Methodenartikel

Expansiemicroscopie: Fluorescentiebeeldvorming met hoge resolutie met een conventionele microscoop

DOI:

10.3791/68595

⸱

19 december 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat cryofixatie- en expansiemicroscopiemethoden (Cryo-ExM) combineert, waardoor hogeresolutiebeeldvorming met structureel behoud mogelijk is, aangepast aan diverse biologische monsters. Biologische monsters worden ingevroren, ingebed in een zwellbaar polymeer, gedenatureerd, uitgezet en immuno-labeld, waardoor superresolutiebeeldvorming met standaard lichtmicroscopen mogelijk is.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Expansiemicroscopie (ExM) is een innovatieve superresolutie fluorescentiemicroscopietechniek die biologische monsters fysiek vergroot, waardoor beeldvorming voorbij de diffractiegrens mogelijk is met conventionele systemen zoals confocale microscopen. Door monsters in een zwellbare hydrogelmatrix in te sluiten, maakt ExM isotrope expansie van het monster mogelijk, waardoor de ruimtelijke resolutie wordt verbeterd zonder dat gespecialiseerde nanoscopieapparatuur nodig is. Geavanceerde varianten, zoals Ultrastructuurexpansiemicroscopie (U-ExM), behouden fijne cellulaire details, waaronder organellen en macromoleculaire assemblages.

De waarneming van specifieke cellulaire structuren of organellen hangt in belangrijke mate af van de fixatiemethode die op het monster wordt toegepast, met name door het gebruik van aldehyde-gebaseerde chemische kruisverbinders en eiwitprecipitatie met koud methanol. Onlangs heeft de integratie van cryofixatie – een goudstandaardfixatietechniek – met de U-ExM-methode nanoschaalwaarnemingen mogelijk gemaakt van een breed scala aan biologische monsters, van gekweekte zoogdiercellen tot hele organismen, in hun bijna-natuurlijke staat. Expansiemicroscopie is een krachtig hulpmiddel om biologische structuren op verschillende schaalniveaus te bestuderen, van geïsoleerde organellen tot hele weefsels. In combinatie met cryofixatie biedt het ongekende inzichten in cellulaire architectuur en dynamische processen, terwijl artefacten die geassocieerd worden met traditionele fixatiemethoden worden geminimaliseerd. Deze ontwikkelingen positioneren ExM als een veelzijdig kader voor hoge-resolutie, bijna-native biologische beeldvorming.

De huidige studie beschrijft een gedetailleerd protocol voor cryofixatie in combinatie met expansiemicroscopie van monsters uit verschillende oorsprongen. Dit protocol benadrukt kritieke stappen, waaronder monsterfixatie, polymeervorming, expansie, immunokleuring en beeldvorming, en biedt de noodzakelijke richtlijnen om deze methode in elk laboratorium toe te passen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microscopie speelt een cruciale rol in biologisch onderzoek, omdat ze ons in staat stelt de ultrastructuur en organisatie over levende systemen op ongekende schaal te visualiseren, van hele organismen tot individuele moleculen. Het microscopieveld omvat twee verschillende systemen: elektronenmicroscopie (EM), zeer resolutief maar met beperkte capaciteit voor specifieke labeling, en lichtmicroscopie, die een precieze en specifieke visualisatie van subcellulaire structuur mogelijk maakt, maar met beperkte resolutie door de diffractielimiet van licht. Hoewel superresolutiefluorescentiemicroscopie (SRM) is geëvolueerd als een krachtige methode voor fluorescentiebeeldvorming met subdiffractieresolutie van cellen, blijft het visualiseren van de ultrastructurele details van macromoleculaire assemblages, zoals hele organismen, een uitdaging1. Bovendien zijn SRM-technieken, die resoluties bereiken variërend van 10 tot 120 nm, afhankelijk van geavanceerde microscopen en beeldreconstructie-algoritmen en vereisen zij expertise en gespecialiseerde microscopen, waardoor hun toegankelijkheid voor veel biologielaboratoria beperkt wordt. Een opkomende superresolutiemethode, expansiemicroscopie (ExM), heeft deze beperkingen overwonnen. Ontwikkeld in het laboratorium van Edward S. Boyden tien jaar geleden, is ExM een innovatieve fotonische microscopietechniek die nu wordt beschouwd als superresolutiemicroscopie en beeldvorming mogelijk maakt zonder gespecialiseerde microscopente hoeven gebruiken. In plaats van te vertrouwen op geavanceerde beeldvormingstechnologieën, houdt ExM in dat biologische monsters worden ingebed in een zwellbaar polymeer dat isotroop uitzet. Deze fysieke uitbreiding vergroot de steekproefgrootte met een factor vier of meer, wat de resolutie verbetert en observatie met conventionele lichtmicroscopen mogelijk maakt. Oorspronkelijk ontwikkeld in hersenslices, zijn ExM-protocollen geëvolueerd om de resolutie te verbeteren en procedures te vereenvoudigen. Deze techniek is met succes aangepast voor diverse biologische monsters, waaronder eukaryote cellen, eencellige organismen, parasieten, weefsels en hele organismen, waarmee de veelzijdigheid wordt aangetoond 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

Momenteel bestaan er twee hoofdklassen protocollen: pre-expansie 2,16 en post-expansie17,18, die verwijzen naar het moment van het biologisch monsterkleuring, vóór of na de expansieprocedure. Dit artikel richt zich specifiek op het post-expansieprotocol, waarbij immunolabeling wordt uitgevoerd na monsterdenaturatie en -expansie.

In dit protocol worden biologische monsters cryo- of chemisch gefixeerd en geïncubeerd met chemische agentia, waardoor eiwitverankering mogelijk wordt gemaakt aan het toekomstige polymeer. De monsters worden vervolgens ingesloten in een opzwellbaar polymeer bestaande uit acrylamide/bis-acrylamide (vaak gebruikt in elektroforesegels) en natriumacrylaat (wat uitzetting mogelijk maakt). Water toevoegen activeert gelexpansie, waardoor de afstand tussen eiwitten toeneemt in verhouding tot de uitzetting van de gel. Eiwitten van belang worden vervolgens direct binnen de gel gelabeld met specifieke antilichamen (Figuur 1).

