LEXY en LINuS optogenetica-tools en geautomatiseerde beeldanalyse gebruiken om de nucleocytoplasmatische transportdynamiek in levende cellen te kwantificeren

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe geautomatiseerde analyses van live celbeeldvormingsgegevens die zijn verkregen door het nucleocytoplasmatisch transport via optogenetische hulpmiddelen efficiënt kunnen worden opgezet en uitgevoerd.

Samenvatting

Nucleocytoplasmatisch transport (NCT) is essentieel voor het behoud van cellulaire homeostase en de verstoring ervan is betrokken bij verschillende ziekten, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen en amyotrofische laterale sclerose. Dit onderstreept de noodzaak om instrumenten te ontwikkelen om NCT te monitoren en te kwantificeren. Onder deze instrumenten maken de snelle en omkeerbare optogenetica-sondes, LEXY (licht-induceerbaar nucleair exportsysteem) en LINuS (licht-induceerbaar nucleair lokalisatiesignaal), het mogelijk om NCT-dynamiek in levende cellen te meten.

De originele publicaties beschrijven manuele segmentatie en kwantificering van het fluorescerende sondesignaal in de kern en het cytosol bij transfectie van LEXY- en LINuS-constructen in beeldvorming van levende cellen. Nochtans, beperken zowel de transfectie als de handsegmentatie het aantal cellen dat kan worden geanalyseerd en zijn aan onnauwkeurigheid toe te schrijven aan mogelijke gebruiker-afhankelijke fouten. Hoewel de hoge snelheid en omkeerbaarheid van optogenetica in principe een hoge gevoeligheid mogelijk zouden moeten maken bij het detecteren van veranderingen in de NCT-dynamiek, hangt dit af van de acquisitieparameters en de analyse van een voldoende aantal cellen.

Daarom hebben we lentivirale vectoren vastgesteld die LEXY en LINuS tot expressie brengen om stabiele cellijnen te creëren, live beeldvormingsmarkers en controlecondities getest, en een semi-geautomatiseerde beeldanalysepijplijn geïmplementeerd die de analyse van honderden cellen mogelijk maakt. Deze analysemethode maakt gebruik van de open access software FIJI, is toegankelijk voor beginners in de bio-informatica en vereist geen geavanceerde computerinstellingen. Hier bieden we een stapsgewijs protocol om LEXY op te zetten als een voorbeeld van deze optogenetische hulpmiddelen om de nucleaire export te monitoren, van de voorbereiding van de monsters tot het verwerven van levende celbeeldvorming en geautomatiseerde analyse, terwijl we laten zien hoe het protocol kan worden aangepast aan andere omstandigheden, controles of modellen in elk laboratorium. Alle plasmiden en cellijnen die in dit protocol worden gebruikt, zullen ter beschikking worden gesteld van de wetenschappelijke gemeenschap, waardoor de toegankelijkheid van de methode verder wordt vergroot.

Inleiding

Het belang van nucleocytoplasmatisch transport (NCT) voor het reguleren van belangrijke cellulaire routes en het handhaven van cellulaire homeostase is de afgelopen jaren goed bestudeerd¹. Als gevolg hiervan werden verschillende instrumenten gegenereerd om de dynamiek van de NCT^{te bestuderen 2,3,4}. Onder deze tools bieden LINuS⁵ en LEXY⁶ optogenetische sondes, respectievelijk gepubliceerd in 2014 en 2016, een krachtige manier om NCT in levende cellen te volgen. Deze tools, ontworpen om de induceerbare export (LEXY) of import (LINuS) van een fluorescerende reporter te volgen, zijn induceerbaar door blootstelling aan blauw licht en omkeerbaar.

In het kort maken deze twee kleine sondes gebruik van de eigenschappen van het LOV2-domein uit het eiwit fototropine-1 van de plant Avena sativa⁷. Bij afwezigheid van blauw licht wordt de Jα-helix uit het LOV2-domein gefotokooid en ingebed in de eiwitkern. Omdat de Jα-helix kan reageren op lichtprikkels, induceert verlichting door blauw licht een conformatieverandering en de daaropvolgende ontkoppeling van de Jα-helix van het LOV2-domein. De auteurs van LEXY en LINuS gebruikten deze lichtgevoeligheid om ofwel een Nuclear Localization Signal (NLS) of een Nuclear Export Signal (NES) te fuseren met de Jα-helix, voor respectievelijk LINuS en LEXY (Figuur 1). Het resulterende hulpmiddel is een sonde die bij blauw licht transloceert naar de kern (LINuS) of het cytosol (LEXY).

Om de sondes met fluorescerende beeldvorming te volgen, werd ook een mCherry fluorescerende reporter aan de constructen toegevoegd. Ten slotte werd een zwakke NES (voor LINuS) of NLS (voor LEXY) aan het systeem toegevoegd om ervoor te zorgen dat de sondes zich niet in hun uiteindelijke lokalisatie bevonden voordat blauw licht oplichtte, wat zou voorkomen dat LEXY of LINuS-translocatie tussen de kern en cytosol zou worden waargenomen.

