Methodenartikel

Lactyloom gebaseerd op massaspectrometrie en bevestiging van lactyleiwitten

263 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68597

⸱

24 april 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode waarbij slokdarmcelcelcelcellijnen worden gebruikt als voorbeeld om eiwitlactylatie te analyseren. Het proces omvat het analyseren van eiwitlactylatie vanuit celkweek tot bevestiging van kandidaten, inclusief lactylatie-gebaseerde massaspectrometrieanalyse en bevestiging door immunoprecipitatie.

Samenvatting

Eerst geïdentificeerd in 2019, is lactylatie, een nieuwe post-translationele modificatie (PTM) op lysineresiduen, sindsdien aangetoond interessant te zijn in meerdere pathologieën en fysiologische contexten. Het bezit twee isomeren (L- en D-lactylatie) en staat erom bekend complexvorming, cellulaire lokalisatie of stabiliteit van doeleiwitten te veranderen. Dit protocol beschrijft een methode voor het analyseren van lactylatie van celkweek tot bevestiging van potentiële lactylatie-doelwitten, met behulp van de TE11 oesofageale plaveiselcelcel als voorbeeld. Het volgende protocol zal details geven over de identificatie van lactylatie-eiwitten via L-lactyllysine (KL-LA)-specifieke immunoprecipitatie (IP) van peptiden voor massaspectrometrie (MS)-analyse: (1) eiwitextractie, (2) eiwitreductie, alkylering en vertering, (3) eiwitzuivering en peptideconcentratie, (4) IP met KL-LA-kralen en (5) concentratie van KL-LA-peptiden . Na deze stappen worden analyses van de MS-ruwe data uitgevoerd om lactylatieve plaatsen te identificeren, en wordt bevestiging van deze vermoedelijke lactylereiwitten door IP beschreven. Met deze methode kan een bereik van 100 tot 500 peptiden worden geïdentificeerd en kunnen lactylatie-eiwitten van belang worden bevestigd. Samenvattend heeft het bestuderen van lactylatie-eiwitten het potentieel om ons begrip van PTM-gedreven celsignalering bij zowel normale als ziekteverschijnselen te vergroten.

Inleiding

Lactylatie is een posttranslationele modificatie (PTM) op lysineresiduen met behulp van metabolieten afkomstig van glycolyse. L-lactyl-CoA en lactoylglutathion zijn substraten van respectievelijk L-lactylatie (KL-LA) en D-lactylatie (KD-LA), 1,2. L-lactylatie is een enzymatisch proces waarbij enzymen zoals acetyltransferase 3,4 betrokken zijn. Daarentegen is D-lactylatie een niet-enzymatisch proces door nucleofiele substitutie tussen lactoylglutathion en een lysineresidu5. Als dynamisch proces zijn deacetylasen zoals HDAC1-3 geïdentificeerd als gummiddelen van lactylatie6. Sinds de ontdekking in 2019is aangetoond dat het interessant is in meerdere pathologieën en fysiologische contexten2. Deze PTM werd voor het eerst geïdentificeerd op histonen door de observatie van een massaverschuiving van 72,021 Da met behulp van high-performance liquid chromatography (HPLC)-tandem mass spectrometry (MS/MS) analyse3. Sindsdien is lactylatie gedetecteerd op andere eiwitten dan histonen en is aangetoond dat het de functionele diversiteit, lokalisatie of stabiliteit van de gemodificeerde eiwitten beïnvloedt, afhankelijk van de context 7,8,9,10.

Aangezien PTM's vaak in lage abundantievoorkomen en deel uitmaken van een dynamisch en tijdelijk proces12, is verrijking van de onderzochte PTM door immunoprecipitatie (IP) vereist. Daarna wordt MS vaak gebruikt om het PTM-gekoppelde proteoom op verteerde peptiden te beschrijven, zoals fosfoproteoom of ubiquitinatieprofiel11. Net als bij andere PTM's, lactylome of verrijkte-lactylatiepeptiden, is MS-gebaseerde proteomica de gouden standaard methode om nieuwe lactylatieplaatsen te identificeren.