Alle eerder genoemde beeldvormingstechnieken, waaronder elektronenmicroscopie, fotonische microscopie, superresolutiemicroscopie en ExM, vereisen biologische monsterfixatie. Aldehyde-gebaseerde fixatie creëert kruisverbindingen tussen eiwitten, waardoor de celorganisatie behouden blijft tijdens de behandelingen die nodig zijn voor fotonische of elektronenmicroscopie. Fixatie kan echter ook leiden tot artefacten en morfologische veranderingen in de cel, wat subtiel kan zijn in klassieke lichtmicroscopie, maar steeds duidelijker is geworden met de vooruitgang en ontwikkeling van SRM, waardoor wetenschappers de gevolgen van fixatiemethodenheroverwegen 19. Een manier om fixatiegerelateerde artefacten te omzeilen is het gebruik van live microscopie, waarmee cellulaire structuren in hun bijna-natuurlijke toestand dynamisch zichtbaar kunnen worden weergegeven. Echter, levende microscopie kent verschillende nadelen, met name de noodzaak van transgenexpressie, die mogelijk de celfysiologie kan beïnvloeden en het eiwitgedrag kan veranderen ten opzichte van endogene tegenhangers. Bovendien biedt levende microscopie doorgaans een lagere resolutie dan vaste microscopie en heeft het beperkte labelmogelijkheden, omdat fluorescentietags niet-toxisch en stabiel moeten zijn onder levende omstandigheden, waardoor de beschikbare markers beperkt zijn. Het vakgebied van elektronenmicroscopie heeft, vanwege zijn hoge resolutie, aanzienlijk bijgedragen aan de ontwikkeling van optimale methoden om subcellulaire of macromoleculaire structuren vast te leggen terwijl hun oorspronkelijke toestand behouden blijft. Decennia geleden werd cryofixatie ontwikkeld door Dubochet, Frank en Henderson Laboratories, waarbij de cel snel werd gefixeerd in glasvocht en werd aangetoond dat dit de enige methode was om de native ultrastructuur20,21 te behouden. Hoewel gezuiverde moleculen direct in glasvochtijs kunnen worden waargenomen met cryo-elektronenmicroscopie, moeten cellen in hars worden ingebed en doorgesneden worden voordat ze worden geobserveerd. Om de monsters verder te stabiliseren in de meest native staat mogelijk, worden monsters onderworpen aan vriessubstitutie. In dit proces worden ijsmoleculen direct vervangen door aceton, dat een hogere diffusiecoëfficiënt heeft dan water. Tijdens het verwijderen van water kunnen de moleculen van belang zich samenvoegen en instorten, vergelijkbaar met wat gebeurt bij chemische kruisbindingsfixatie. Om deze aggregatie te beperken, wordt vriessubstitutie uitgevoerd bij lage temperaturen, waarbij de aggregatie wordt verminderd door de intracellulaire viscositeit22 te verhogen. Deze gecontroleerde aanpak beperkt de vorming van grote aggregaten en behoudt de cellulaire ultrastructuur dichter bij de oorspronkelijke toestand.

In 2022 leidde het groeiende bewijs dat chemische fixatie artefacten introduceert, gecombineerd met vooruitgang in expansiemicroscopie, het laboratorium van Guichard/Hamel ertoe een methode te ontwikkelen die cryofixatie integreert met expansiemicroscopie, bekend als 'Cryo-ExM'23. Deze aanpak benut de sterke punten van beide technieken door biologische structuren te behouden met minimale vervorming. Monsters worden cryo-ingevroren door middel van hogedrukbevriezing of handmatig inzakken, beide vereisen gespecialiseerde apparatuur die vaak wordt gevonden in elektronenmicroscopielaboratoria of kernfaciliteiten.

Dit artikel beschrijft een stapsgewijs protocol voor cryofixatie gevolgd door expansiemicroscopie en presenteert representatieve resultaten van twee experimentele modellen: menselijke gekweekte cellen en de eencellige parasiet Trypanosoma brucei, de oorzaker van slaapziekte. We zullen de verbeteringen benadrukken die cryofixatie biedt ten opzichte van conventionele fixatiemethoden en de meest voorkomende valkuilen en fixatieartefacten die met de techniek gepaard gaan, belichten.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Reagentia die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaallijst. Dit protocol is met kleine aanpassingen aangepast voor de observatie van verschillende cellulaire processen in verschillende biologische monsters (waaronder gist24,25, Toxoplasma gondii26, nauw verwante diersoort27, groene algen28,29, microbiële eukaryoten30, evenals muis23 en menselijke monsters 23,31,32,33)). Aanpassingen om het protocol aan te passen aan deze verschillende monsters worden in dit artikel niet genoemd, omdat ze uit de oorspronkelijke publicaties kunnen worden gehaald. Hier worden RPE1-cellen en Trypanosoma brucei gebruikt als vervangers voor zoogdiercellen en parasieten. Dit protocol legt de nadruk op de fixatie- en uitbreidingsstappen van de biologische monsters; Daarom wordt informatie over de monstercultuur niet gepresenteerd in dit artikel.

1. Voorbereiding van de voorraadoplossing

  1. Poly-lysineoplossing
    1. Suspendeer poly-L of poly-D-lysinehydrobromide (Materiaaltabel) opnieuw in water om een standaardoplossing van polylysine te verkrijgen bij 1 mg/mL. Bewaar deze voorraadoplossing bij -20 °C en verdun deze verder in water bij 0,2 mg/mL om de dekkers te coaten (Tabel 1, Tabel van Materiaal).
  2. Ankeroplossing
    1. Bereid verse acrylamide/formaldehydeoplossing (onder de chemische kap) door 38 μL formaldehyde te mengen (36,5%-38%; Materiaaloverzicht) en 50 μL acrylamide (40%, Materiaaltabel) in 912 μL PBS om 1 mL oplossing te verkrijgen.
  3. Gelatieoplossing zonder APS (initiator)
    1. Bereid een mengoplossing door 500 μL 38% natriumacrylaat (19% definitief), 250 μL 40% acrylamide (10% definitief), 50 μL 2% bisacrylamide (0,1% definitief), 50 μL TEMED (0,5% definitief) en 100 μL 10x PBS (1x definitief) toe te voegen. Aliquot in volume geschikt voor maximaal 2 gels (80-90 μL) en bewaar bij -20 °C voor minimaal 12 uur voor gebruik (zie Tabel 1 voor langdurige conservering).
      OPMERKING: Let op dat het volume dat wordt aangegeven om de gel oplossing te bereiden, wordt berekend om een eindvolume van 1 mL te verkrijgen, maar het werkelijke volume van de oplossing is 950 μL, aangezien APS, dat 1/20 van het totale volume elk vertegenwoordigt, tijdelijk wordt toegevoegd. De oorspronkelijke opslagtijd van de gelatieoplossing17 werd verlengd nadat we observeerden dat deze tot 1 maand bij -20 °C kon worden bewaard zonder de gelsoliditeit of expansie-efficiëntie te verminderen.
  4. TEMED en APS
    1. APS 10% met alcohol: Verdun APS-poeder in water, aliquot en bewaar bij -20 °C.
    2. TEMED 10% v/v: TEMED verdund in water, aliquot en bewaar bij -20 °C.
  5. Natriumacrylaat (SA) 38%
    1. Bereid 38% SA voor uit gezuiverde SA (AK scientific of Sigma; Materiaaloverzicht)
      1. Suspendeer 38 g natriumacrylaat opnieuw in 100 ml water onder constant roeren (belangrijk). Verwerk SA geleidelijk om aggregaten te voorkomen en roer 's nachts bij 4 °C om volledige herophanging te garanderen. Zorg ervoor dat de oplossing doorschijnend en kleurloos of licht geel is. Aliquot en bewaar tot 1 jaar op 4 °C.
    2. Bereid 38% SA uit acrylzuur (Sigma; Materiaaloverzicht)
      1. Bereid 90 ml 38% natriumacrylaat door acrylzuur te neutraliseren met NaOH onder een chemische kap.
      2. Meng 29 ml water met 25 ml acrylzuur tijdens het roeren.
        OPMERKING: Vanaf deze stap moet de reactie op ijs worden uitgevoerd met constante controle van pH en temperatuur, aangezien de reactie exotherm is.
      3. Voeg druppel voor druppel 10 N NaOH toe met een Pasteur-pipet.
        OPMERKING: Zorg ervoor dat de temperatuur niet boven de 25 °C uitkomt (als dat wel zo is, stop dan met het toevoegen van NaOH en wacht tot de temperatuur is afgekoeld).
      4. Blijf neutraliseren tot de pH 7-8 is en beweeg 1 uur op ijs.
        OPMERKING: Als de pH plotseling boven de 10 springt, voeg dan acrylzuur toe totdat de pH daalt naar 7-8.
      5. Bewaar de oplossing een nacht in een gesloten container. Als de oplossing is neergeslagen, centrifugeer dan op 1.000 × g gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant, aliquot, en bewaar het bij -20 °C.
  6. Denaturatieoplossing
    1. TrisBase 1 M: Verdun 121,14 g TrisBase in 1 L water, stel de pH aan met HCl naar 9 en bewaar bij RT.
    2. Denaturatiebuffer: Meng 200 mM natriumdodecylsulfaat (SDS), 200 mM NaCl, 50 mM TrisBase in water. Voor een oplossing van 200 mL voeg je 10 mL Tris-BASE 1 M (pH 9) toe aan 124,9 mL ddH2O, 57,1 mL SDS (20%/700 mM voorraad) en 8 mL NaCl (5 M) tijdens het roeren. Bewaar bij RT (Tafel 1).

