Methodenartikel

Methodologie voor de studie van leren en geheugen bij jonge ratten met behulp van sevofluraan-anesthesie om de expressie van p-CREB en c-fos in de hippocampus te beoordelen

DOI:

10.3791/68591

⸱

19 september 2025

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie onderzoekt hoe sevofluraan het geheugenbehoud schaadt en de expressie van p-CREB en c-fos in hippocampale neuronen vermindert via de NMDAR/p-CREB/c-fos-route bij jonge ratten. De resultaten tonen aan dat sevofluraan kortetermijngeheugentekorten veroorzaakt en synaptische plasticiteitsmarkers downreguleert, met effecten die na 3 dagen omkeerbaar zijn, onafhankelijk van de doseringsfrequentie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestuderen van cognitieve stoornissen tijdens de ontwikkeling van de hersenen staat voor uitdagingen vanwege de dynamische aard van neurologische ontwikkeling, methodologische beperkingen en contextuele barrières. Deze studie onderzocht een geïntegreerde methodologische benadering om cognitieve stoornissen in de zich ontwikkelende hersenen veroorzaakt door sevofluraan te bestuderen op basis van geheugen en p-CREB- en c-fos-expressie in hippocampale neuronen via de NMDAR/p-CREB/c-fos-signaleringsroute bij jonge ratten. Vierenzestig 21 dagen oude SD-mannetjesratten (lichaamsgewicht <80 g) werden verdeeld in vijf groepen: normaal (n=8), 60% O2 (n=16), schijntraining (n=8), enkelvoudige dosis sevofluraan (n=16) en meervoudige dosis sevofluraan (n=16). De twee sevofluraangroepen werden 1 dag (groepen sev1a en sev1b) en 30 dagen (groepen sev30a en sev30b) na de training (n=8/subgroep) onderverdeeld in offerande; Alle andere ratten werden 1 uur na de training geofferd. De Y-doolhoftest werd gebruikt om leren en geheugenbehoud te evalueren. Immunohistochemie werd gebruikt om het aantal p-CREB- en c-fos-positieve neuronen in de hippocampusmonsters te bepalen. Vergeleken met de 60% O2-groep (geheugenbehoud van 86,33% ± 17,52%), vertoonde het geheugen van ratten in de sev1a- en sev1b-groepen een significante afname (sev1a: 44,29% ± 11,26%; sev1b: 62,42% ± 7,27%; alle P<0,05), terwijl de sev1b- en sev30b-groepen geen significante verschillen vertoonden (sev30a: 84,41% ± 14,15%; sev30b: 85,21% ± 11,61%; alle P>0,05). Vergeleken met de 60% O2-groep (c-fos: 92,83 ± 7,88; p-CREB: 72,22 ± 8,89) nam de expressie van p-CREB en c-fos in hippocampale neuronen af in de sev1a-groep (c-fos: 23,13 ± 3,28; p-CREB: 22,88 ± 5,18) en de sev30-groep (c-fos: 23,22 ± 3,13; p-CREB: 25,58 ± 2,26) (alle P<0,05), terwijl de sev30a- en sev30b-groepen geen significante verschillen vertoonden (alle P>0,05). Sevofluraan heeft op korte termijn een negatief stimulerend effect op het geheugenbehoud van jonge ratten zonder een impact op basis van doseringsfrequentie. Sevofluraan vermindert de expressie van p-CREB en c-fos in hippocampale neuronen van jonge ratten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bestuderen van cognitieve stoornissen tijdens de ontwikkeling van de hersenen staat voor grote uitdagingen vanwege de dynamische aard van neurologische ontwikkeling, methodologische beperkingen en contextuele barrières. De ontwikkeling van de hersenen omvat snelle, niet-lineaire veranderingen, wat de identificatie van stoornissen tijdens kritieke vensters 1,2 bemoeilijkt. In omgevingen met weinig middelen belemmeren barrières zoals geletterdheid van verzorgers, taalkundige diversiteit en beperkte toegang tot gespecialiseerde hulpmiddelen (bijv. MRI) vroege screening1. Individuele variabiliteit in hersenrijping maakt het moeilijk om pathologische afwijkingen te onderscheiden van typische ontwikkeling 2,3. Aandoeningen zoals het syndroom van Down vertonen een veranderde corticale ontwikkeling, maar kleine steekproefgroottes en schaarse histologische gegevens beperken mechanistische inzichten4. Neurologische ontwikkelingsstoornissen (bijv. ASS, ADHD) komen vaak samen voor met angst of depressie, waardoor cognitieve beoordelingen worden verstoord5. Ernstige communicatietekorten in sommige populaties beperken het gebruik van gestandaardiseerde tests6. Die kenmerken leiden tot verschillende problemen met de onderzoeksopzet. Inderdaad, de meeste studies gebruiken cross-sectionele ontwerpen, waarbij het niet lukt om binnen individuele verandering in de loop van de tijd te modelleren. Er wordt te veel vertrouwd op westerse, goed opgeleide bevolkingsgroepen ("WEIRD"-steekproeven)7. Onderzoek naar het syndroom van Down lijdt aan kleine postmortale hersenmonsters en ontoereikende controles op dezelfde leeftijd4. Ecologische momentane beoordelingsinstrumenten hebben moeite om rekening te houden met contextuele variabelen die van invloed zijn op de dagelijkse cognitieve prestaties5.

