A 0,1% mierenzuur in ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Buffer B 0,1% mierenzuur / 80% acetonitrile in ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
C18-harsMerck66883-U47 mm diameter
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Dithiothreitol (DTT) WDR441496P25 g
EthanolCarlo Erba4146082.5 L
Leupeptine protease-remmerSigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N',N'-Tetramethyl ethyleendiamine (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
NuPAGE LDS-monsterbufferInvitrogenNP00074x
PBS - Fosfaat gebufferde zoutoplossing MicroGemTL1006500 mL
Fenylisocyanaat (PIC)Sigma Aldrich185353100 g
Fenylmethysulfonylfluoride (PMSF) protease-remmerSigma Aldrich P76261 g
Propionylzuuranhydride (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Recombinant Histon H3.1 HumanNew England BiolabsM25031 µg/µL
Sequencing-grade trypsinePromegaV5113100 ug
Natriumbutyraat (NaBut) histon deacetylase-remmerMerckB58875 g
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
TriethylammoniumbicarbonaatSigma AldrichT7408100 mL
Trifluorazijnzuur (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Triton X-100 detergentSigma-Aldrich X100RS5 g
Kits/ apparatuur/software
96-wells microplaatCorningPCR-96-FS-CNon-pyrogen, Rnase/Dnase-vrij
BalansKern19024
Centrifuge voor op tafelHareus Biofuge LabPico, 23396
Bioruptor sonicatie-apparaatDiagenode
Branson Digital Sonifier 250Emerson
Celzevener 100 µmFalcon352360
Concentrator plusEppendorf5305000509
Dounce homogenisator (bijv. Dounce, Wheaton...)Dounce, Wheaton1 mL weefselmolen
EASY-nLC 1200 vloeistofchromatografieThermo Fisher Scientific
EASY-Spray HPLC C18 kolomThermo Fisher ScientificES9022 µm, 100  Å, 75 µm x 25 cm
EpiProfile2.0 scripthttps://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Fiji softwarehttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
MaxQuant-zoekmachinehttps://maxquant.net/maxquant/
Pestel A (los)Dounce, Wheaton
Pestel B (strak)Dounce, Wheaton
Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS-systeemThermo Fisher Scientific
Roterend wielThermo Fisher Scientific11496548
SchaarKiato13010
SchaarThermo Fisher Scientific15207266
Sealing MatCorningAM-96-PCR-RDAutomatisch compatibel
Centrifuge met swing-out rotorBeckman coulterAllegra X-15R
Thermomixer compactEppendorf5350
VortexPBIVibromix
Xcalibur-softwareThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

HistonextractieHistonmodificatiesPosttranslationele ModificatiesChromatineorganisatieBiomarkerontdekkingVloeistofchromatografieFFPE weefsel

Gerelateerde artikelen