2. Cryofixatie en expansieprocedure

  1. Monstervoorbereiding en cryofixatie
    OPMERKING: Dit protocol is geoptimaliseerd voor monsters die zijn gekweekt/geladen op 12 mm coverslips. Pas alsjeblieft het volume van de oplossing aan voor andere ondersteuning.
    1. Monstervoorbereiding
      1. Laat het monster groeien in een toestand die is aangepast aan het biologische monster, hetzij direct op 12 mm dekfolies (zoogdier-adherente cellen) of in suspensie (T. brucei).
      2. Laad het monster op de dekfolie (T. brucei) voorbekleed met polylysine als volgt: incubeer kort 12 mm dekfolies in poly-lysine (0,2 mg/mL) gedurende 1 uur bij 37 °C, was snel en laat het aan de lucht drogen.
      3. Centrifugeer de parasieten op 300 g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Opnieuw opschorten in PBS, aangevuld met 10% kweekmedium, en plaats 5-10 minuten voor cryofixatie op dekmantels.
    2. Plunging-opstelling (Figuur 2A-C)
      VOORZICHTIG: Werk onder een chemische kap met handschoenen en een labjas bij het manipuleren van aceton. Gebruik een labjas en een bril wanneer je vloeibare stikstof en vloeibare ethaan manipuleert.
      1. Vul onder een chemische kap 5 mL buizen (1 dekmantel/buis) met 1 mL extra droge aceton met een spuit en een naald om luchtvervuiling te voorkomen.
        OPMERKING: Voor een betere biologische membraanbescherming is de toevoeging van paraformaldehyde (PFA)/glutaraldehyde (GA) (0,1/0,02%) noodzakelijk. Pas de buis aan volgens de diameter van de dekmantel (dekmantels > 12 mm passen niet in 5 mL buizen).
      2. Bevries de buizen in vloeibare stikstof met een plastic of metalen rek dat bestand is tegen koude temperaturen om ze rechtop te houden.
      3. Vul de helft van een polystyreen doos (30 cm x 30 cm / dikke wanden) met droogijs.
      4. Vul de Vitrobot-type dewar met vloeibare stikstof totdat hij stopt met verdampen, en wacht 10-15 minuten tot de temperatuur stabiel is. Het gebruik van de spin is nodig om het afkoelen van het systeem te vergemakkelijken (Figuur 2B, asterisk). Vul indien nodig bij.
      5. Verwijder de spin en vul de metalen dompelkamer met vloeibare ethaan.
      6. Wacht 10 minuten tot het ethaan in balans is.
        OPMERKING: Vul het dompelsysteem tijdens het experiment bij met vloeibare ethaan indien nodig (gebruik de spin op dit moment niet meer). De overgang van gasvormig naar vloeibaar ethaan is moeilijk. Het gebruik van de juiste druk is cruciaal voor de vorming van vloeibaar ethaan. Hoge druk voorkomt vloeistofvorming door constante gasoverstroming binnen de metalen kamer, terwijl lage druk vaste ethaan vormt in de metalen kamer en de vulbuis. Het vermijden van ijsvorming is essentieel voor het experiment. Het behouden van de vulpunt op de vloeistof/luchtgrens helpt om de vorming van vast ethaan te voorkomen.
    3. Induiken (Figuur 2A-C)
      VOORZICHTIG: Gebruik een labjas en een bril bij het manipuleren van vloeibare stikstof en vloeibare ethaan.
      1. Pak een deklaag van 12 mm met een dunne pincet.
      2. Zuig overtollig medium op met vloeipapier.
      3. Houd de dekmantel halverwege met de pincet vast met een klemring die is aangepast aan de cryo-plunjer.
      4. Plaats de pincet die de dekmantel vasthoudt in de houder van de cryo-zuiger. Veeg het resterende overtollige medium af met Whatman-papier.
      5. Activeer de cryo-plunjer om de coverslip in de ethaanoplossing in de metalen kamer te plaatsen.
      6. Breng de coverslip snel over in de tube met bevroren aceton (1 coverslip/tube).
        OPMERKING: Gebruik niet dezelfde pincet voor het verzamelen van de monsters en voor het inzakken om besmetting met het kweekmedium te voorkomen. Wees extra voorzichtig bij het gebruik van dekfolies > 12 mm (dekdekkers met diameter 15 of 18 mm passen bij de drager, maar zijn mogelijk moeilijker om in te zakken). Tijdens deze stap is het mogelijk om de coverslip na het dompelen in vloeibare stikstof te dompelen om de overdracht in de Eppendorf te vergemakkelijken terwijl het monster bevroren blijft. Omdat aceton bevriest bij -96 °C, is het noodzakelijk om de coverslips op bevroren aceton te plaatsen voor de vriesvervanging.
    4. Vriessubstitutie en rehydratatie
      VOORZICHTIG: Werk onder de motorkap bij het manipuleren van monsters tijdens vriessubstitutie. Het stijgen van de temperatuur creëert druk in de buis, wat een buisexplosie kan veroorzaken.
      1. Incubeer de buizen in droogijs met een kantelhoek (ongeveer 45°).
      2. Beweeg 's nachts op een orbitale shaker. Plaats de gesloten doos op een shaker op 4 °C of RT om de temperatuur te laten stijgen van -180 °C naar -80 °C.
      3. Verwijder het grootste deel van het droogijs uit de doos (bewaar er gewoon een paar onderin de doos), laat de druk los in de buizen door ze snel te openen en dicht te doen, en blijf 45 minuten bewegen op de orbitale shaker om de temperatuur verder te laten stijgen van -80 °C naar -20 °C.
      4. Overbreng dekfolies naar een 12-wells plaat (of een andere handige container) met voorgekoelde zuivere ethanol (100%) oplossing. Incubeer 5 minuten en ga geleidelijk gehydrateerd als volgt: EtOH 100% (5 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 70% (3 min) - EtOH 50% (3 min) - EtOH 25% (3 min) - H2O 100%.
      5. Zet de dekfolies in PBS en oriënteer ze onder een microscoop (kras het oppervlak met een punt) zodat ze allemaal naar boven wijzen.
        OPMERKING: EtOH 100% en 95% worden opgeslagen bij -20 °C, EtOH 70% en EtOH 50% bij 4 °C en EtOH 25% en ddH20bij RT om de temperatuur verder te verhogen tot RT. Voor membraanlabeling is de toevoeging van PFA/GA (0,1%/0,02%) noodzakelijk in aceton- en rehydratatieoplossingen, behalve bij ddH2O.
  2. Uitbreiding
    1. Eiwitankering
      1. Maak een verse oplossing van 1,4% formaldehyde/2% acrylamide (FA/AA) in PBS één keer.
      2. Plaats coverslips in een 4/12 wellplaat gevuld met 0,5/1 mL AA/FA.
      3. Incubeer 3-5 uur op 37 °C zonder onrust.
        OPMERKING: De formaldehyde verbindt vrije aminegroepen van eiwitten aan acrylamide. Het overtollige acrylamide helpt de eiwitkruisbinding die normaal door formaldehyde wordt geïnduceerd te beperken en verankert de eiwitten aan het toekomstige expansiepolymeer. Eiwit-ankerstap verlenging naar overnight kan nodig zijn, afhankelijk van het biologische monster. In elk geval zal een langere incubatie geen invloed hebben op de volgende stappen. Vul vrije putten met water of plaats ze in een vochtige kamer om verdamping te voorkomen.
    2. Gelatie
      1. Ontdooi, APS (10%) en gelatieoplossing (natriumacrylaat 19%, acrylamide 10%, bis-acrylamide 0,1%, TEMED 0,5% verdund in 10x PBS) op ijs 10 minuten voor de gelatie.
      2. Bereid een vochtige kamer voor met een dunne laag nat weefsel en parafilm, bewaar deze vervolgens 10 minuten op 4 °C.
      3. Plaats de vochtige kamer op ijs.
      4. Haal de dekfolies uit de eiwitankeroplossing en verwijder de overtollige oplossing met een tissue papier (twee achter elkaar).
      5. Voeg APS (eindconcentratie 0,5%) toe aan de gelatieoplossing, vortex 2-3 seconden, en voeg 2 druppels 35 μL toe op de parafilm van de vochtige kamer.
      6. Bedek elke druppel met de dekmantel, de cellen wijzen naar de gelatieoplossing.
      7. Incubeer 5 minuten op ijs om gelpenetratie mogelijk te maken.
      8. Incubeer op 37 °C gedurende 30-60 minuten.
    3. Denaturatie
      1. Pons de gel met een biopsie-ponsinstrument (0,4 cm in diameter, Figuur 2D) en roer 10/15 minuten in een 6-wells plaat gevuld met 1 mL denaturatiebuffer totdat de gels loskomen van de dekmantels.
      2. Breng de gel over in een 1,5 mL microcentrifugebuis gevuld met verse denaturatiebuffer.
      3. Incubeer 1 uur en 30 uur bij 95 °C.
      4. Breng de gel over op ddH2O gedurende 10 minuten en herhaal dit drie keer om de denaturatiebuffer goed te wassen.
      5. Meet de gel met millimeterpapier of remklauw om de expansiefactor van de gel te evalueren.
      6. Breng de gel over naar PBS voor immunokleuring.
      7. Alternatief kun je de gels kortstondig bewaren in PBS-azide 0,02% bij 4 °C (Tabel 1) of bij -20°C voor langere opslag (Tabel 1). Voor langdurige opslag moeten gels worden geïncubeerd in meerdere baden water: glycerol 50% oplossing gedurende 2-3 uur onder roeren en geplaatst op -20 °C in een voldoende volume oplossing, dat aangepast moet worden aan de gelgrootte.
        OPMERKING: Gel kan intact blijven als dat gewenst is (Figuur 2D, E) (stap 2.2.3.1). Tot 5 stoten (gelijk aan een hele gel) kunnen in 1 buis worden verzameld (stap 2.2.3.2). Denaturatietemperatuur en -tijd moeten worden gerespecteerd (stap 2.2.3.3). Hoge hitte kan het openen van de buis veroorzaken, wat leidt tot denaturatiebufferverdamping en/of uitstoting van de gel. Zorg ervoor dat je safe-lock buizen gebruikt of ze afdekt. Het wassen van de gel na denaturatie moet in gedestilleerd water gebeuren, omdat PBS SDS-neerslag veroorzaakt, wat de efficiëntie van de wasbeurten beïnvloedt. Deze stap veroorzaakt een lichte uitbreiding van de gel die geen gevolgen heeft voor de volgende stappen van het protocol (stap 2.2.3.4). De glycerol kan verdund worden in PBS om ruimte te besparen bij grote gels. Voor 0,4 mm pons worden gels idealiter bewaard in een plaat met 12 putten gevuld met 3 mL water: glycerol.