De belangrijkste functies in het dieren- en menselijk brein zijn leren en geheugen, die centraal staan in de menselijke ontwikkeling en het leven in het algemeen8. De hersenen van zuigelingen bevinden zich in de ontwikkelingsfase en zijn kwetsbaar voor externe factoren zoals medicijnen en anesthesie 9,10. De schade die door anesthetica wordt veroorzaakt aan de geheugenfunctie van baby's is een cruciaal klinisch onderzoeksonderwerp en kan zelfs optimale behandelingen voor pediatrische patiënten vertragen vanwege het onvermogen om anesthesie uit te voeren11. Anesthesiegerelateerde cognitieve disfuncties (of postoperatieve cognitieve disfunctie, POCD) kunnen op lange termijn gevolgen hebben voor zuigelingen12 jaar. Inhalatie van sevofluraan kan de geheugenfuncties bij zuigelingenbeïnvloeden 13,14 jaar, maar de traditionele anesthesiologie is van mening dat hersenbeschadiging bij zuigelingen voornamelijk wordt veroorzaakt door hersenhypoxie tijdens anesthesie, vooral bij algemene anesthesie10. Daarom, zolang er geen kortdurende of langdurige hypoxie in de hersenen is, zou het risico op letsel aan het centrale zenuwstelsel bij zuigelingen moeten worden verminderd11. Toch blijft het begrip van POCD suboptimaal. Baby's die een operatie nodig hebben, hebben anesthesie nodig, en een betere kennis van de betrokken routes kan helpen bij het ontwerpen van anesthesiestrategieën die het risico op POCD minimaliseren.

Uit een onderzoek onder oudere volwassen patiënten die niet-cardiale operaties ondergingen, bleek dat bijna 25% van de patiënten binnen 1 week na de operatie POCD ervoer en dat het aandeel na 3 maanden daalde tot onder de 10%, terwijl de controlegroep POCD-percentages van 3,4% en 2,8% vertoonde15. De studie gaf ook aan dat de meeste POCD-gevallen reversibel waren, waarbij slechts een klein aantal patiënten langdurige of permanente POCD15 ervoer. In het centrale zenuwstelsel is glutamaat het meest voorkomende prikkelende aminozuur16. De N-methyl-D-aspartaatreceptor (NMDAR) is cruciaal voor de inductie en het behoud van langdurige potentiëring (LTP) en langdurige depressie (LTD)17. Onderzoek bij muizen toonde aan dat excitatoire synaptische plasticiteit een directe invloed heeft op de ontwikkeling van de hersenfunctie18, waarbij NMDAR-activering en calciuminstroom bijzonder belangrijk zijn19,20. Verbeterde NMDAR-activiteit heeft belangrijke implicaties voor het induceren van synaptische groei en plasticiteit19,20. Daarom zou een hogere mate van NMDAR-blokkade door NMDAR-antagonisten (bijv. sevofluraan) moeten resulteren in lagere leer- en geheugenvaardigheden21. Hoewel de effecten van sevofluraan op het leren en het geheugen in de hersenen van volwassenen nog niet tot een duidelijke conclusie zijn gekomen22,23, wordt sevofluraan vaak gebruikt voor anesthesie bij pediatrische operaties14. Als niet-competitieve antagonist van NMDAR kan sevofluraan de leer- en geheugenfuncties van de hersenen aanzienlijk beïnvloeden 11,13,14,23,24. Desalniettemin zijn naast NMDAR ook andere routes en eiwitten betrokken bij leren en geheugen, en de mechanismen van geheugenregulatie waarbij gefosforyleerd cAMP-responselementbindend eiwit (p-CREB) en onmiddellijk vroeg gen c-fos betrokken zijn, worden steeds duidelijker 25,26,27, maar vereisen nog steeds een beter begrip voor optimale anesthesietoediening bij zuigelingen en kinderen.

Op basis van deze theoretische kaders onderzocht de huidige studie een geïntegreerde methodologische benadering die kan worden gebruikt om cognitieve stoornissen in de zich ontwikkelende hersenen veroorzaakt door sevofluraan te bestuderen op basis van geheugen en p-CREB- en c-fos-expressie in hippocampale neuronen via de NMDAR/p-CREB/c-fos-signaleringsroute bij jonge ratten. De resultaten kunnen ons begrip van POCD en geheugenstoornissen na algehele anesthesie helpen verbeteren. Deze studie gebruikte ratten van 21 dagen oud omdat ze net waren gespeend en een zeer uniform lichaamsgewicht en fysiologische status hadden, wat overeenkomt met de vroege adolescentie bij mensen. Vanwege hun verhoogde neuroplasticiteit en kwetsbaarheid tijdens deze kritieke ontwikkelingsperiode, kunnen ze de cognitieve stoornissen veroorzaakt door chirurgie of anesthesie op de onvolgroeide hersenen efficiënt modelleren28,29. Dit maakt ze bijzonder geschikt voor het bestuderen van de neurocognitieve risico's die gepaard gaan met kinderchirurgie en het verkennen van mogelijke interventiestrategieën. Het Y-doolhof is een veelgebruikte methode om leren en geheugen te beoordelen30. Immunohistochemie wordt vaak gebruikt om neuronen en verschillende neuronale eiwitten te bestuderen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle protocollen in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van het Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (goedkeuring nr. XHEC-C-2016-023-2).