Dit protocol beschrijft de identificatie van KL-LA verrijkte peptiden via MS-gebaseerde proteomics, gevolgd door de bevestiging van lactylatie-eiwitten door immunoprecipitatie. Met slokdarm plaveiselcelcelcelcel (ESCC) cellijnen als voorbeeld beschrijven we een protocol om lactylatie-eiwitten naar beneden te halen voor MS-gebaseerde identificatie van lactylatie-doelen en hun daaropvolgende bevestiging door IP.

Protocol

Omdat PTM's een dynamisch en tijdelijk proces zijn, is het belangrijk om vooraf vast te stellen welke confluentie het totale lactylatieniveau optimaal is, met behulp van flowcytometrie of Western blotting met een anti-KL-LA antilichaam. Een confluentie van 70%-80% is bijvoorbeeld te verkiezen in ESCC-cellijnen voor lactylome- en IP-experimenten, omdat het totale lactylatieniveau op zijn hoogste niveau is. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Table of Materials.

1. Celkweek

  1. Kweek cellen in 100 mm petrischaaltjes totdat de vereiste samenvloeiing is bereikt, zoals eerder vermeld.
    OPMERKING: Kweek genoeg cellen om tussen 0,5-1 mg eiwitten voor lactylomen of meer dan 2 mg voor IP te verkrijgen.
  2. Spoel cellen af met 5 ml voorgekoelde 1x fosfaatgepufferde zoutoplossing (PBS).
  3. Voeg 500 μL voorgekoeld PBS toe en oogst cellen met een celschraper. Overbrengen naar een 1 mL laagbindende microbuis.
  4. Centrifugeer cellen op 2.000 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) en gooi het heldere supernatant weg. Celpellets kunnen worden opgeslagen bij -80 °C.

2. Lactylome

OPMERKING: Werk altijd met handschoenen om besmetting van monsters te voorkomen. Gebruik altijd gefilterde tips, microbuisjes met lage binding en water van MS-kwaliteit.
OPMERKING: Biologische replicaties (3-5 in onze ervaring) moeten altijd worden uitgevoerd om te garanderen dat de geïdentificeerde modificaties reproduceerbaar zijn.