3. Immunokleuring en uiteindelijke uitbreiding

  1. Vervang het PBS-bad voor nog eens 15 minuten incubatie.
  2. Snijd de hele gel in 4 gelijke stukken.
  3. Breng de gelstukken/ponsen over in een aangepaste drager (Figuur 2D, E) en incubeer met primaire antilichamen verdund in PBS-BSA 2% gedurende 3 uur tot nacht met agitatie (zie Tabel 2 en Tabel 3 voor gedetailleerde omstandigheden).
  4. Was gels 3x met PBS+Tween 0,1% voor 10 minuten RT met agitatie.
  5. Incubeer de gel in secundaire antilichamen en Hoechst in PBS-BSA 2% gedurende 3 uur tot een nacht met roering (zie Tabel 2 en Tabel 3 voor gedetailleerde omstandigheden).
  6. Was gel 3x met PBS+Tween 0,1% voor 10 minuten rout met agitatie.
  7. Optioneel: voer pan-labeling uit van het hele proteoom door gel te incuberen met NHS-ester (zie Tabel 2 voor details) in PBS gedurende 1 uur en 30 uur bij RT onder agitatie, daarna 3x wassen in PBS+Tween 0,1% gedurende 10 minuten.
  8. Zet de gel over op een aangepaste drager en ga verder met gelexpansie door te brouwen in gedestilleerd water (ddH2O).
    OPMERKING: De concentratie en het type wasmiddel (Tween, Triton-X100, Saponin) dat wordt gebruikt voor antilichaamwassen kan worden aangepast aan biologische monsters. Het water meerdere keren vervangen is cruciaal om sporen van zouten te elimineren, die volledige uitzetting voorkomen.

4. Montage en beeldvorming

  1. Bedekfolie coaten met poly-lysine (zie sectie 1.1) door coverslips af te dekken met ongeveer 200 μL poly-lysine, 1 uur bij RT te incuberen en 3x in ddH2O te wassen om het overtollige polylysine te verwijderen. Laat de dekfolies drogen en bewaar ze op 4°C tot gebruik.
  2. Plaats uitgebreide gels op niet-gecoate dekmantels in de beeldkamer om de oriëntatie van de monsters te controleren met behulp van een fluorescentiemicroscoop.
  3. Eenmaal georiënteerd, droog gel op een pluisvrij papier om overtollig water te verwijderen en te monteren op poly-lysinebedekkingsfolies (zie stap 1.1 voor protocol).
  4. Observeer monsters met een omgekeerde microscoop.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel belicht de resultaten van de combinatie van cryofixatie met expansiemicroscopie op twee verschillende soorten monsters: gekweekte zoogdiercellen en T. brucei-parasieten . Beide monsters waren ofwel cryo-gefixeerd of chemisch gefixeerd in 4% PFA vóór de expansie en immunokleuring. Let op dat andere chemische fixaties mogelijk geschikter zijn voor specifieke organellen (zoals methanol of glutaraldehyde) en dat alleen PFA, een veelvoorkomende chemische fixatie, is gekozen om te vergelijken met cryofixatie voor de eenvoud.