1. Experimenteel overzicht van dieren en groepering

  1. Zorg voor 64, 21 dagen oude mannelijke SD-ratten (lichaamsgewicht minder dan 80 g).
  2. Verdeel de ratten in vijf groepen: Normale groep (n = 8), 60% O2 groep (n = 16), Sham trainingsgroep (n = 8), Enkelvoudige dosis sevofluraan groep (n = 16) en Meervoudige dosis sevofluraan groep (n = 16) (Zie Tabel 1).
  3. Huisvesting van de ratten in een dierenverblijf bij 20-24 °C met 50%-60% luchtvochtigheid en natuurlijk licht.
  4. Zorg voor voldoende voedsel en water.
  5. Zorg ervoor dat alle protocollen worden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie.
  6. Bereid de inhalatiekamer voor (zie aanvullende figuur S1, gedetailleerd in paragraaf 2.1).
  7. Normale groep
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur bloot aan 60% lucht (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer Y-doolhoftesten uit 1 dag na de blootstelling (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).
  8. 60% Ø2 groep
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur bloot aan 60% lucht (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer 30 dagen na de blootstelling Y-doolhoftesten uit (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).
  9. Schijn training groep
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur bloot aan 60% lucht (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer Y-doolhoftesten uit 1 dag na blootstelling zonder gestructureerde training (lichten en schokzonelocaties varieerden willekeurig), gebruikt om te controleren op de effecten van licht en elektrische stimuli op leren en geheugen (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).
  10. Enkelvoudige dosis sevofluraan groep (sev1a-groep)
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur bloot aan 60% lucht + 3% sevofluraan (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer Y-doolhoftesten uit 1 dag na de blootstelling (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).
  11. Enkelvoudige dosis sevofluraan groep (sev30a-groep)
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur bloot aan 60% lucht + 3% sevofluraan (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer 30 dagen na de blootstelling Y-doolhoftesten uit (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).
  12. Herhaalde dosis sevofluraan groep (sev1b-groep)
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur per dag gedurende 7 opeenvolgende dagen bloot aan 60% lucht + 3% sevofluraan (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer Y-doolhoftesten uit 1 dag na de blootstelling (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).
  13. Herhaalde dosis sevofluraan groep (sev30b-groep)
    1. Stel de ratten gedurende 2 uur per dag gedurende 7 opeenvolgende dagen bloot aan 60% lucht + 3% sevofluraan (beschreven in paragraaf 2.2).
    2. Voer 30 dagen na de blootstelling Y-doolhoftesten uit (gedetailleerd in sectie 4).
    3. Verzamel weefsel na gedragstesten (beschreven in rubriek 5).

2. Inademing van sevofluraan

  1. Voorbereiding van de kamer (zie aanvullende figuur S1)
    1. Sluit het gat aan de linkerkant van de doos aan op 60% O2/40% N2.
    2. Sluit de zuurstoftoevoer aan op de sevofluraanverdamper.
    3. Sluit het gat aan de rechterkant van de doos aan op de gasanalysator van een anesthesieapparaat.
    4. Sluit het gat aan de bovenkant van de kamer aan op het gasafval.
    5. Leg kalk onder het gaas op de bodem van de kamer en voeg watten toe.
    6. Plaats de opstelling in een zuurkast.
    7. Plaats een verwarmingskussen onder de kamer.
  2. Inademing
    1. Zet de zuurstoftoevoer en de sevofluraan vaporizer aan.
    2. Stel de zuurstofstroom in op 2 l/min.
    3. Wanneer de sevofluraanconcentratie 3,0% bereikt, houdt u de stroom 30 minuten aan om de atmosfeer in de kamer te stabiliseren.
    4. Plaats een rat op de katoenen kant van de kamer.
    5. Houd de rat daar volgens groepering (zie stap 1.2).
    6. Bewaak de huidskleur, ademhalingsfrequentie, hartslag en pulsoximetrie.
    7. Verwijder de rat.
    8. Laat de rat op natuurlijke wijze ontwaken.
    9. Breng de rat terug naar zijn kooi.

3. Experimentele reagentia en instrumenten

  1. Bereiding van reagens
    1. Bereid 250 ml in de handel verkrijgbare sevofluraan voor voor toediening van anesthesie.
    2. Bereid de p-CREB-antilichaamwerkoplossing voor door het voorraadantilichaam 1:350 te verdunnen.
    3. Bereid de werkoplossing voor c-fos-antilichamen door het voorraadantilichaam 1:200 te verdunnen.
    4. Zet de kit voor immunohistochemische kleuring in elkaar.
    5. Bereid 4% paraformaldehyde.
      1. Los 40 g oplosbaar paraformaldehyde (PFA) op in een glazen container met 500 ml zeer zuiver water, verwarm en roer magnetisch tot 60-65 °C tot het een melkachtige suspensie vormt.
      2. Voeg druppels van 1,0 mol/L NaOH toe totdat de oplossing helder wordt (pH = 7,0).
      3. Voeg ongeveer 500 ml PBS toe en meng grondig in een ijsbad of koudwaterbad.
      4. Controleer de pH opnieuw, filtreer en vul aan tot een volume van 1000 ml.
      5. Bewaren bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
  2. Apparatuur instellen
    1. Plaats het Y-doolhof in het gebied voor gedragstesten (zie aanvullende afbeelding S2).
    2. Kalibreer de microscoop met een geïntegreerd beeldvormingssysteem voor histologische analyse.
  3. Installeer de microtoom met verse messen voor weefselsectie.
  4. Programmeer de dehydratatiemachine met het standaard weefselverwerkingsprotocol.
  5. Bereid de kleurmachine voor met de sequentiële kleurbaden volgens de instructies van de fabrikant van de machine.
  6. Stel het perfusieapparaat in.
    1. Gebruik twee in plastic verpakte zoutoplossingflessen, laat de zoutoplossing uit de onderste opening lopen en vul ze met PBS en 4% paraformaldehydefixeermiddel.
    2. Hang de flesjes op, verbind ze met infusiesets en bevestig een driewegkraan aan het dikke naalduiteinde van de infusieset.