Figuur 1: Weergave van LEXY en LINuS sondes. Beide sondes bestaan uit een mCherry-eiwit dat is gefuseerd met het lichtgevoelige LOV2-domein. Het verschil tussen de twee tools zit hem in de signaleringssequentie die verborgen is door de Jα-helix: een NES voor LEXY en een NLS voor LINuS. Beide sondes hebben ook een zwakke signaalsequentie om hun initiële lokalisatie te controleren: een zwakke NLS voor LEXY en een zwakke NES voor LINuS. De activering van de systemen door verlichting met blauw licht induceert dus ofwel hun export voor LEXY, ofwel hun import voor LINuS, waardoor gebruikers de nucleaire export of import kunnen volgen. Afkortingen: LEXY = light-inducible nuclear export system; LINuS = licht-induceerbaar nucleair lokalisatiesignaal; NLS = nucleair lokalisatiesignaal; Niet elders vermeld = nucleair exportsignaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De lokalisatie van mCherry-fluorescentie rapporteert de shuttle van LEXY- en LINuS-sondes tussen kernen en cytosol en kan daarom worden gevolgd in beeldvorming van levende cellen, waardoor gebruikers NCT kunnen volgen. LEXY en LINuS worden niet alleen gebruikt als eenvoudige sondes, maar kunnen ook worden ontworpen om de lokalisatie te controleren en interessante eiwitten te bestuderen, in vitro 5,6,8,9 of in vivo ^10,11.

De kwantificeringsmethode die in de publicaties van LEXY en LINuS wordt voorgesteld, toont de relatieve nucleaire intensiteit van de sondes. De voorgestelde analyse wordt handmatig uitgevoerd en is gebaseerd op de meting van een Region of Interest (ROI) in de kern en het cytosol. Hoewel deze methode een goede weergave geeft van het signaal van de sonde in de loop van de tijd, is het erg lang en vervelend, vooral wanneer experimenten en omstandigheden worden herhaald. Van belang is dat deze methode ook niet nauwkeurig is, aangezien slechts een klein deel van het ontworpen compartiment wordt weergegeven.

Hier stellen we een nieuw protocol voor LEXY en LINuS fluorescente signaal kwantificering. We hebben geautomatiseerde technieken geïmplementeerd, die de analyses vergemakkelijken en zorgen voor een grotere nauwkeurigheid. Dit zal het proces voor nieuwe gebruikers van deze tools vergemakkelijken en de doorvoer helpen verhogen. Ons kwantificeringsprotocol gebruikt slechts één interface, de open-source TrackMate^12-plug-in van FIJI. Om de betrouwbaarheid van de kwantificeringen te verbeteren, hebben we met name een live-beeldvormingscompatibele verrode DNA-marker gebruikt om segmentatie van de hele kern uit te voeren met StarDist¹³, een getraind convolutioneel neuraal netwerk, gecombineerd met het volgen en meten van het fluorescerende signaal van de sonde met TrackMate¹².

De verkregen gegevens kunnen vervolgens eenvoudig worden geëxporteerd naar de meegeleverde en kant-en-klare spreadsheet (aanvullende tabel S1) om de relatieve nucleaire intensiteit van elke geïdentificeerde kern te verkrijgen. Dit protocol legt ook uit hoe de verkregen waarden in een grafiek kunnen worden samengevoegd door de verkregen tijdverloopcurve aan te passen aan een mono-exponentieel model, zoals in Yoo en Mitchison¹⁴ en hoe de transportsnelheid kan worden berekend voor de verschillende geteste omstandigheden. Met dit protocol en de meegeleverde spreadsheet voor analyse kunnen gebruikers gemakkelijk beeldvormingsgegevens van levende cellen kwantificeren, zelfs met beperkte bio-informaticavaardigheden.

Protocol

OPMERKING: Het volgende protocol wordt beschreven voor het monitoren van nucleaire export met de sonde van LEXY. Details met betrekking tot instellingen die moeten worden aangepast voor LINuS worden gepresenteerd in sectie 5.

1. Celcultuur

OPMERKING: De procedure in dit hoofdstuk moet worden uitgevoerd in een kap van weefselkweekkwaliteit. De hieronder beschreven stappen zijn geoptimaliseerd voor NIH/3T3 muis fibroblast^15-cellijn , met behulp van DMEM (of fenol roodvrije DMEM indien geïndiceerd), aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine als medium (zie de materiaaltabel). Gebruikers kunnen de procedure echter aanpassen voor andere celtypen. Het protocol is geschikt voor getransfecteerde cellen of stabiele cellijnen. We raden echter aan om stabiele cellijnen te maken, zoals vermeld in de discussiesectie.

1. Bereid de coatingoplossing voor met 23 μg/ml collageen en 2 μg/ml fibronectine in steriel 1x PBS. Voeg 800 μl van de coatingoplossing toe aan elke schaal met levende beeldvorming (zie materiaaltabel) en bewaar deze 90 minuten in de broedmachine.
2. Was de coatingmix met steriel 1x PBS en zaai 60.000 cellen op de live imaging schotels in media, voor een acquisitie de volgende dag.
3. Indien nodig, transfecteer de cellen met het LEXY plasmide volgens de transfectiemethode die het beste past bij het gebruikte celtype. Om dit protocol te volgen, voert u een co-transfectie van de sonde uit met een lege vector om de efficiëntie te verhogen, in een verhouding van 1:5 voor LEXY:lege vector. Bescherm de cellen tegen licht in een donkere doos of met aluminiumfolie en laat ze een dag groeien.
4. Kleurt de cellen vóór de verwerving met een verrode DNA-marker die compatibel is met beeldvorming van levende cellen, in een fenolroodvrij medium, en zorg ervoor dat ze volledig beschermd zijn tegen licht tot de acquisitie.
   LET OP: In ons geval gebruiken we SiR-DNA¹⁶ op 1 μM, minimaal 1 uur geïncubeerd voor de acquisities.
5. Om te controleren voor export, gebruikt u de nucleaire exportremmer Leptomycine B¹⁷ bij 0,5 nM (milde exportremming) en 1 nM (sterke exportremming), aangebracht op de cellen 1 uur voor de acquisities.