Menselijke RPE1 (retinale pigmentepitheelcellen) werden gekleurd op αβ-tubuline, ATP5a en Hoechst om respectievelijk microtubuli, mitochondriën en kernen te visualiseren. Daarnaast werden gels geïncubeerd met fluorescerende NHS-ester vóór de expansie, een kleurstof die reageert met de vrije aminegroepen en daardoor het hele cellulaire proteoom kleurt. We konden verschillende voordelen van cryofixatie zien ten opzichte van chemische fixatie, zoals reeds aangetoond23. Het meest opvallende kenmerk was dat cryofixatie het mitochondriale netwerk perfect bewaarde, zowel zichtbaar met NHS-ester als specifieke antilichamen tegen ATP-synthase subunit alpha (ATP5a) (Figuur 3A,B). Bovendien kunnen we, aangezien ATP5a gelokaliseerd is in het binnenste mitochondriale membraan, mitochondriale cristae oplossen met cryofixatie (Figuur 3B"). Integendeel, de PFA-fixatie maakte het niet mogelijk het mitochondriaal netwerk te behouden en daarom waren mitochondriale cristae in deze toestand niet zichtbaar (Figuur 3C). We kleurden ook microtubuli onder beide omstandigheden en toonden aan dat cryofixatie dynamische microtubuli zoals cytoplasmatische of astrale microtubuli beter behield (Figuur 3B-E). Stabiele microtubuli zoals in centriole en cilia, niet-membraneuze organellen bestaande uit 9-voudige microtubuli triplets/doublets, waren echter even goed bewaard gebleven, zo niet beter in PFA-gefixeerde cellen dan cryo-gefixeerde cellen (Figuur 3B', C'). Het is belangrijk op te merken dat cryofixatie, zoals het behouden van de integriteit van cellulaire eiwitten, mogelijk minder toepasbaar is op zeer dichte structuren zoals centriolen/cilia. Deze observatie is ook gedaan bij starre structuren zoals kernporiën, waar chemische fixatie een uitspoeling van cytoplasmatische eiwitten veroorzaakt, wat een betere observatie van kernporiestructuren mogelijk maakt23,32. Ten slotte konden we aantonen dat cryofixatie ook het kruisverbindingseffect van chemische fixatie omzeilt, wat het expansievermogen negatief beïnvloedt, zoals getoond bij mitotische spoelen, die bijna twee keer zo vergroot waren in cryo-gefixeerde toestand vergeleken met PFA (Figuur 3D, E).

Trypanosoma brucei-cellen werden gekleurd op TDH34 (Figuur 4A-D) om het unieke mitochondrion te visualiseren en voor BiP35 (Figuur 4E, F) om het endoplasmatisch reticulum te benadrukken. Daarnaast werden gels gekleurd met fluorescerende NHS-ester. Zoals waargenomen in menselijke cellen, behoudt cryofixatie gecombineerd met expansie de algehele cellulaire architectuur beter (Figuur 4B,E), met name deze twee membraanstructuren, in vergelijking met PFA-fixatie (Figuur 4C,D,F). Het microtubuli-cytoskelet van T. brucei is stijver en stabieler dan dat van menselijke cellen; daardoor werd er geen significant verschil waargenomen tussen PFA en cryofixatie. Bovendien verhindert de resolutielimiet van de U-ExM-techniek dat we individuele microtubuli (niet getoond) kunnen onderscheiden.

Over het algemeen pakt cryofixatie de beperkingen van klassieke chemische fixatie aan, zoals het behoud van membraanorganellen (mitochondriën, endoplasmatisch reticulum) en dynamische cytoskeletelementen (cytoplasmatische of astrale microtubuli). Bovendien zorgt cryofixatie niet voor een kruisverbinding tussen eiwitten, waardoor de expansiecapaciteit volledig behouden blijft, met name bij starre en dichte structuren.

Het beheersen van de kwaliteit van cryofixatie en -uitbreiding is essentieel om de cellulaire ultrastructuur van biologische monsters te behouden. Verschillende fouten kunnen leiden tot slechte fixatie en artefacten in de biologische monsters veroorzaken. Hier belichten we de meest voorkomende nadelen van cryofixatie en de gevolgen van slechte fixatie. Het meest voor de hand liggende artefact dat door cryofixatie wordt veroorzaakt, is het verschijnen van scheuren in het biologische monster (Figuur 5A), wat ook veel voorkomt in cryo-elektronenmicroscopie. Hoewel deze scheuren de intrinsieke ultrastructuur van organellen niet veranderen, zoals getoond in Figuur 5A (inzet) voor mitochondriën en microtubuli, kunnen ze leiden tot een verkeerde interpretatie van de biologische relevantie van deze scheuren en moeten ze zorgvuldig worden overwogen. Er is geen specifiek verband tussen manipulatieproblemen en het verschijnen/overvloed van deze scheuren.

Een specifiek kenmerk dat wijst op slechte fixatie is het verschijnen van "bubbelachtige structuren" in het celcytoplasma, wat wijst op de aanwezigheid van ijskristallen. Deze structuren zijn vooral zichtbaar bij NHS-esterkleuring (Figuur 5B). Ze gaan meestal gepaard met beperkte conservering van cytoskeletelementen, zoals golvende microtubuli (Figuur 5B), en een zeer slechte conservering van membraneuze organellen (mitochondriën in Figuur 5B). Deze kenmerken zijn getuige van belangrijke fixatieproblemen, die kunnen worden veroorzaakt door (i) een ongeschikt ethaanvolume en/of temperatuur (stappen 2.2.4-2.2.6 volgens protocol), (ii) niet-geleidelijke opwarming van het biologische monster (stappen 2.3 en 2.4 uit het protocol), en (iii) aanwezigheid van onzuiverheden in de vorstsubstitutieoplossing (stap 2.2.1 volgens protocol). Representatieve afbeeldingen van natriumacrylaatoplossingen die het verwachte aspect van 38% natriumacrylaat bruikbaar (kleurloos en doorschijnend [1]) of licht geel en doorschijnend [2]), of niet bruikbaar voor expansie (Geel/oranje en troebel [3]) benadrukken, worden weergegeven in Figuur 5C.