4. Y-doolhof en leer-/geheugentesten

  1. Zet het Y-doolhof in elkaar
    1. Zet het Y-doolhof op met drie rechthoekige armen met het label I, II en III, verbonden door een driehoekige verbinding (zie aanvullende figuur S2).
    2. Plaats een elektrisch rooster met een tussenruimte van 1 cm op de bodem van het doolhof.
    3. Bevestig dunne koperen strips van 2 cm op de doolhofwanden om gevaarlijke gebieden te simuleren en installeer stimulussignaallampen.
  2. Definieer gevaarlijke en veilige gebieden
    1. Elektrificeer de regio's I, II en III bij 16.000 V/m om gevaarlijke gebieden aan te geven (het signaallicht gaat branden wanneer het onder stroom staat).
    2. Markeer niet-geëlektrificeerde gebieden met een rood licht om veilige gebieden aan te geven.
    3. Definieer de verbinding tussen armen als een niet-veilig gebied waar de rat een elektrische schok kan krijgen.
  3. Opleiding procedure
    1. Beschouw aan het begin van het experiment het gebied waar de rat zich bevindt als het veilige gebied.
    2. Breng na 2-4 minuten elektriciteit aan op het veilige gebied en moedig de rat aan om naar de veilige zone te gaan.
    3. Als de rat zich van het veilige gebied naar een gevaarlijk gebied beweegt, zal hij onder elektrische schokken terugkeren naar de veilige zone, waarbij hij een passieve vermijdingsreactie vertoont.
  4. Ontwikkeling van de actieve vermijdingsreactie
    1. Doe na meerdere trainingssessies het licht in de veilige omgeving aan zonder elektrische schokken toe te passen.
    2. Observeer de beweging van de rat in de richting van het verlichte veilige gebied en vorm een licht-donker discriminatie geconditioneerde reflex (actieve vermijdingsreactie).
  5. Plaats het Y-doolhof in een slecht verlichte en stille ruimte om afleiding van buitenaf tot een minimum te beperken.
  6. Geef dagelijks trainingen tussen 9:00-11:00 uur en 14:00-16:00 uur.
  7. Laat de ratten 5 minuten vrij bewegen in het doolhof voor het experiment om ze te helpen zich aan te passen aan de doolhofomgeving.
  8. Stimulusparameters aanpassen
    1. Pas de stimulusspanning (16.000 V/m) tijdens het testen aan om ervoor te zorgen dat ratten binnen 10 s na het ontvangen van een elektrische schok ontsnappen.
    2. Houd het signaallampje voor veilige gebieden 15 s aan en schakel het vervolgens uit.
    3. Start de volgende ronde van schokexperimenten na een interval van 45 s.
  9. Volgorde van signaallichten en correcte reactie
    1. Stel de volgorde in van het signaallicht dat wordt ingeschakeld terwijl I II → → III → I, in een cyclus.
    2. Definieer een correcte reactie als de rat die binnen 10 s na ontvangst van een elektrische schok uit het startgebied rechtstreeks naar de verlichte veilige zone ontsnapt.
  10. Bedenk dat de rat de leerstandaard heeft bereikt als hij in 8 van de 10 opeenvolgende proeven de juiste ontsnappingsreactie maakt.
  11. Registreer elke ontsnapping naar een arm zonder licht als een onjuiste reactie.
  12. Meerdere trainings- en testsessies
    1. Voer meerdere trainings- en testsessies uit om het leren en het geheugen te evalueren.
    2. Noteer het aantal goede en onjuiste antwoorden tijdens een vast aantal proeven.
    3. Wijzig het startgebied om de complexiteit van de taak te vergroten.
  13. Beoordeel het geheugenbehoud met tussenpozen (bijv. 24 of 48 uur na de training) om het geheugenbehoud van de ratten te evalueren.

