De huidige 2,3,5-Trifenyltetrazoliumchloride (TTC) test introduceert een verfijnd TTC-kleuringsprotocol dat de analyse van myocardletsel met microscopische resolutie mogelijk maakt, waardoor hoogwaardige beelden worden geproduceerd die een nauwkeurige en betrouwbare beoordeling van infarctgrootte en levensvatbaarheid van cardiomyocyten op cellulair niveau mogelijk maken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een microscopische 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride-assay voor nauwkeurige en betrouwbare analyse van myocardschade
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
In dit protocol presenteren we een verfijnde 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC)-gebaseerde methode voor de nauwkeurige en betrouwbare analyse van myocardinfarct (MI) bij cellulaire resolutie. Dit protocol omvat een tweestaps TTC-kleuringsprocedure uitgevoerd op geïnfarcterde harten 24 hpost-MI: perfusie, waarbij een 1% TTC-oplossing retrograde wordt doorgeperst via een aortacanule, en onderdompeling, waarbij het hart vervolgens 's nachts wordt geïncubeerd in TTC-oplossing bij 4 °C. Na de kleuring wordt het hart ingebed in een OCT-verbinding en transversaal gecryocuteerd in plakken van 50 μm dikke stukken met intervallen van 100 μm. Na een fixatieproces van 24 uur met Zamboni's fixatief wordt een scherpe en duidelijke grens tussen levensvatbaar myocard (dieprood) en necrotisch weefsel (geel) onder microscopisch onderzoek zichtbaar. Opmerkelijk is dat deze microscopische TTC-test het mogelijk maakt om MI-detectie mogelijk te maken, niet alleen in de acute fase (24 uur na de MI), maar ook over een verlengd tijdsbestek van meer dan 7 dagen. Omdat de microscopische TTC-assay meerlaagse beelden genereert (80 plakjes per hart), hebben we een robuust, kleurgebaseerd semi-geautomatiseerd algoritme ontwikkeld dat snelle en efficiënte analyse van grote beelddatasets mogelijk maakt en de wereldwijde infarctgrootte binnen enkele minuten kwantificeert. Met deze verbeteringen verfijnt de huidige aanpak het TTC-kleuringsproces aanzienlijk en biedt het een breed toepasbaar en waardevol hulpmiddel voor laboratoria die hartischemische schade onderzoeken.
Inleiding
In de afgelopen twee decennia is cardioprotectie blijven nastreven als een belangrijke strategie om cardiomyocyten te behouden na ernstige ischemische insulties aan het hart1. In zowel experimentele als klinische omgevingen is de uiteindelijke omvang van myocardletsel een cruciale maatstaf om de effectiviteit van cardioprotectieve interventies te evalueren2. Daarom is een betrouwbare en nauwkeurige beoordeling van de grootte van infarcten zeer wenselijk en fundamenteel belangrijk.
In knaagdiermodellen was het standaardprotocol voor het beoordelen van de groott....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten zijn goedgekeurd door de LANUV van Nordrhein-Westfalen, Duitsland, en uitgevoerd volgens de ARRIVE-richtlijnen en de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Alle benodigde apparatuur en chemicaliën worden vermeld in de Materiaaltabel.
1. Het opzetten van een Langendorff retroperfusiesysteem
OPMERKING: Het systeem bestaat uit een tweegangige, driewegstopkraan die is verbonden met een aortacanule gemaakt van een 20-gauge stompte naald en twee infusiepoorten, één voor de wasoplossing (fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De belangrijkste stappen bij het uitvoeren van microscopische TTC-kleuring worden geïllustreerd in Figuur 1. Na twee rondes TTC-kleuring werd er een duidelijk geponst patroon zichtbaar op het oppervlak van het hart. Seriële snijden van het gehele hart met intervallen van 100 μm leverde ongeveer 80 weefseldoorsneden op, waarbij de ligatieplaats zich rond de60e snee bevond. In elk deel was de dieprode kleuring van le.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Myocardinfarct (MI), als gevolg van langdurige myocardischemie, blijft een groot wereldwijd gezondheidsprobleem, omdat ischemische schade vaak de contractiele functie van het hart aantast die nodig is voor een effectieve bloedcirculatie. In de afgelopen decennia zijn er aanzienlijke inspanningen geleverd om interventies of verbindingen te identificeren die de hartweerstand tegen ischemische stress1 versterken. Hoewel alternatieve surrogaat-eindpunten, zoals enzyme.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door FoKo 23/2013 en door het Cardiovasculair Onderzoeksinstituut Düsseldorf (CARID).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.25x objectief | Olympus | PlanApo 1.25X/0.04 | Beeldvorming |
| 10 mL spuiten | B.Braum | 4617100V | Retro-perfusie |
| 2,3,5-trifenyltetrazoliumboorchloride | Milipore | 1.08380.0100 | Chemische stoffen |
| 20 G canule | BD | 305895 | Retro-perfusie |
| 3 mL spuiten | B.Braum | 4617022V | Retro-perfusie |
| 3-weg stopcock | B.Braum | 16494C | Retro-perfusie |
| Aquamount | BDH | 362262H | Cryosectomie |
| Balans | Ohaus | N/A | Wegen van chemicaliën |
| Binoculair microscoop | Leica | MZ6 | Canule |
| C57BL/6J | Janvier | N/A | Dieren |
| Camera | Olympus | UC30 | Beeldvorming |
| Dekglasjes | Epredia | BB02400500A113MN20 | Cryosectomie |
| Cryostaat | Leica | M850 | Cryosectomie |
| Dubbel gedistilleerd water | MIlipore | N/A | Oplossen van chemicaliën |
| Fijne dissectieschaart | AESCULAP | BC702R | Chirurgische instrumenten |
| Fijne microdissectiepincet | AESCULAP | FM001R | Chirurgische instrumenten |
| Glazen microscoopglaasjes | Engelbrecht | 11102 | Cryosectomie |
| ImageJ | NIH | 1.54g | Beeldverwerking |
| Isofluraan | Piramal | 14150097146754 | Chemische stoffen |
| Isopropanol | Roth | 0733.1 | Chemische stoffen |
| Lichtmicroscoop | Olympus | BX61 | Beeldvorming |
| Microdissectiepincet | F.S.T | 11152-10 | Chirurgische instrumenten |
| OCT-compound | Sakura | 4583 | Chemische stoffen |
| Petrischaal | Therno Scientific | 172931 | Retro-perfusie |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Roth | 9143.1 | Chemische stoffen |
| Rstudio | Posit Software | 2024.09.0 | Beeldverwerking |
| Zijdesnaad | F.S.T | 18020-60 | Retro-perfusie |
| Software | Olympus | CellSens V3.2 | Beeldvorming |
| Roestvrijstalen dissectieschaart | AESCULAP | BC257R | Chirurgische instrumenten |
| Zamboni-oplossing | Morphisto | 12773.0050 | Chemische stoffen |
Referenties
- Bolli, R., Becker, L., Gross, G., Mentzer, R., Balshaw, D., et al. Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy. Circ Res. 95 (2), 125-134 (2004).
- Murphy, E., Steenbergen, C. Mechanisms underlying acute pro....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