figure-results-1
Figuur 1: Cryo-ExM-workflow. (A) Levende cellen (menselijke cellen of T. brucei) worden cryo-gefixeerd door in vloeibaar ethaan te dompelen bij -180 °C en geïncubeerd in bevroren aceton op droogijs. Vriessubstitutie wordt uitgevoerd door een constante en langzame temperatuurstijging van -180 °C tot -80 °C door incubatie op droogijs, wat acetonvloeibaarheid (-96 °C) veroorzaakt, en vervolgens van -80 °C naar -20 °C door incubatie zonder droogijs. Rehydratatie wordt uitgevoerd door opeenvolgende baden van ethanol gemengd met een halve maanconcentratie van gedestilleerd water, samen met een constante temperatuurstijging van -20 °C tot kamertemperatuur. (B) Gerehydrateerde monsters worden vervolgens als volgt uitgevoerd voor expansie: Monsters worden geïncubeerd in een mengsel van acrylamide: formaldehyde (AA/FA) bij 37 °C, waardoor de eiwitten kunnen worden verankerd aan het opzwellbare polymeer van acrylamide, bis-acrylamide en natriumacrylaat (AA/BIS/SA), waarbij het laatste de expansie-eigenschap aan de gel verleent. Monsters worden geïncubeerd in NaCl/SDS bij 95 °C om eiwit-eiwitinteractie destabilisatie en zachte denaturatie uit te voeren. Deze stap is essentieel voor isotrope expansie. Monsters worden vervolgens geïnomfistikeerd met gewone primaire en secundaire antilichamen en uiteindelijk uitgebreid in gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Cryo-plunging en expansie-opstelling. (A) Cryo-plunjer in geactiveerde positie (bovenste paneel) en naar beneden (onderste paneel). De pijl geeft de PUSH-knop aan om het induiken te activeren. (B) Cryo-dompelopstelling klaar voor inzinking, met het niveau van vloeibare stikstof (N2) dat geschikt is voor cryofixatie, aangegeven door de hoogte van het schuim rondom de dewar (rode pijlpunt). De verwijderbare spin wordt aangegeven met asterisken. (C) Illustratie van de belangrijkste stappen van cryo-plunging vanaf het vasthouden van de coverslip (linksboven), de positie van de coverslips in vloeibare ethaan-dewar (linksonder), en van de verzamelbuis voor vriessubstitutie (rechts). (D) Illustratie van de 'gelpunching'-methode voor immunokleuring in menselijke monsters. Gepolymeriseerde gel op dekfolies (1) wordt gesneden met een specifieke biopsiepunch (P), waarmee een gelpunch van 0,4 cm diameter (2) ontstaat, die kan worden gekleurd in een siliconenplaat (rechterpanelen) om de hoeveelheid antilichaam te verminderen. (E) Illustratie van de 'gel cutting'-methode voor immunokleuring in menselijke en T. brucei-monsters . Gepolymeriseerde en gedenatureerde gels (1) worden in 4 gelijke stukken gesneden (2), waardoor hun incubatie mogelijk is in een 12-wellplaat met antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Vergelijking van cryofixatie en PFA-fixatie in menselijke cellen. (A) Draaiende schijfafbeelding van cryo-gefixeerde en uitgebreide RPE1-cellen, gekleurd op αβ-tubulinen (cyaan), mitochondriale ATP-synthase subunit 5a (ATP5a, geel) en NHS-ester (rood/grijs), wat het uitstekende behoud van zowel membraangebaseerde organellen als cytoskeletelementen, waaronder centriolen en trilharen (pijlpunt) aantoont. Schaalbalk: 10 μm. (B, C) Draaiende schijfafbeelding van cryo-gefixeerde (B) en PFA-gefixeerde (C) RPE1-cel gekleurd op αβ-tubulinen (cyaan), mitochondriale ATP5a (geel) en Hoechst (magenta) met nadruk op primaire cilium (pijlen, B', C') en mitochondriën (B", C"). Als cryo- en PFA-fixatie centriolen en primaire cilia evenzeer behouden, overtreft cryofixatie veel meer dan PFA wat betreft behoud van mitochondriale structuur (B", C"- rode pijlpuntjes geven mitochondriale cristae aan die alleen zichtbaar zijn onder cryo-gefixeerde omstandigheden). Schaalbalken: respectievelijk 1, 1 en 2,5 μm. (D,E) Draaiende schijfafbeelding van cryo-gefixeerde (D) en PFA-gefixeerde (E) mitotische RPE1-cel gekleurd voor αβ-tubulinen geel/grijs), mitochondriale ATP5a (magenta) en Hoechst (BOP blauw) toont aan dat cryofixatie een betere expansie van de mitotische spil mogelijk maakt (rode pijlpunten) en betere mitotische spindelmicrotubuli behoudt (rode pijlen). Metingen van de lengte van de mitotische spil: respectievelijk 12 μm en 7 μm voor cryofixatie en PFA-fixatie. Schaalbalken: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Vergelijking van Cryofixatie en PFA-fixatie bij Trypanosoma brucei. (A, B) Confocale beelden van cryo-gefixeerde en uitgebreide T. brucei procyclische cellen, gekleurd op mitochondriale threoninedehydrogenase (TDH, geel) en NHS-ester (rood/grijs), wat het uitstekende behoud van het unieke mitochondrion en de algemene structuur van de cel aantonen. Schubbalken: 5 μm. (C, D) Confocale afbeelding van PFA-gefixeerde en uitgebreide T. brucei procyclische cellen, gekleurd op TDH (geel) en NHS-ester (rood/grijs). Door het behoud van mitochondriale structuur en het netwerk te vergelijken, presteert cryofixatie beter dan PFA-fixatie. Schaalbalken: 5 μm. (E, F) Confocale beelden van cryo-gefixeerde (E) en PFA-gefixeerde (F) en uitgebreide T. brucei procyclische cellen gekleurd op endoplasmatisch reticulummarker BiP en NHS-ester (grijs), wat aantoont dat cryofixatie betere uitbreiding en behoud van het endoplasmatisch reticulum mogelijk maakt. Schaalbalken: 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Problemen met cryo-fixatie. (A,B) Draaiende schijfbeelden van cryo-gefixeerde en uitgebreide RPE1, gekleurd voor αβ-tubulinen (cyaan), mitochondriale ATP-synthase subeenheid 5a (ATP5a, geel) en NHS-ester (rood) die klassieke effecten van cryofixatie tonen: scheuren (A, pijlen) en bellen (B, pijl). Hoewel scheuren de ultrastructuren van organellen (A) niet aantasten, wijst de aanwezigheid van bellen in het cytoplasma (B) op een slechte fixatie en verandert het het behoud van subcellulaire organellen (mitochondriën en microtubuli, insets) aanzienlijk. Schaalbalken: 5 μm en 2 μm (insets). (C) Afbeelding met verschillende natriumacrylaatoplossingen die het verwachte aspect van 38% natriumacrylaat bruikbaar benadrukt (kleurloos en doorschijnend (1) of licht geel en doorschijnend (2)), of niet bruikbaar voor expansie (Geel/oranje en troebel (3))). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Opslagvoorwaarden voor oplossingen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Lijst van antilichamen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Immunokleuringsaandoeningen Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel presenteren we een gedetailleerd protocol dat cryofixatie integreert met expansiemicroscopie (Cryo-ExM), waarmee een robuuste benadering wordt geboden voor het visualiseren van subcellulaire compartimenten, terwijl artefacten die vaak met chemische fixatie worden geassocieerd, zoals structurele vervorming en antigeenverlies, worden vermeden. Door de cellulaire architectuur in een bijna-native toestand te behouden, elimineert Cryo-ExM de noodzaak van uitgebreide fixatieoptimalisatie, waardoor een nauwkeurigere eiwitlokalisatie mogelijk is.

Hoewel het protocol over het algemeen eenvoudig is, vereisen verschillende cruciale stappen bijzondere aandacht om succesvolle resultaten te garanderen. De cryo-onderdompelingsstap is bijzonder gevoelig, omdat het zowel specifieke materialen vereist (zie Materiaaltabel) als een zekere mate van behendigheid, vooral bij het hanteren van de vloeibare ethaanvulling, wat een mogelijke valkuil vormt. Voorafgaande kennis van cryofixatietechnieken is voordelig; Wij raden aan om bij het toepassen van deze methode te overleggen met een cryo-EM-specialist of een elektronenmicroscopie-facilitair manager. Tijdens de expansiefase is het essentieel strikt om de denaturatievoorwaarden te volgen, omdat afwijkingen zowel de monsterconservering als de expansie-efficiëntie kunnen aantasten. Tot slot is het handhaven van goede opslagomstandigheden voor alle reagentia (zie Tabel 1) cruciaal om reproduceerbaarheid en consistente beeldkwaliteit over de tijd te waarborgen.