5. Immunohistochemie

  1. Verdoof de ratten
    1. Dien 1 uur na de training een intraperitoneale injectie van 10% chloraalhydraat (0,4 ml/100 g) toe om de ratten te verdoven. Gooi chloraalhydraatoplossing weg in overeenstemming met de lokale regelgeving.
    2. Voer een thoracotomie uit om het hart volledig bloot te leggen31.
  2. Verdoofde ratten verdoofd met fysiologische oplossing
    1. Steek een naald met PBS in de linkerventrikel in de richting van de aorta, zet de naald vast met een hemostatische tang en snijd onmiddellijk de rechteroorschelp van de muis open om veneus bloed vrij te maken.
    2. Injecteer PBS snel totdat het effluent helder is en de lever en longen wit lijken.
    3. Volg met een snelle en vervolgens langzame infusie van 500 ml 10% formalineoplossing totdat het lichaam van het dier verstijft en formalinefixatie wordt bereikt.
    4. Gooi de formalineoplossing weg in overeenstemming met de lokale regelgeving.
  3. Verwijder de hersenen
    1. Open snel de schedel32.
    2. Verwijder het hele brein door het voorzichtig van de schedel op te tillen en de bloedvaten en het ruggenmerg aan de basis door te snijden, zonder de hemisferen te beschadigen (zoals weergegeven in aanvullende figuur S3).
  4. Ontleed de hippocampi
    1. Ontleed de bilaterale hippocampi.
      1. Snijd bij het occipitale foramen van de muis de hele hersenen af met een schaar.
      2. Steek de schaar voorzichtig diagonaal in het foramen magnum om het pariëtale bot door te knippen.
      3. Wrik beide zijden van het pariëtale bot los met een hemostatische tang.
      4. Gebruik een schaar om de oogzenuw aan één kant door te knippen en tast af tot aan de basis van de schedel.
    2. Plaats de hippocampi gedurende 12 uur in 10% formalineoplossing.
    3. Dompel het preparaat onder in formaline met een gradiënt van sucrose (10%, 20%, 30%).
    4. Een nacht bewaren bij 4°C totdat het weefsel van het monster naar de bodem zakt.
  5. Veranker en doorsnijd het preparaat
    1. Veranker het exemplaar in paraffine. Gooi de formalineoplossing weg in overeenstemming met de lokale regelgeving.
    2. Doorsnede het ingebedde monster tot 4 μm.
  6. Deparaffiniseren en rehydrateren van de secties
    1. Week de secties driemaal in 50 ml xyleen voor deparaffinisatie, telkens gedurende 15 minuten.
    2. Dompel achtereenvolgens onder in 50 ml 100%, 90%, 70% en 50% ethanol gedurende elk 10 minuten.
    3. Spoel driemaal met 50 ml 0,01 mM PBS gedurende elk 3 minuten.
  7. Antigeen ophalen
    1. Plaats de secties in 50 ml citraatbuffer (PBS, pH 6,0).
    2. Verwarm de secties in een roestvrijstalen snelkookpan tot 120 °C. Plaats de secties op een rek, volledig ondergedompeld in de buffer. Sluit het fornuis af, verwarm en houd het 3 minuten onder hoge druk.
    3. Haal het fornuis van het vuur en laat op natuurlijke wijze afkoelen tot kamertemperatuur voordat u het deksel opent.
    4. Spoel de secties 2 minuten in PBS (pH 7,2) en herhaal dit 3 keer.
    5. Breng ongeveer 100-200 μL 3% H2O2 aan om het compartiment op het objectglaasje te bedekken en incubeer 5-10 minuten bij kamertemperatuur om de endogene peroxidase-activiteit te elimineren.
    6. Spoel 3 keer 2 minuten met PBS.
  8. Incubatie van primaire antilichamen
    1. Voeg 200 μL primaire antilichamen (verdund 1:150 in 0,01 mol/L PBS) toe aan de secties.
    2. Incubeer een nacht bij 4°C.
  9. Incubatie van secundaire antilichamen
    1. Spoel de secties 3 keer 3 minuten in PBS.
    2. Incubeer de coupes met ongeveer 100-200 μL Polymer Helper om de coupe op de dia te bedekken en incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C.
    3. Spoel de secties 3 keer 2 minuten in 0,1 mol/L PBS.
    4. Voeg ongeveer 100-200 μL polyperoxidase-anti-muis/konijn IgG toe en incubeer gedurende 20 minuten bij 37°C.
    5. Spoel de secties 3 keer 3 minuten in PBS.
  10. Kleurontwikkeling
    1. Voeg ongeveer 100-200 μL van de diaminobenzidine (DAB)-oplossing toe (genoeg om het gedeelte op het objectglaasje te bedekken) voor kleurontwikkeling.
    2. Laat het ongeveer 3 minuten inwerken.
  11. Tegenbeitsen en monteren
    1. Voer de tegenkleuring uit door ongeveer 100-200 μL hematoxyline druppelsgewijs toe te voegen om het gedeelte op elk glaasje volledig te bedekken.
  12. Dehydrateer en monteer de secties
    1. Dehydrateer de secties in 50 ml 50%, 70%, 90% en 100% ethanol elk 10 minuten, gevolgd door 50 ml xyleen gedurende 10 minuten.
    2. Maak de secties vrij en monteer ze volgens de standaardprocedures.
  13. Microscopisch onderzoek
    1. Tel het aantal p-CREB- en c-fos-positieve neuronen in de hippocampus van elke groep33,34.
    2. Onderzoek de secties onder een microscoop met een vergroting van 400x.
    3. Noteer het gemiddelde aantal positieve neuronen in elke plak, op basis van tellingen van drie secties per dier zonder overlap.