2. Beeldvorming

OPMERKING: Acquisities kunnen worden gemaakt met een confocale microscoop die compatibel is met live imaging, die de mogelijkheid heeft om een patroon van gekozen acquisities en een pulserende laserverlichting van 458 nm te creëren. Onze beeldvorming werd uitgevoerd in het donker in een kamer van 37 °C (met 5% CO₂) van een confocale microscoop met resonantiescanning. De opstelling is geoptimaliseerd met het 20x-objectief, waardoor gelijktijdige beeldvorming van meerdere cellen in hetzelfde gezichtsveld mogelijk is. De beeldvormingssequentie bestaat uit drie fasen, zoals in figuur 2.

1. Stabiele fase
   1. Voer elke 15 s een acquisitie van mCherry (LEXY, 561 nm laser) en verrode (SiR-DNA, 633 nm laser) signalen uit en herhaal dit 10x, voor een totale duur van 150 s. Zorg ervoor dat er op dit punt geen bleking of translocatie van LEXY naar het cytosol wordt waargenomen.
      LET OP: Een verlichting van het systeem met blauw licht in dit stadium zou LEXY activeren, wat onmiddellijk de export naar het cytosol zou induceren.
2. Verlichtingsfase
   OPMERKING: Deze fase bestaat uit drie stappen, die 15x worden herhaald.
   1. Voer pulserende verlichting uit met blauw licht (458 nm laser), met pulsen van 36 ms die 150x worden herhaald, voor een totale duur van ~5 s.
   2. Voer één acquisitie uit van mCherry (LEXY, 561 nm laser) en verrood (SiR-DNA, 633 nm laser) fluorescerende signalen.
   3. Pauzeer 15 s.
3. Herstelfase
   1. Voer elke 15 s een acquisitie van mCherry (LEXY, 561 nm laser) en verrode (SiR-DNA, 633 nm laser) signalen uit, herhaal 25x, voor een totale duur van 375 s.
      OPMERKING: Deze stap is optioneel en kan worden verwijderd als gebruikers alleen de export van de sonde willen observeren en niet het herstel.

Figuur 2: Configuratie van de drie fasen van LEXY. Om de nucleaire export met LEXY te monitoren, moeten drie fasen worden ingesteld op de microscoopsoftware. Het bovenste deel geeft de configuratie aan die moet worden gebruikt voor LEXY's live cell imaging-acquisities. Deze configuratie bestaat uit een stabiele fase, om ervoor te zorgen dat het signaal stabiel is in de kern, een verlichtingsfase, om de translocatie van LEXY van de kern naar het cytosol te induceren, en een herstelfase, om te zien hoe LEXY terugkeert naar de kern. Het onderste deel van de figuur geeft de verwachte resultaten aan met live cell imaging. In rood geeft de mCherry de lokalisatie van LEXY aan. In grijs kleurt het SiR-DNA de kern van de cellen. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

3. Analyse voor LEXY

OPMERKING: De hele segmentatie- en trackinganalyse is gemaakt met behulp van FIJI, met TrackMate¹², een open-source Fiji-plug-in (vereiste versie beschreven in de Materiaaltabel).