Dit artikel belicht verschillende belangrijke voordelen van het Cryo-ExM-protocol. Opmerkelijk is dat cryofixatie het verlies van oplosbare eiwitten minimaliseert, een veelvoorkomende beperking van conventionele fixatiemethoden, en de membraanintegriteit beter behoudt, waardoor de nauwkeurigheid van cellulaire beeldvorming wordt verbeterd. Een belangrijke kracht van deze techniek ligt in de compatibiliteit met standaard breedveld- en confocale microscopen. In tegenstelling tot veel andere superresolutiemethoden die gespecialiseerde en vaak dure apparatuur vereisen, kan ExM worden geïmplementeerd met conventionele fluorescentiemicroscopen. Een ander belangrijk voordeel van ExM is de veelzijdigheid. De techniek is met succes toegepast op een breed scala aan biologische monsters – van individuele cellen tot complexe weefsels – en toont daarmee de brede toepasbaarheid aan op diverse onderzoeksgebieden. Dit artikel benadrukt specifiek de compatibiliteit van dit protocol met twee zeer verschillende modelsystemen: T. brucei en menselijke cellen, maar merkt op dat een groter of complexer monster hoogdrukbevriezing vereist, aangezien handmatig inzakken niet voldoende is om het hele monsterte behouden. Expansiemicroscopie heeft het vermogen om nanoschaalcellulaire structuren te visualiseren die voorheen moeilijk of onmogelijk waren om op te lossen, revolutionair gemaakt, wat doorbraken mogelijk maakte op gebieden zoals celbiologie, ontwikkelingsbiologie en neurowetenschap36. In het bijzonder is de methode transformerend geweest in de parasitologie, een vakgebied waar conventionele lichtmicroscopie vaak tekortschiet. Voor veel parasieten is ultrastructuurexpansiemicroscopie (U-ExM) een gamechanger gebleken, waardoor hoogresolutiebeeldvorming van ingewikkelde organellen zoals de apicoplast, conoïde en cytoskeletale elementen met ongekende helderheidmogelijk is. Deze vooruitgang toont de kracht van U-ExM aan om voorheen ontoegankelijke structurele details bloot te leggen, waardoor nieuwe ontdekkingsmogelijkheden openen in celbiologie, neurowetenschap en parasietbiologie, en de zoektocht naar potentiële therapeutische doelwitten worden vergemakkelijkt. Bovendien blijft ExM compatibel met veelgebruikte immunofluorescentie-antilichamen, wat de integratie in bestaande workflows vergemakkelijkt. In de meeste gevallen werken antilichamen die routinematig worden gebruikt voor fluorescentiemicroscopie of western blotting effectief op uitgebreide monsters, waardoor gespecialiseerde reagentia overbodig zijn. Deze toegankelijkheid maakt Cryo-ExM aantrekkelijk voor veel biologische onderzoekslaboratoria, omdat het beeldvorming met hoge resolutie biedt zonder de kosten of complexiteit die gewoonlijk gepaard gaan met geavanceerde beeldvormingssystemen.

Ondanks zijn voordelen heeft ExM bepaalde beperkingen. Een groot nadeel is het aanzienlijke gebruik van antilichamen, wat kostbaar of problematisch kan zijn, vooral bij zelfgemaakte antilichamen die in beperkte hoeveelheden verkrijgbaar zijn. Hier is waarom we deze protocolstrategie voorstellen om het volume antistoffen dat wordt gebruikt voor immunokleuring te verminderen (Figuur 2D, E). Het uitbreidingsproces verhoogt ook de dikte van het monster, wat het vermogen om diepere structuren te visualiseren kan beïnvloeden vanwege de beperkingen van de werkafstand van standaard microscoopobjectieven. Deze beperking kan bijzonder uitdagend zijn bij het bestuderen van grotere, dikkere monsters, waarbij diepere gebieden mogelijk niet effectief worden afgebeeld met conventionele microscopen. Daarnaast kan weefselexpansie soms mechanische vervormingen veroorzaken, waardoor zorgvuldige validatie- en correctiestappen nodig zijn om nauwkeurige ruimtelijke weergaven te garanderen. Ten slotte is klassieke ExM strikt afhankelijk van monsterfixatie, die kan variëren van biologische monsters of subcellulaire structuur om te observeren. Hoewel centriolen en cilia stabiel genoeg zijn om zonder prefixatie te worden uitgedund, vereisen cellulaire organellen verschillende soorten chemische fixatie (PFA, methanol, glutaraldehyde), wat artefacten kan creëren en het observeren van meerdere cellulaire structuren samen kan verhinderen. Ten slotte, aangezien ExM compatibel is met verschillende superresolutie-beeldvormingsmodaliteiten zoals Structured Illumination Microscopy (SIM)39, Stimulated Emission Depletion Microscopy (STED)40, direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (dSTORM)41 en recenter light-sheet microscopy42, biedt de in deze studie beschreven aanpak een veelzijdig hulpmiddel om cellulaire structuren met hoge precisie te onderzoeken. Een recente studie combineerde cryofixatie met iteratieve expansiemicroscopie32, waardoor de grenzen van resolutie verder werden opgezocht en de natuurlijke toestand van de cel zoveel mogelijk behouden bleef dankzij cryofixatie.

Door deze geavanceerde beeldvormingstechnieken mogelijk te maken om cellen in hun oorspronkelijke staat vast te leggen, effent Cryo-ExM de weg voor toekomstige studies van ingewikkelde cellulaire processen met ongekende helderheid. Deze benadering opent ook nieuwe mogelijkheden voor correlatieve licht- en elektronenmicroscopie (CLEM), waardoor het potentieel voor multimodale beeldvorming verder wordt vergroot.

Samenvattend vertegenwoordigt ExM een krachtig hulpmiddel voor superresolutiebeeldvorming met brede toepasbaarheid op diverse biologische monsters. De compatibiliteit met standaardmicroscopen, de veelzijdigheid in monstertypes en de relatief eenvoudige implementatie maken het een aantrekkelijke keuze voor veel laboratoria. Met voortdurende vooruitgang in de techniek verwachten we verdere verbeteringen in resolutie, antilichaamgebruik en monsterbehandeling die de mogelijkheden zullen vergroten en het nog toegankelijker maken voor een breed scala aan biologische toepassingen. Cryo-ExM staat in het bijzonder als een veelbelovende vooruitgang, die een manier biedt om cellulaire structuren met uitzonderlijke details te bestuderen terwijl hun natuurlijke integriteit behouden blijft, en uiteindelijk de grenzen van moderne microscopie verlegt.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs geven geen belangenconflict aan

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Jennifer Vieillard voor het kritische advies en het lezen van het manuscript. Wij erkennen de bijdrage van SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL) faciliteit: CIQLE (lid van LyMIC) voor het verkrijgen van beelden van RPE1-cellen. Wij danken Mónica Fernández Monreal van het BIC voor het geven van toegang tot de ontstopper en ethaan en het Bordeaux Imaging Centre, een service-eenheid van het CNRS-INSERM, en de Universiteit van Bordeaux, lid van de nationale infrastructuur France BioImaging, voor de verwerving van T. brucei-beelden . Dit werk werd ondersteund door het CNRS (T. brucei) en INSERM (menselijke cellen) en gefinancierd door de volgende instellingen: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 tot M.B), de LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) en Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H werd ondersteund door ANR-OIL financiering (ANR24-CE15-2171-01 aan L.R), L.K werd ondersteund door ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 aan B.D)