      OPMERKING: Alle gegevens zijn verzameld in een computerspreadsheet. Alle analyses werden uitgevoerd met behulp van statistische software. De resultaten werden gepresenteerd als gemiddelden ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) en geanalyseerd met behulp van eenrichtings-ANOVA met de SNK-q en Dunnett T3 post hoc-tests35. De SNK-q-test wordt vaak gebruikt voor verkennende studies en is geschikt voor paarsgewijze vergelijkingen tussen meerdere steekproefgemiddelden. Het is niet gebaseerd op vooraf gedefinieerde hypothesen, waardoor het ideaal is voor het vergelijken van alle groepsgemiddelden36. De Dunnett T3-test wordt meestal gebruikt voor bevestigende onderzoeken met vooraf gedefinieerde hypothesen. Het is geschikt voor het vergelijken van meerdere behandelgroepen met een controlegroep of voor het vergelijken van middelen met een bijzondere professionele betekenis35,37. Toen de P-waarde van de ANOVA-test ≤ 0,05 lag, werden de paarsgewijze post hoc-tests uitgevoerd om te bepalen welke groepen significant verschilden van de andere. Tweezijdige P-waarden < 0,05 werden als statistisch significant beschouwd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van gegevens uit deze studie als illustratieve voorbeelden, hebben we de soorten resultaten laten zien die met dit methodologische kader kunnen worden gegenereerd, inclusief representatieve immunokleuringsbeelden en gedrags- en moleculaire gegevens van verschillende groepen. De nadruk ligt op het presenteren van typische of verwachte resultaten die door deze benadering worden geproduceerd, in plaats van het geven van een interpretatie van hun biologische betekenis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie onderzocht hoe sevofluraan het geheugen beïnvloedt en de expressie van p-CREB en c-fos in hippocampale neuronen moduleert via de NMDAR/p-CREB/c-fos signaleringsroute bij jonge ratten. De resultaten suggereren dat sevofluraan een kortdurend (1 uur na de training, niet na 3 dagen) negatief stimulerend effect had op het geheugenbehoud van jonge ratten, zonder impact op basis van doseringsfrequentie (enkelvoudige dosis of zeven doses gedurende 7 dagen). Sevofluraan verminderde si...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs melden dat er geen concurrerende belangen zijn om aan te geven.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ye Jiang en Guohui Li ontwierpen de studeerkamer. Ye Jiang en Lai Jiang verzamelden en analyseerden de gegevens en stelden het manuscript op. Ye Jiang en Guohui Li hebben het manuscript herzien. Alle auteurs hebben de definitieve versie van het manuscript beoordeeld en goedgekeurd voor indiening. Dit werk wordt ondersteund door subsidies aan Guohui Li van het Shanghai Pujiang Programme (subsidie nr. 23PJD057).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Experimentele dieren
Sprague-Dawley (SD) RattenCharles River Laboratories (Peking, China)N/A21 dagen oude, mannelijke
Standaard RattendieetKeao Xieli Feed (Peking, China)N/AStandaard laboratoriumdieet
Chemicaliën en Reagentia
ChloraalhydraatSinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China)80113818Verdovingsmiddel voor terminale perfusie
Citraatbuffer (10x)ZSGB-BIO (Peking, China)ZLI-9064Antigeen oplossing voor pH 6.0
Ethanol (100%)Sinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China)100092683Ontwateringsmiddel voor histologie
Hematoxyline KleuroplossingBaso Diagnostics Inc. (Zhuhai, China)BA-4041Tegenstof voor IHC
Waterstofperoxide (H2O2)Sinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China)100112183% oplossing voor blokkering van endogene peroxidase
Neutrale BalsamSolarbio (Peking, China)G8590Montagemiddel voor dia's
Stikstof (N2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, China)N/AHoge zuiverheid, voor gasmengsel
Zuurstof (O2)Shanghai Medical Gas Co. (Shanghai, China)N/AMedische kwaliteit, voor gasmengsel
ParaffineLeica Biosystems (Nussloch, Duitsland)39601006Inbeddingsmiddel voor weefsel
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)158127Fixeermiddel voor weefselperfusie en -fixatie
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco (Waltham, MA, USA)7001104410x stamoplossing, pH 7.4
SevofluraanAbbVie Inc. (North Chicago, IL, USA)N/AInhalatie-anesthesiemiddel
Soda KalkW. R. Grace and Co. (Columbia, MD, USA)22-01-0010CO2 absorber voor inhalatiekamer
Natriumhydroxide (NaOH)Sinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China)10019818Gebruikt voor pH aanpassing van PFA oplossing
SucroseSangon Biotech (Shanghai, China)A502693Gebruikt voor cryobescherming van hersenweefsel
XyleenSinopharm Chemical Reagent (Shanghai, China)10023418Clearing agent voor histologie
Antilichamen en Kits
c-Fos AntilichaamAbcam (Cambridge, UK)ab190289Konijn anti-muis, primair antilichaam
DAB Chromogen KitZSGB-BIO (Peking, China)ZLI-9018Substraat voor HRP kleur ontwikkeling
p-CREB (Ser133) AntilichaamCell Signaling Technology (Danvers, MA, USA)9198Konijn anti-muis, primair antilichaam
Polymeer HRP Detectie KitZSGB-BIO (Peking, China)PV-9000Secundair antilichaam en detectiesysteem voor IHC
Apparatuur
Anesthesie ApparaatRWD Life Science (Shenzhen, China)R500Voor gecontroleerde gasmengsel levering
Automatische Weefsel ProcessorLeica Biosystems (Nussloch, Duitsland)ASP6025Voor geautomatiseerde ontwatering en clearing
Cryostat/MicrotomeLeica Biosystems (Nussloch, Duitsland)CM1950Voor het snijden van bevroren/ingebed hersenweefsel
Microscoop SysteemOlympus (Tokio, Japan)BX53Voor beeldvorming van IHC dia's
Perfusie PompLonger Precision Pump Co. (Baoding, China)BT100-2JPeristaltiek pomp voor transcardiale perfusie
Sevofluraan VerdamperRWD Life Science (Shenzhen, China)R510PSVoor nauwkeurige controle van sevofluraanconcentratie
Y-Labyrint ApparaatMed Associates Inc. (St. Albans, VT, USA)MED-VFC-S-YMet elektrisch rooster en lichten voor actieve vermijding
Software
GraphPad PrismGraphPad Software (San Diego, CA, USA)Versie 9Statistische analyse en gegevensvisualisatie
ImageJNational Institutes of Health (Bethesda, MD, USA)Versie 1.53Beeldanalyse software voor celtelling
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation (Redmond, WA, USA)Office 365Spreadsheet software voor gegevens compilatie