1. Installeer FIJI en download vervolgens StarDist¹³ - en TrackMate-plug-ins. Als je de plug-ins wilt installeren, ga je naar Help | Bijwerken ... | Beheer updatesites en vink CSBDeep, StarDist en Trackmate-StarDist aan en klik vervolgens op Wijzigingen toepassen. Start Fiji opnieuw op.
2. Terwijl sommige microscopen elke acquisitiefase (Stable-Illumination-Recovery) samen kunnen nemen, slaan andere (bijv. de confocale microscoop waarnaar wordt verwezen) ze afzonderlijk op. Daarom is een extra stap, als u deze configuratie gebruikt, het samenvoegen van de fasen: open de afbeeldingen van de drie sequenties, voer de aaneenschakelingsfunctie uit om de drie time-lapse-fasen in één bestand samen te stellen: klik op Afbeelding | Stapels | Gereedschap | Aaneengeschakeld....
3. Selecteer de stabiele fase als Afbeelding1, de verlichtingsfase als Afbeelding2 en de herstelfase als Afbeelding3. Het resulterende beeld is een enkel beeld voor de time-lapse van de drie fasen, waarbij de kanalen mCherry (kanaal 1) en SiR-DNA (kanaal 2) zijn samengevoegd.
4. Bewaar de verkregen afbeelding voor de latere segmentatiestap en sla deze op: ga naar Bestand | Opslaan als | Tiff....
5. Splits het mCherry-kanaal alleen voor de volgende analyses: ga naar Afbeelding | Kleur | Kanalen splitsen en opslaan: ga naar Bestand | Opslaan als | Tiff....
6. Als u wilt controleren of er tijdens de acquisitie sprake is van bleken, voert u de opdracht Plot Z-axis Profile uit op het mCherry-kanaal: ga naar Afbeelding | Stapels | Plot Z-as profiel. Klik in de gegenereerde tabel op Gegevens | Kopieer de 1e gegevensset en plak deze in de kant-en-klare spreadsheet die bij dit protocol wordt geleverd (aanvullende tabel S1), onder de profielcel van de Z-as.
7. Teken een cirkelvormig interessegebied (ROI) van de gemiddelde grootte van een kern en sla deze op: ga naar Analyseren | Gereedschap | ROI Manager.... Voeg de ROI toe en sla deze op: ga naar Meer | Redden...
   OPMERKING: Dezelfde ROI moet worden gebruikt om de achtergrond te meten voor alle geanalyseerde omstandigheden.
8. Plaats de opgeslagen ROI in een gebied zonder cellen gedurende de hele time-lapse en meet de gemiddelde intensiteit binnen deze ROI met de ROI-interfacefunctie. Zorg er eerst voor dat de gemiddelde grijswaarde is aangevinkt door op Analyseren | Stel afmetingen in. Klik vervolgens op Meer | Multi Maatregel. Vink Meet alle 50 plakjes en één rauw per plak aan en klik op ok.
9. Kopieer en plak alle waarden die worden weergegeven in de meegeleverde spreadsheet (aanvullende tabel S1), onder de cel 'ROI-achtergrond'.
10. Sluit in Fiji de afbeelding met alleen het mCherry-kanaal en selecteer de eerder opgeslagen afbeelding met de samengevoegde mCherry- en SiR-DNA-kanalen.
11. Open de TrackMate-plug-in: ga naar Plug-ins | Volgen | TrackMate.
12. Controleer of het aantal tijdstippen correct is (0 tot 49 als de voorgestelde fasen zijn gevolgd) en klik op Volgende.
13. Selecteer de StarDist-detector en klik op Volgende.
14. Selecteer kanaal 2 (SiR-DNA) om de kernen te segmenteren en klik op Volgende. Wacht een paar seconden totdat het segmentatieproces is voltooid. Inspecteer visueel of de verkregen segmentatie overeenkomt met de grens van de kernen en klik op Volgende (Figuur 3). In geval van onnauwkeurige segmentatie, noteer dan de overeenkomstige nucleus-identifier (SpotID) om deze uit te sluiten van verdere analyse in stap 3.26.
15. Verlaat de standaardparameters en klik op Volgende in het eerste venster voor het instellen van de drempelwaarde . Dit venster geeft het aantal gesegmenteerde vlekken (kernen) onder de 50 tijdstippen.
16. Filters instellen op plekken: filters maken en instellen:
    1. Maak twee filters met Gemiddelde intensiteit ch1 als parameter om kernen te verwijderen met een te intens of te zwak signaal, die de analyses zouden kunnen vertekenen: één filter om waarden boven de gedefinieerde drempel te selecteren en de andere om de waarden onder de drempel te selecteren. Definieer de waarde om alleen het zeer lage of verzadigde signaal te verwijderen.
       OPMERKING: Deze filters zijn mogelijk niet nodig als stabiele cellijnen worden gebruikt. Noteer deze waarden, aangezien ze voor alle voorwaarden opnieuw moeten worden toegepast.
    2. Maak twee filters Gebied om ongewenste objecten (puin, stervende of delende cellen) uit analyses te verwijderen: één filter om waarden boven de gedefinieerde drempel te selecteren en de andere om de waarden onder de drempel te selecteren. Klik op Volgende.
       OPMERKING: Pas deze waarden opnieuw toe op alle voorwaarden.
17. Selecteer een tracker: kies Simple LAP tracker en klik op Next.
18. Selecteer de parameters voor de tracking. Pas de maximale afstand voor koppelen aan (hier 30 μm) - de maximale afstand die is toegestaan om te koppelen aan objecten tussen frames. Gebruik de maximale afstand voor het sluiten van de opening (hier 15 μm) en de maximale frameafstand voor het sluiten van de opening (hier 3) om te bepalen hoeveel plekken van een enkele baan kunnen worden weggelaten zonder dezelfde baan uit te sluiten. Klik op Volgende (Figuur 3).
    OPMERKING: Deze voorgestelde parameters zijn geoptimaliseerd voor onze opstelling en ons cellulaire model met behulp van een trial-and-error-benadering en moeten mogelijk experimenteel worden aangepast.
    De maximale afstand van de koppeling moet worden aangepast om te voorkomen dat de ene kern naar de andere verkeerd volgt, vooral als de cellen veel bewegen.
19. Klik na berekeningen op Volgende en stel filters in op tracks. Om alleen kernen te selecteren die gedurende het hele tijdsverloop zijn gevolgd (50 tijdstippen met de voorgestelde sequentie), selecteert u het hoogste aantal plekken in de track (plaats de cursor op meer dan 49 voor de voorgestelde sequentie). Klik op Volgende.
    OPMERKING: Dit zal de analyse vergemakkelijken, maar is alleen mogelijk als er voldoende kernen zijn gevolgd voor het hele tijdsverloop, zo niet: zie discussie.
20. Weergave-opties: vink Plaatsnamen weergeven aan om elke kern in verdere analyses te kunnen traceren. Pas de weergegeven functies aan volgens de voorkeuren van de gebruiker.
21. Klik onderaan de pagina op Tracks | Exporteer naar CSV om de tabel met alle metingen op te slaan. Sluit de tabel en klik op Volgende.
22. Optioneel kunt u de baankenmerken uitzetten met T (tijd) als de X-as en de gemiddelde intensiteit van de 1l voor de Y-as. Klik op Plot-functies. Sluit de grafiek en klik op Volgende.
    OPMERKING: Dit geeft de gebruikers een idee van de algemene tendens van de export. Op dit moment is het niet genormaliseerd naar de achtergrond en initiële intensiteit.
23. Klik op Overlay vastleggen als actie en Uitvoeren | Oké. Het gegenereerde beeld zal worden gebruikt om de gekwantificeerde kernen te identificeren. Opslaan: ga naar Bestand | Opslaan als | Tiff....
24. Importeer in een spreadsheetbestand het CSV-bestand dat is verkregen met TrackMate: Klik op het tabblad Gegevens in de groep Gegevens ophalen en transformeren op Van tekst/CSV en Importeren.
25. Selecteer de vier volgende kolommen door op de bijbehorende letter te klikken en kopieer en plak ze bovenaan de meegeleverde spreadsheet (aanvullende tabel S1), kolommen A tot D, met als achtergrond: Spot ID (B), Track ID (C), Frame (I), Gemiddelde intensiteit ch1 (M).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat het begin van de geplakte maten begint bij rij 6 van aanvullende tabel S1. Als dit niet het geval is, kunnen de metingen van een of meer cellen worden verschoven en dus onjuist zijn. Raadpleeg de spreadsheet van aanvullende tabel S2 voor een voorbeeld van de verwachte dispositie.
26. Sorteer de resultaten eerst alfabetisch op TrackID (individuele kern) door op de pijl in cel B5 te klikken en Frame (tijdstip) door op de pijl in cel C5 te klikken.
27. Om achtergrondruis te verwijderen, trekt u de waarden die zijn verkregen in stap 3.8 af van elke waarde die is verkregen in Gemiddelde intensiteit ch1 (vooraf berekend in de meegeleverde spreadsheet, zie aanvullende tabel S1).
28. Om het signaal van LEXY te normaliseren, berekent u de gemiddelde intensiteit van het mCherry fluorescerende signaal in de stabiele fase (frames 0 tot 9). Deel vervolgens alle resultaten verkregen in Gemiddelde intensiteit ch1 door de gemiddelde intensiteit van de stabiele fase (vooraf berekend in de meegeleverde spreadsheet, zie Aanvullende Tabel S1).
    OPMERKING: Het verkregen getal is de gemiddelde nucleaire fluorescerende intensiteit van LEXY. Alle maten worden al weergegeven door kernen uit kolom L en kunnen in een grafiek worden uitgezet.