  1. Eiwitextractie
    OPMERKING: Werk op ijs.
    1. Bereid de lactylome lysisbuffer voor (Tabel 1) en bewaar bij 4 °C vóór gebruik. Voeg vlak voor gebruik proteaseremmers toe.
    2. Extraheer de eiwitten met het juiste volume van de lysisbuffer.
    3. Sonicate op ijs, 12 cycli van 5 s, puls + 5 s, afwijkend met een intensiteit van 20%-25%.
    4. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng het heldere supernatant met de eiwitten over in een nieuwe laagbindende microbuis.
    5. Kwantificeer eiwitten met een Bicinchoninic acid (BCA) kit volgens de aanbeveling van de fabrikant.
      OPMERKING: De BCA-kit is compatibel met maximaal 3 M ureum. Daarom moeten monsters dienovereenkomstig worden verdund.
    6. Breng 500 μg over naar 1 mg eiwitten naar nieuwe laagbindende microbuisjes. Gebruik dezelfde hoeveelheid eiwit per monster. Voltooi het volume van alle monsters met de lactylome lysisbuffer tot hetzelfde uiteindelijke volume.
  2. Reductie, alkylatie en enzymatische vertering
    1. Voeg dithiothreitol toe aan een uiteindelijke concentratie van 5 mM. Incubeer bij 95 °C gedurende 2 minuten.
    2. Incubeer 30 minuten bij RT.
    3. Voeg chluuracetamide toe aan een eindconcentratie van 7,5 mM. Incubeer 20 minuten in het donker bij RT.
    4. Voeg 3 keer het monstervolume (uit stap 2.1.6) van 1 M (NH4)2CO3 toe om ureum te verminderen van 8 M naar 2 M.
      OPMERKING: Als het totale volume de capaciteit van de microbuizen overschrijdt, splits deze dan in twee microbuizen.
    5. Voeg 1 μg MS-grade trypsine toe per 100 μg eiwitten. Incubeer een nacht bij 30 °C. Ga door met de zuivering van het monster.
  3. Zuivering en peptideconcentratie
    OPMERKING: Werk bij RT.
    1. Verzuren het monster door trifluorazijnzuur (TFA) toe te voegen aan een uiteindelijke concentratie van 0,2%.
    2. Bereid de volgende oplossingen vers in MS-kwaliteit water: 0,1% TFA, 1% mierenzuur (FA) en 1% FA/50% acetonitril.
    3. Gebruik C18 100 mg kolommen om door te gaan met zuivering.
      OPMERKING: Om deze kolom te gebruiken, gebruik je twee pipetpunten: laad de kolom met één en knip de punt van de andere door om de vloeistof uit de kolom te stoten. Zorg ervoor dat de kolom consistent nat blijft. Gebruik één kolom per monster.
    4. Laad de kolom op met 1 mL 100% acetonitril, de bevochtigingsoplossing, en werp uit. Herhaal twee keer.
    5. Evenwicht de kolom door 1 mL van 0,1% TFA op te laden en uit te werpen. Herhaal twee keer dit.
    6. Laad de kolom op met 1 mL van het verzuurde monster. Ga door met 10 cycli van lading/uitwerpen van het monster. Herhaal als er nog een monster overblijft.
    7. Was de kolom door 1 mL 0,1% TFA op te laden en te werpen. Herhaal twee keer.
    8. Voor elusie gaat u door met 10 laad-/uitwerpcycli met 750 μL 1% FA/50% acetonitril. Verzamel in een nieuwe laagbindende microbuis. Herhaal met een extra 750 μL van 1%/50% acetonitril voor een totaal van 1,5 mL gezuiverde peptiden.
      OPMERKING: Identificeer de microbuis aan de zijkant in plaats van op de dop om besmetting van monsters bij het prikmaken van gaten in de dop te voorkomen.
    9. Steek 1 tot 3 gaten in de dop van de microbuizen met een naald voor verdamping.
    10. Met een vacuümconcentrator concentreer je de monsters bij 60 °C zolang als nodig is (voor monsters in een eindvolume van 1,5 mL kan dit minstens 4 uur duren). Vervolgens wordt de immunoprecipitatie van de peptiden uitgevoerd.
  4. Immunoprecipitatie met KL-LA kralen
    1. Bereid de wasbuffer en lactylome IP-buffer voor (Tabel 2).
    2. Voeg op ijs 200 μL IP-buffer toe aan de geconcentreerde peptiden, waarbij je grondig mengt tot het opgelost is. Sommige neerslagen zijn nog zichtbaar.
    3. Centrifugeer op 12.000 x g gedurende 10 minuten op 4 °C om eventuele neerslagen te verwijderen.
      OPMERKING: Na centrifugatie kan het monster als controlestap worden gedoseerd met bijvoorbeeld een spectrofotometer om de peptideconcentratie bij 205 nm te kwantificeren.