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hadders-Algra, M. The developing brain: challenges and opportunities to promote school readiness in young children at risk of neurodevelopmental disorders in low- and middle-income countries. Front Pediatr. 10, 989518(2022).
  2. Pfeifer, J. H., Allen, N. B., Byrne, M. L., Mills, K. L. Modeling developmental change: contemporary approaches to key methodological challenges in developmental neuroimaging. Dev Cogn Neurosci. 33, 1-4 (2018).
  3. Pezzoli, P., et al. Challenges and solutions to the measurement of neurocognitive mechanisms in developmental settings. Biol Psychiatry Cogn Neurosci Neuroimaging. 8 (8), 815-821 (2023).
  4. Risgaard, K. A., Sorci, I. A., Mohan, S., Bhattacharyya, A. Meta-analysis of Down syndrome cortical development reveals underdeveloped state of the science. Front Cell Neurosci. 16, 915272(2022).
  5. Caporusso, E., et al. Current limitations in technology-based cognitive assessment for severe mental illnesses: a focus on feasibility, reliability, and ecological validity. Front Behav Neurosci. 19, 1543005(2025).
  6. Kasari, C., Brady, N., Lord, C., Tager-Flusberg, H. Assessing the minimally verbal school-aged child with autism spectrum disorder. Autism Res. 6 (6), 479-493 (2013).
  7. Hilton, M. T. Methodological challenges faced by researchers studying early neurodevelopmental outcomes in majority settings. Cambridge J Human Behav. 1 (2), 106-114 (2023).
  8. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  9. Lee, J. H., Zhang, J., Wei, L., Yu, S. P. Neurodevelopmental implications of the general anesthesia in neonate and infants. Exp Neurol. 272, 50-60 (2015).
  10. Keunen, K., Sperna Weiland, N. H., de Bakker, B. S., de Vries, L. S., Stevens, M. F. Impact of surgery and anesthesia during early brain development: a perfect storm. Paediatr Anaesth. 32 (6), 697-705 (2022).
  11. McCann, M. E., et al. Neurodevelopmental outcome at 5 years of age after general anaesthesia or awake-regional anaesthesia in infancy (GAS): an international, multicentre, randomised, controlled equivalence trial. Lancet. 393 (10172), 664-677 (2019).
  12. Han, F. F., et al. Predictors and occurrence of postoperative cognitive dysfunction in children undergoing noncardiac surgery: a prospective cohort study. iBrain. 9 (2), 148-156 (2023).
  13. Chung, W., et al. Sevoflurane exposure during the neonatal period induces long-term memory impairment but not autism-like behaviors. Paediatr Anaesth. 25 (10), 1033-1045 (2015).
  14. Apai, C., Shah, R., Tran, K., Pandya Shah, S. Anesthesia and the developing brain: a review of sevoflurane-induced neurotoxicity in pediatric populations. Clin Ther. 43 (4), 762-778 (2021).
  15. Arefayne, N. R., Berhe, Y. W., van Zundert, A. A. Incidence and factors related to prolonged postoperative cognitive decline (POCD) in elderly patients following surgery and anaesthesia: a systematic review. J Multidiscip Healthc. 16, 3405-3413 (2023).
  16. Malik, A. R., Willnow, T. E. Excitatory amino acid transporters in physiology and disorders of the central nervous system. Int J Mol Sci. 20 (22), 5671(2019).
  17. Albarracin, S. L., Baldeon, M. E., Sangronis, E., Petruschina, A. C., Reyes, F. G. R. L-glutamate: a key amino acid for sensory and metabolic functions. Arch Latinoam Nutr. 66 (2), 101-112 (2016).
  18. Vyklicky, V., et al. function, and pharmacology of NMDA receptor channels. Physiol Res. 63 (Suppl 1), S191-S203 (2014).
  19. Zorumski, C. F., Izumi, Y. NMDA receptors and metaplasticity: mechanisms and possible roles in neuropsychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 989-1000 (2012).
  20. Lau, C. G., et al. Regulation of NMDA receptor Ca2+ signalling and synaptic plasticity. Biochem Soc Trans. 37 (Pt 6), 1369-1374 (2009).
  21. Bye, C. M., McDonald, R. J. A specific role of hippocampal NMDA receptors and Arc protein in rapid encoding of novel environmental representations and a more general long-term consolidation function. Front Behav Neurosci. 13 (8), (2019).
  22. Callaway, J. K., Jones, N. C., Royse, A. G., Royse, C. F. Sevoflurane anesthesia does not impair acquisition learning or memory in the Morris water maze in young adult and aged rats. Anesthesiology. 117 (5), 1091-1101 (2012).
  23. Li, R., et al. Sevoflurane exposure in the developing brain induces hyperactivity, anxiety-free, and enhancement of memory consolidation in mice. Front Aging Neurosci. 14, 934230(2022).
  24. Yuan, I., Xu, T., Kurth, C. D. Using electroencephalography (EEG) to guide propofol and sevoflurane dosing in pediatric anesthesia. Anesthesiol Clin. 38 (3), 709-725 (2020).
  25. Schinelli, S., et al. Stimulation of endothelin B receptors in astrocytes induces cAMP response element-binding protein phosphorylation and c-Fos expression via multiple mitogen-activated protein kinase signaling pathways. J Neurosci. 21 (22), 8842-8853 (2001).
  26. Florian, C., Mons, N., Roullet, P. CREB antisense oligodeoxynucleotide administration into the dorsal hippocampal CA3 region impairs long- but not short-term spatial memory in mice. Learn Mem. 13 (4), 465-472 (2006).
  27. Cabrera, O. H., Useinovic, N., Jevtovic-Todorovic, V. Neonatal anesthesia and dysregulation of the epigenome. Biol Reprod. 105 (3), 720-734 (2021).
  28. Arellano, J. I., Duque, A., Rakic, P. A coming-of-age story: adult neurogenesis or adolescent neurogenesis in rodents. Front Neurosci. 18, 1383728(2024).