Figuur 3: TrackMate-analyse met behulp van FIJI. Bovenaan schematische weergave van de TrackMate-analyses, onderaan afbeeldingen verkregen uit de FIJI-analyses. De eerste voorstelling links toont de niet-gesegmenteerde SiR-DNA-kleuring, een marker van de kern, in grijs. Het tweede paneel vertegenwoordigt de automatische segmentatie die door Stardist wordt uitgevoerd met het SiR-DNA-kanaal. De kernen worden gekleurd volgens de intensiteit van het mCherry-kanaal, om de visualisatie en de laatste stap te vergemakkelijken. Het derde paneel toont de sporen die zijn verkregen door SiR-DNA-kleuring te volgen in de tijdpunten van de hele live celbeeldvormingssequentie. Het laatste paneel aan de rechterkant toont het fluorescerende signaal van LEXY, in rood, in het gebied dat wordt gedefinieerd door de segmentatie, die voor elk tijdstip wordt gemeten. Schaalbalk = 50 μm Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Vervoerstarief, statistieken en cijfers

1. Zet de grafiek van de relatieve nucleaire intensiteit uit.
   1. Open GraphPadPrism en maak een blad: klik op Gegevens invoeren of importeren in een nieuwe tabel en selecteer in de opties verstreken tijden voor X en het maximale aantal gesegmenteerde kernen voor de replicatiewaarden in naast elkaar geplaatste subkolommen voor Y. Klik op Aanmaken en plak de verkregen gegevens in de tabel.
   2. Voor de X-waarden (tijd), als de parameters van acquisities zijn behouden zoals voorgesteld, kopieer en plak dan de kolom onder 'tijd' in de meegeleverde spreadsheet. Pas anders de waarden aan volgens de gebruikte parameters.
   3. Om de grafiek van de relatieve nucleaire intensiteit te maken, gaat u naar de sectie Grafieken. Selecteer XY als de grafiekfamilie en Punten en verbindingslijn met foutbalken als het grafiektype.
   4. Selecteer in het gedeelte Plot de optie Gemiddelde, Fout en SEM en klik op OK om de grafieken te bekijken. Wijzig de schalen en visuals volgens de gekozen parameters.
2. Pas de relatieve nucleaire intensiteit aan op een mono-exponentieel model.
   1. Klik in de sectie Gegevenstabel op Nieuwe gegevenstabel.
      1. Selecteer Voer X-waarden in als X en Voer in en teken een enkele Y-waarde voor elk punt als Y en klik op Maken.
      2. Vermeld in de X-kolom de tijden alleen in decimalen voor de stal- en verlichtingsfasen; als de voorgestelde parameters van acquisities zijn behouden, kopieert en plakt u de kolom onder 'decimale tijd' in de meegeleverde spreadsheet, aanvullende tabel S1.
      3. Plak de verkregen waarden als relatieve nucleaire intensiteit in de tabel, alleen voor de stabiele en verlichtingsfasen.
      4. Selecteer in de sectie Resultaten de volgende analyse: XY-analyses | Exponentieel | Niet-lineaire regressie (Curve Fit) en klik op OK.
      5. Selecteer in de parameters Plateau gevolgd door één faseverval als Model, en selecteer in de beperkingsparameters een constante gelijk aan 2,25 als X0 (de starttijd van de verlichting), een constante gelijk aan 1 als Y0 (relatieve nucleaire intensiteit aan het begin van de verlichting), een constante gelijk aan 0 voor het plateau (de waarden waarnaar de relatieve nucleaire intensiteit moet leunen), en geven aan dat K (het exportpercentage) groter moet zijn dan 0. Laat de andere parameters op standaard staan. Klik op OK.
      6. In de sectie Resultaten geeft de K-rij alle exportsnelheden aan voor de kernen van de geteste toestand.
      7. Herhaal indien nodig de stappen 4.2.1 tot 4.2.1.5 voor de andere omstandigheden.
3. Maak de grafiek met het exportpercentage.
   1. Maak een nieuwe tabel: selecteer Voer X-waarden in als X en Voer in en teken een enkele Y-waarde voor elk punt als Y en klik op maken.
   2. Plak en transponeer voor elke voorwaarde (in kolommen) de K-waarden die in de vorige stap zijn verkregen.
   3. Als u de grafiek van de exportsnelheid wilt maken, gaat u naar de sectie Grafieken , selecteert u kolom als grafiekfamilie en selecteert u in de sectie Doos en viool de optie Vioolplot als grafiektype, met Vioolplot. Toon alle punten als plot. Klik op OK om de grafiek te zien. Pas indien nodig de manier aan om de gegevens weer te geven.
   4. Om een statistische test voor de exportkoers uit te voeren, voert u een tweezijdige Welch's t-test uit, zoals beschreven in Yoo en Mitchison¹⁴, door de volgende stappen te volgen:
      1. Klik in de tabel met de exportkoersen van alle voorwaarden op Analyseren | Groepsvergelijking | T-Test (en niet-parametrische tests), selecteer de te testen voorwaarden en klik op OK. Vink Unpaired aan, Ja gebruik parametrische test en Unpaired t-test met de correctie van Welch. Ga niet uit van gelijke SD's en klik op OK.
   5. Bekijk de resultaten van de analyse in de tabel van de sectie Resultaten en rapporteer indien nodig over de grafiek met het exportpercentage.