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5ml tube metallic holderDominique DutscherQB-E5Freeze substitution step
620 Manual Cryo-plungerRHOSThttps://rhost-em.com/Cryo-fixation step
Acetone 99.8% AcroSealAcros Organicscat. no. 67-64-1 Freeze substitution step
Acrylamyde 40% (AA)Sigma-AldrichA4058Expansion procedure  (anchoring)
Acrylic acid Sigma-Aldrich8.00181 Expansion procedure (polymer)
Ammonium persulfate (APS)Thermo Fisher17874Expansion procedure (polymer)
Biopsy punchDominique DutscherPUK-40Needed for cutting the gel prior to denaturation 
BSASigma-AldrichP1379Immunostaining 
Cell chamber AttofluorInvitrogenA7816Imaging chamber adapted to 24mm coverslips for imaging
Cell chamberLife Imagning Service10900Imaging chamber adapted to 18mm coverslips for imaging
Coverslips 12 mm Dominique Dutscher100040Growing cells / attaching T.brucei
Coverslips 24 mm Dominique Dutscher900547Imaging 
Coverslips 18mmVWR631-0153Imaging 
Ethane gaz Linde Gaz88888DENeeded for cryo-fixation
Formaldehyde 36.5–38% (FA)Sigma-Aldrich F8775Expansion procedure  (anchoring)
Glutaraldhehyde 25% (GA)Sigma-Aldrich G5882Freeze substitution step
Glycerol Euromedex EU3550Long-term gel storage 
Liquid nitrogen Linde Gaz2200975Needed for cryo-fixation (cooling down the system)
Microtube clear-lock 5 ml Dominique Dutscher390932ANeeded for freeze substitution
Needle 18GDominique Dutscher050123BNeeded to collect Acetone
N,N-methylbisacrylamide 2% (BIS)Sigma-AldrichM1533, SIGMAExpansion procedure (polymer)
Paraformaldehyde 16% (PFA)EMScat. no. 15710Freeze substitution step
Poly-D-LysineSigma-AldrichP1024Coating coverslips for sample / imaging 
Poly-L-LysineSigma-AldrichP1274Coating coverslips for sample / imaging 
Pressure reduicer Linde GazCPLH0SJ-LIN224Pressure reduicer allowing ethane distrubtion (cryo-fixation)
Seringe Terumo 10 mlDominique Dutscher50132Needed to collect Acetone
Silicone Elastomer kitDow4001834Kit for the preparation of silioned-well plates (immunostaining) 
Sodium Acrylate 97-99% (SA)Sigma-Aldrich408220Expansion procedure (polymer)
AK ScientificR624Expansion procedure (polymer)
Sodium dodecyl sulfateEuromedexEU0660Expansion procedure (denaturation)
Tetramethylethylendiamine (TEMED)Thermo Fisher17919Expansion procedure (polymer)
Tubings Thermo Scientific8060-0060Tubings for ethane distrubtion (cryo-fixation)
Tween-20Euromedex1005-7Immunostaining 
Tweezers Dumont n°5 FineScienceTools11255-20Manipulation of the coverslips 

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacquemet, G., et al. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. J Cell Sci. 133 (11), jcs240713(2020).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Laporte, M. H., et al. Time-series reconstruction of the molecular architecture of human centriole assembly. Cell. 187 (9), 2158-2174 (2024).
  4. Steib, E., et al. WDR90 is a centriolar microtubule wall protein important for centriole architecture integrity. Elife. 9, e57205(2020).
  5. Le Borgne, P., et al. The evolutionary conserved proteins CEP90, FOPNL, and OFD1 recruit centriolar distal appendage proteins to initiate their assembly. PLoS Biol. 20 (9), e3001782(2022).
  6. Bertiaux, E., et al. Expansion microscopy provides new insights into the cytoskeleton of malaria parasites including the conservation of a conoid. PLoS Biol. 19 (3), e3001020(2021).
  7. Liffner, B., et al. Atlas of Plasmodium falciparum intraerythrocytic development using expansion microscopy. Elife. 12, RP88088(2023).
  8. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 134 (5), jcs254300(2021).
  9. Corrales, R. M., et al. Tubulin detyrosination shapes Leishmania cytoskeletal architecture and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (3), e2415296122(2025).
  10. Brunet, M., et al. Drosophila Alms1 proteins regulate centriolar cartwheel assembly by enabling Plk4-Ana2 amplification loop. EMBO J. 44 (8), 2396(2025).
  11. Langner, E., et al. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of mouse and human kidneys for analysis of subcellular structures. Cytoskeleton (Hoboken). 81 (11), 618-638 (2024).
  12. Mercey, O., et al. The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration. PLoS Biol. 20 (6), e3001649(2022).
  13. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Rep Methods. 2 (10), 100311(2022).
  14. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  15. Yu, C. J., Orozco Cosio, D. M., Boyden, E. S. ExCel: super-resolution imaging of C. elegans with expansion microscopy. Methods Mol Biol. 2468, 141-203 (2022).
  16. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  17. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  18. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 34 (9), 973-981 (2016).
  19. Schnell, U., et al. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  20. Dubochet, J. Cryo-EM-the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  21. Neuhaus, E. M., et al. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 121 (3), 326-342 (1998).
  22. Kellenberger, E. The potential of cryofixation and freeze substitution: observations and theoretical considerations. J Microsc. 161 (Pt 2), 183-203 (1991).
  23. Laporte, M. H., et al. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nat Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  24. Hinterndorfer, K., et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast. J Cell Sci. 135 (24), jcs260240(2022).
  25. Mikus, F., Dey, G. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol. 2862, 47-59 (2025).
  26. Ben Chaabene, R., et al. Toxoplasma gondii rhoptry discharge factor 3 is essential for invasion and microtubule-associated vesicle biogenesis. PLoS Biol. 22 (8), e3002745(2024).
  27. Shah, H., et al. Life-cycle-coupled evolution of mitosis in close relatives of animals. Nature. 630 (8015), 116-122 (2024).
  28. Klena, N., et al. An in-depth guide to the ultrastructural expansion microscopy (U-ExM) of Chlamydomonas reinhardtii. Bio Protoc. 13 (17), e4792(2023).
  29. van den Hoek, H., et al. In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains. Science. 377 (6605), 543-548 (2022).
  30. Mikus, F., et al. Charting the landscape of cytoskeletal diversity in microbial eukaryotes. bioRxiv. , (2024).
  31. Petrich, A., et al. Expanding insights: harnessing expansion microscopy for super-resolution analysis of HIV-1-cell interactions. Viruses. 16 (10), 1610(2024).
  32. Louvel, V., et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nat Commun. 14 (1), 7893(2023).
  33. Lemaître, F., et al. Unveiling the molecular architecture of T cells and immune synapses with cryo-expansion microscopy. bioRxiv. , (2025).
  34. Millierioux, Y., et al. De novo biosynthesis of sterols and fatty acids in the Trypanosoma brucei procyclic form: carbon source preferences and metabolic flux redistributions. PLoS Pathog. 14 (5), e1007116(2018).
  35. Bangs, J. D., et al. Molecular cloning and cellular localization of a BiP homologue in Trypanosoma brucei: divergent ER retention signals in a lower eukaryote. J Cell Sci. 105 (Pt 4), 1101-1113 (1993).
  36. Dolgin, E. 'Expansion microscopy' turns ten: how a tissue-swelling method brought super-resolution imaging to the masses. Nature. 637 (8046), 752-754 (2025).
  37. Tosetti, N., et al. Essential function of the alveolin network in the subpellicular microtubules and conoid assembly in Toxoplasma gondii. Elife. 9, e56635(2020).
  38. Gorilak, P., et al. Expansion microscopy facilitates quantitative super-resolution studies of cytoskeletal structures in kinetoplastid parasites. Open Biol. 11 (9), 210131(2021).
  39. Halpern, A. R., et al. Hybrid structured illumination expansion microscopy reveals microbial cytoskeleton organization. ACS Nano. 11 (12), 12677-12686 (2017).
  40. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  41. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  42. Daetwyler, S., Fiolka, R. P. Light-sheets and smart microscopy, an exciting future is dawning. Commun Biol. 6 (1), 502(2023).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Superresolutie beeldvormingcryofixatiefluorescentiemicroscopiehydrogel inbeddingconfocale microscopieultrastructuur expansiemicroscopiemonsterfixatieimmuunkleuringsprotocolcellulaire architectuur

Gerelateerde artikelen