  29. Borsini, A., Giacobbe, J., Mandal, G., Boldrini, M. Acute and long-term effects of adolescence stress exposure on rodent adult hippocampal neurogenesis, cognition, and behaviour. Mol Psychiatry. 28 (10), 4124-4137 (2023).
  30. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Y-maze for assessment of spatial working and reference memory in mice. Methods Mol Biol. 1916, 105-111 (2019).
  31. Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 44-46 (2008).
  32. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: a comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  33. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue: a review. Diagn Pathol. 9, 221(2014).
  34. Diem, K., et al. Image analysis for accurately counting CD4+ and CD8+ T cells in human tissue. J Virol Methods. 222, 117-121 (2015).
  35. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean J Anesthesiol. 71 (5), 353-360 (2018).
  36. Shaffer, J. P. Controlling the false discovery rate with constraints: the Newman-Keuls test revisited. Biom J. 49 (1), 136-143 (2007).
  37. Liu, W. Some results on step-up tests for comparing treatments with a control in unbalanced one-way layouts. Biometrics. 53 (4), 1508-1512 (1997).
  38. Steven, A., et al. What turns CREB on? And off? And why does it matter. Cell Mol Life Sci. 77 (20), 4049-4067 (2020).
  39. Naqvi, S., Martin, K. J., Arthur, J. S. CREB phosphorylation at Ser133 regulates transcription via distinct mechanisms downstream of cAMP and MAPK signalling. Biochem J. 458 (3), 469-479 (2014).
  40. Brosnan, R. J., Thiesen, R. Increased NMDA receptor inhibition at an increased sevoflurane MAC. BMC Anesthesiol. 12, 9(2012).
  41. Wang, H., Peng, R. Y. Basic roles of key molecules connected with NMDAR signaling pathway on regulating learning and memory and synaptic plasticity. Mil Med Res. 3 (1), 26(2016).
  42. Chen, B. S., Roche, K. W. Regulation of NMDA receptors by phosphorylation. Neuropharmacology. 53 (3), 362-368 (2007).
  43. Brightwell, J. J., Smith, C. A., Neve, R. L., Colombo, P. J. Transfection of mutant CREB in the striatum, but not the hippocampus, impairs long-term memory for response learning. Neurobiol Learn Mem. 89 (1), 27-35 (2008).
  44. Colombo, P. J., Brightwell, J. J., Countryman, R. A. Cognitive strategy-specific increases in phosphorylated cAMP response element-binding protein and c-Fos in the hippocampus and dorsal striatum. J Neurosci. 23 (8), 3547-3554 (2003).
  45. Kida, S. A functional role for CREB as a positive regulator of memory formation and LTP. Exp Neurobiol. 21 (4), 136-140 (2012).
  46. Liu, Z., et al. Long-term sevoflurane exposure resulted in temporary rather than lasting cognitive impairment in Drosophila. Behav Brain Res. 442, 114327(2023).
  47. Wei, W., et al. Biomechanical effect of proximal multifidus injury on adjacent segments during posterior lumbar interbody fusion: a finite element study. BMC Musculoskelet Disord. 24 (1), 521(2023).
  48. Giza, C. C., Maria, N. S., Hovda, D. A. N-methyl-D-aspartate receptor subunit changes after traumatic injury to the developing brain. J Neurotrauma. 23 (6), 950-961 (2006).
  49. Jia, M., et al. Role of histone acetylation in long-term neurobehavioral effects of neonatal exposure to sevoflurane in rats. Neurobiol Dis. 91, 209-220 (2016).
  50. Tang, X., et al. Resveratrol mitigates sevoflurane-induced neurotoxicity by the SIRT1-dependent regulation of BDNF expression in developing mice. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9018624(2020).
  51. Gao, H., et al. Effects of intravenous anesthetics on the phosphorylation of cAMP response element-binding protein in hippocampal slices of adult mice. Mol Med Rep. 18 (1), 627-633 (2018).
  52. Allen, T. A., Fortin, N. J. The evolution of episodic memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (Suppl 2), 10379-10386 (2013).
  53. Bucci, D. J., Robinson, S. Toward a conceptualization of retrohippocampal contributions to learning and memory. Neurobiol Learn Mem. 116, 197-207 (2014).
  54. Cherubini, E., Miles, R. The CA3 region of the hippocampus: how is it? what is it for? how does it do it. Front Cell Neurosci. 9, 19(2015).
  55. Lehr, A. B., et al. Ca2+ beyond social memory: evidence for a fundamental role in hippocampal information processing. Neurosci Biobehav Rev. 126, 398-412 (2021).
  56. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  57. Benke, T. A., Luthi, A., Isaac, J. T., Collingridge, G. L. Modulation of AMPA receptor unitary conductance by synaptic activity. Nature. 393 (6687), 793-797 (1998).
  58. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105 (3), 331-343 (2001).
  59. Benke, T. A., et al. Mathematical modelling of non-stationary fluctuation analysis for studying channel properties of synaptic AMPA receptors. J Physiol. 537 (Pt 2), 407-420 (2001).
  60. Poncer, J. C., Esteban, J. A., Malinow, R. Multiple mechanisms for the potentiation of AMPA receptor-mediated transmission by alpha-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Neurosci. 22 (11), 4406-4411 (2002).
  61. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55 (2), 310-332 (2014).
  62. Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 343, 108831(2020).
  63. Shang, M., et al. Moderate white light exposure enhanced spatial memory retrieval by activating a central amygdala-involved circuit in mice. Commun Biol. 6 (1), 414(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Sevoflurane AnesthesiaJuvenile RatsLearning And MemoryHippocampal Neuronsp CREB Expressionc fos ExpressionY Maze TestImmunohistochemistryNMDAR SignalingCognitive Impairment

Gerelateerde artikelen