5. Aanpassingen voor LINuS

OPMERKING: Het hierboven beschreven protocol kan eenvoudig worden aangepast om de invoer van kernwapens met LINuS te controleren door de volgende wijzigingen toe te passen.

1. Celcultuur
   1. In plaats van leptomycine B in stap 1.5, gebruik importazol¹⁸ als nucleaire remmer, in een concentratie van 10 μM gedurende 1 uur vóór de acquisitie.
2. Beeldvorming
   1. Om een optimale import van het systeem te hebben, vervangt u de 150 herhalingen van 36 ms verlichtingspulsen door de 458 nm-laser in stap 2.2.1 door 250 herhalingen voor een totale duur van ~9 s.
      OPMERKING: de timing van de sequentie kan afhankelijk zijn van het celtype en de parameters voor beide sondes moeten mogelijk worden aangepast om optimaal te zijn, aangezien de systemen afhankelijk zijn van de herkenning van NLS en NES, die celtypespecifiek zijn^19,20.
3. Vervoerstarief, statistieken en cijfers
   1. In plaats van een curve aan een plateau aan te passen, gevolgd door één faseverval in stap 4.2.1.5, selecteert u het plateau gevolgd door één fase-associatieanalyse .
   2. Beperk X0 tot 2,25, Y0 tot 1 en K (het importpercentage in het geval van LINuS) groter dan 0.
      LET OP: De analyses van LINuS met TrackMate zijn identiek aan die van LEXY. De relatieve nucleaire intensiteit is nog steeds de gemeten en geanalyseerde waarde, maar in plaats van een afname waar te nemen als gevolg van de export van de sonde, zou een verrijking van het fluorescerende signaal in de kern na verlichting met blauw licht moeten worden waargenomen.

Resultaten

Het bovengenoemde protocol moet de gebruikers in staat stellen de lokalisatie en translocatie van de sonde te visualiseren tijdens de acquisitie in live celbeeldvorming. Een voorbeeld van de verwachte beelden die zijn verkregen om de nucleaire export met LEXY te visualiseren, wordt weergegeven in figuur 4. Een snelle afname van het signaal van de kern en een verrijking van het cytosol moet worden waargenomen na een paar rondes van blauw licht. Een progressief herstel van het signaal van de sonde kan zichtbaar zijn na het stoppen van de verlichtingscycli. Om het systeem te besturen, bevestigt leptomycine B, een exportremmer, dat een verandering in de export kan worden gevisualiseerd met de analyses, omdat het voorkomt dat LEXY wordt geëxporteerd bij blauw licht (Figuur 4).

Figuur 4: Visualisatie van het signaal van LEXY in de tijd. Vastleggen van representatieve tijdstippen van de stal-, verlichtings- en herstelfasen, verkregen met live celbeeldvorming. De methanolconditie vertegenwoordigt de controleconditie. Bij pulserende verlichting met blauw licht, in rood, wordt het mCherry fluorescerende signaal, dat de locatie van LEXY weergeeft, verplaatst van de kern naar het cytosol. Na het stoppen van de verlichting wordt het signaal teruggevonden in de kern. Behandeling met de exportremmer leptomycine B bij 1 nM of 0,5 nM toont de afwezigheid of afname van de export van LEXY aan wanneer de export wordt geblokkeerd. Schaalbalk = 30 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Wat de analyses betreft, moeten de waarden van de relatieve nucleaire intensiteitscurve tijdens de stabiele fase rond de 1 liggen, maar na activering van blauw licht zouden ze een langzame afname moeten vertonen tot het bereiken van een plateau aan het einde van de verlichtingsfase (Figuur 5A). Als de afname te snel of te langzaam is, kunnen acquisitieparameters worden geoptimaliseerd (zie discussie). Behandeling met leptomycine B in voldoende concentraties kan ook bevestigen dat de analyses en techniek gevoelig genoeg zijn om aan te tonen dat de nucleaire export volledig is geblokkeerd, waarbij de relatieve nucleaire intensiteitswaarden stabiel zijn op ongeveer 1 voor het hele experiment. Intermediaire leptomycine B-concentraties zouden echter een milde nucleaire export moeten vertonen (figuur 5A). Deze visuele waarnemingen moeten kwantitatief worden bevestigd met de verkrijging van de uitvoerkoers (figuur 5B).

Figuur 5: Verwachte relatieve nucleaire intensiteit van LEXY en transportsnelheid. (A) De grafiek geeft de relatieve nucleaire intensiteit van het fluorescerende signaal van LEXY in de loop van de tijd weer, genormaliseerd naar de gemiddelde mCherry-intensiteit van de stabiele fase. De relatieve nucleaire intensiteit van de methanol (controle, rood) neemt na bestraling met de helft af, in tegenstelling tot de cellen die worden behandeld met de exportremmer leptomycine B, bij een concentratie van 0,5 nM (lichtblauw) of 1 nM (donkerblauw). (B) Exportsnelheid van de controle- en leptomycine B-condities, verkregen door de curve aan te passen aan een mono-exponentieel model. De waarden die worden verkregen wanneer de export wordt geblokkeerd door leptomycine B zijn aanzienlijk lager dan de controleconditie. N = 18 cellen voor methanol (rood), 19 cellen voor leptomycine B 0,5 nM (lichtblauw) en 15 cellen voor leptomycine B 1 nM (donkerblauw). P-waarden werden berekend door een tweezijdige Welch's t-test. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel S1: Spreadsheet met vooraf gedefinieerde berekeningen. Deze spreadsheet is bedoeld om de analyse te vergemakkelijken. De intensiteitswaarden die met TrackMate zijn verkregen, kunnen rechtstreeks worden gekopieerd en in de spreadsheet worden geplakt om de genormaliseerde relatieve nucleaire intensiteitswaarden te verkrijgen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Voorbeeld van de verwachte resultaten voor een controleconditie van de LEXY-analyse. De spreadsheet geeft een voorbeeld van de verkregen waarden voor een controleconditie van de stabiele cellijn van LEXY. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Zoals vermeld in het protocol, verbetert het creëren van stabiele cellijnen de kwaliteit van de analyses aanzienlijk. Ten eerste verhoogt het feit dat 100% van de cellen de sondes tot expressie brengt, het aantal kernen dat wordt gevolgd en geanalyseerd, wat de robuustheid van de analyses versterkt. Ten tweede, vermindert het celdood die door de overexpressie van de sondes en de giftigheid van de gebruikte transfectiereagentia wordt veroorzaakt. En ten slotte vermindert het de sterke heterogeniteit van fluorescerende signalen tussen de cellen. Deze parameter is van belang omdat een verzadigd signaal geen goede detectie van de verandering van intensiteit na verlichting mogelijk maakt. Dezelfde conclusie geldt voor zwakke signalen, die de kwantificering van verschillen kunnen verbleken of niet mogelijk maken. Daarom raden we aan om eerst de sondes te testen door transfectie om ervoor te zorgen dat ze goed werken, de aanwinstparameters in te stellen en vervolgens snel stabiele cellijnen te creëren. We hebben lentivirusvectoren gemaakt voor zowel LEXY- als LINuS-sondes, die op verzoek beschikbaar zijn om te delen, evenals de NIH/3T3 LEXY- of LINuS-stabiele lijnen die met deze lentivirussen zijn gemaakt.

Als de sondes worden getransfecteerd of als de cellen schaars zijn, zullen de voorgestelde parameters waarschijnlijk het aantal gedetecteerde sporen verminderen en zullen de analyses minder robuust zijn. Als dit het geval is, kunnen de gebruikers toleranter zijn met de spots die in de tracking zijn weggelaten door het filter Aantal spots in tracks te verminderen (we raden aan om ten minste 45 van de 50 spots te behouden). Let op: als dit filter wordt verlaagd, moet het meegeleverde Excel-bestand (aanvullende tabel S1) handmatig worden aangepast: de waarden die uit de geïmporteerde CSV zijn geplakt, houden immers geen rekening met de hiaten. De gebruiker moet uitzoeken waar de ontbrekende plekken zijn met het TrackID-nummer en deze correleren met het kernnummer, wat meestal een paar kopieer-plakrondes kost.

Een cruciale parameter om het succes van het experiment te garanderen, is om de cellen in het ongewisse te houden. Aangezien de sondes reageren op blauw licht, moeten gebruikers ervoor zorgen dat de cellen ten minste 30 minuten in het donker worden getransporteerd voordat ze worden verkregen. Een kleine gesloten doos of het gebruik van aluminium om de schaal af te dekken is voldoende. Evenzo is het noodzakelijk om heel voorzichtig te zijn om het mCherry-licht alleen te gebruiken om naar de cellen bij de microscoop te zoeken, aangezien verlichting met blauw licht de cellen activeert. Als een eventuele verlichting onder de microscoop plaatsvindt, zoek dan naar een ander ver veld voor de acquisitie. Het uitzetten van het profiel van de Z-as in stap 3.6 zal helpen om te weten of de cellen werden beïnvloed door een verlichting, of de curve afneemt in plaats van een plateau te zijn.

De beeldvormingssequentie is opgezet om uit drie fasen te bestaan. Ten eerste de stabiele fase, om te beoordelen op mogelijke bleking, maar ook om ervoor te zorgen dat de lokalisatie van LEXY stabiel is zonder activering (1). Ten tweede, de activeringsfase, bestaande uit rondes van pulserende blauwlichtverlichting, om de translocatie van LEXY van de kern naar het cytosol te induceren (2). Ten slotte de optionele herstelfase, waarin het signaal geleidelijk terugkeert naar zijn oorspronkelijke locatie in de kern (3).

De volgorde die voor acquisities wordt beschreven, kan celtypespecifiek zijn ^19,20. Voor het eerste experiment moet de gebruiker het laservermogen en de timing testen en aanpassen om te zien hoe het systeem geleidelijk transloceert tussen de kern en het cytosol. Van belang is dat een te sterke laserkracht, omdat een te korte pauze, het zien van een progressieve translocatie kan verhinderen, maar in plaats daarvan een brute daling/verrijking (afhankelijk van de gebruikte sonde) van de mCherry-intensiteit na verlichting.

Als de optimalisatie van de sequentie het probleem niet oplost, is het waarschijnlijk dat de NES en/of NLS niet geschikt zijn voor het gebruikte celtype. Gebruikers kunnen artikel⁸ van de LINuS-methode raadplegen om de sondes te ontwerpen en aan te passen. Gebruikers kunnen dit artikel ook raadplegen voor het in beeld brengen van LINuS met een epifluorescentiemicroscoop.

De segmentatie van kernen is een cruciale stap van de analyse. Een robuuste en betrouwbare nucleaire marker moet worden gebruikt voor beeldvorming van levende cellen van de sondes. Omdat verlichting met blauw licht de translocatie van de sonde activeert en omdat de sondes worden gecontroleerd met mCherry fluorescerend eiwit, moet deze marker zichtbaar zijn in het verrode spectrum of dichtbij. In ons geval gebruiken we SiR-DNA dat de cellen kleurt tijdens 1 tot ~24 uur incubatie, maar het gebruik van SPY-DNA 650 is ook een optie (zie Materiaaltabel voor referenties).

Ten slotte, als de segmentatie met StarDist in combinatie met de gefilterde tracking van TrackMate zijn efficiëntie bewijst, is het belangrijk op te merken dat de gebruiker de resultaten van de segmentatie en de kwantificering altijd visueel moet controleren. Een delende of stervende cel kan worden opgenomen in de kwantificering, terwijl dat niet zou moeten. Om de risico's van analyse van dergelijke gebeurtenissen te verminderen, kent het meegeleverde Excel-blad een kleurcode toe aan de relatieve nucleaire intensiteit (blauw = lage waarden, rood = hoge waarden). Door de kleuren te inspecteren voordat de waarden in GraphPad Prism worden uitgezet, zou de gebruiker ongebruikelijke waarden moeten kunnen opmerken. De relatieve nucleaire intensiteiten van LEXY moeten bijvoorbeeld variëren van hoog (rood, sterke hoeveelheden van de sonde in de kernen) tijdens de stabiele fase tot laag (blauw, verminderde hoeveelheden van de sonde in de kernen) aan het einde van de verlichtingsfase, alvorens terug te keren naar hoge waarden (rood), in de herstelfase (zoals weergegeven in de aanvullende tabel S2).

Dit protocol biedt verschillende voordelen ten opzichte van eerder voorgestelde methoden ^5,6. De semi-automatische pijplijn vergemakkelijkt de analyse van LEXY en LINuS nucleocytoplasmatisch transport en biedt meer nauwkeurigheid dan eerder voorgestelde handmatige kwantificering ^5,6. Door gebruik te maken van ons protocol kunnen beginners in het veld efficiënte analyses uitvoeren, maar ook een nieuw hulpmiddel bieden voor ervaren gebruikers, die slechts één open access-interface nodig hebben om semi-geautomatiseerde analyses van het nucleocytoplasmatisch transport uit te voeren.

Deze methode kan worden gebruikt voor andere toepassingen dan de studie van de globale nucleocytoplasmatische transportsnelheid in NIH3T3-cellijnen. Met een paar optimalisatiestappen kan het inderdaad worden aangepast om de transportsnelheid van de sonde in verschillende celtypen of levende dieren te bestuderen⁸. Bovendien is het ook mogelijk om de transportsnelheid of de stroomafwaartse effecten van de door licht geïnduceerde translocatie in of uit de kern te bestuderen door een eiwit dat van belang is voor LEXY of LINuS. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een eiwit in het cytoplasma af te zonderen met LEXY, of om de lokalisatie ervan in de kern te forceren met LINuS 5,6,21,22,23. Ten slotte kunnen de beschreven analyses ook worden uitgebreid naar meer toepassingen dan LEXY en LINuS, om elk signaal te volgen dat transloceert tussen subcellulaire compartimenten die kunnen worden gesegmenteerd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Collagen	Sigma-Aldrich	08-115
Confocal microscope	LEICA	SP8
DMEM	Gibco	31966021
Excel	Microsoft
FBS	Sigma-Aldrich	F7524
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141
FIJI software	FIJI		ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Fluorodishes	Dutscher	FD3510-100	Alternatief: Attofluor chamber (Invitrogen #A7816)
GraphPad Prism 10.4.1	GraphPad Software, Inc.
Importazole	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomycin B	Sigma-Aldrich	L2913
LEXY plasmid	Addgene	72655	pDN122
LINuS Plasmid	Addgene	61347	pDN77
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Phenol-red free DMEM	Gibco	21063-029
SiR-DNA	Spirochrome	SC007	Alternatief: SPY-DNA650 (Spirochrome #SC501)
Stardist 2D plugin	StarDist		StarDist_0.3.0
TrackMate plugin	TrackMate		TrackMate-7.14.0