    4. Was KL-LA agarose-geconjugeerde kralen 3 keer met 200 μL ijskoude 1x PBS door te centrifugeren op 2.000 x g gedurende 1 minuut bij 4 °C en na elke wasbeurt het heldere supernatant te verwijderen.
      OPMERKING: Voor 1 mg eiwit aan het begin van dit protocol gebruik 20 μL KL-LA agarose-geconjugeerde kralen, voorheen gealiquoteerd in 0,5 mL laagbindende buizen voor eenvoudig gebruik.
    5. Breng het heldere supernatant met de geresuspendeerde peptiden over in de 0,5 mL microbuis met de voorgewassen kralen. Sluit de buizen af met paraffinefilm om lekkage te voorkomen.
    6. Broed een nacht uit met een zachte end-to-end rotatie bij 4 °C.
      OPMERKING: Stappen 2.4.7-2.4.12 worden allemaal uitgevoerd bij 4 °C.
    7. Pellet de kralen door middel van centrifugatie op 2.000 x g gedurende 1 minuut. Gooi het heldere supernatant weg.
    8. Voeg 200 μL lactylome IP-buffer toe en was 15 seconden door de buis om te keren. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 seconden en gooi het heldere supernatant weg.
    9. Herhaal stap 2.4.8 één keer.
    10. Voeg 200 μL wash buffer toe en was 15 s door de buis om te keren. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 30 s en gooi het heldere supernatant weg.
    11. Herhaal stap 2.4.10 twee keer.
    12. Voeg 200 μL MS-kwaliteit water toe en was 30 seconden door de buis om te keren. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 1 minuut en gooi het heldere supernatant weg.
      OPMERKING: De resterende stappen van het lactylomprotocol worden uitgevoerd bij RT.
    13. Elute de gebonden peptiden met 100 μL elutionbuffer (0,1% TFA vers bereid) gedurende 1 minuut met zachte end-to-end rotatie bij RT. Centrifugeer op 2.000 x g gedurende 2 minuten.
    14. Herhaal stap 2.4.13 nog twee keer en combineer de eluën. Ga verder met de zuivering van de monsters.
  5. Concentratie en zuivering van KL-LA peptiden
    1. Bereid de volgende oplossingen voor in MS-kwaliteit zoetwater: 0,1% TFA, 1% FA en 1% FA/50% acetonitril.
      OPMERKING: Vlak voordat je met de zuivering begint, bereid je de juiste hoeveelheid oplossing voor in 1,5 mL microbuizen (stap 2.5.3: 300 μL 100% acetonitril, stap 2.5.4: 300 μL 0,1% TFA, stap 2.5.6: 300 μL 0,1% TFA en stap 2.5.7: 300 μL 1% FA/50%).
    2. Gebruik 100 μL C18-tips om de zuivering voort te zetten.
      OPMERKING: De 100 μL C18 tips worden op dezelfde manier gebruikt als traditionele pipettoppen. Houd de duim ingedrukt en laat de plunjer nooit los tussen de stappen om de kolom nat te houden en te voorkomen dat er lucht wordt ingebracht.
    3. Aspireer 100 μL 100% acetonitril, de bevochtigingsoplossing, en doseer voorzichtig zonder alle vloeistof uit te stoten. Herhaal dit twee keer.
    4. Breng de kolom in evenwicht door 100 μL 0,1% TFA te aspireren en geef voorzichtig uit. Herhaal dit twee keer.
    5. Laad de kolom op met 100 μL van het monster van KL-LA peptiden. Ga door met 10 laad-/uitwerpcycli in een nieuwe laagbindende microbuis. Herhaal als er nog een monster over is.
    6. Was de kolom door 100 μL 0,1% TFA te aspireren en doseer het. Herhaal dit twee keer.
    7. Ga door met 10 laad-/uitwerpcycli voor elusie met 100 μL 1% FA/50% acetonitril in een nieuwe laagbindende microbuis. Herhaal twee keer en combineer de eluaten.
      OPMERKING: De peptiden die aan de C18-tip binden, kunnen voorkomen dat de tip 100 μL tegelijk aspireert. Herhaal deze stap totdat er geen vloeistof meer in de microbuis is (300 μL) bij stap 2.5.7.
    8. Steek 1 tot 3 gaten in de dop van de microbuizen met een naald voor verdamping.
      OPMERKING: Identificeer de microbuizen aan de zijkant van de buis in plaats van op de dop om te voorkomen dat monsters worden besmeten bij het doorboren van de gaten.
    9. Met een vacuümconcentrator concentreren we de monsters bij 60 °C zolang het verdampen van de vloeistof nodig is (bij een totaal volume van 300 μL kan het minstens 2 uur duren).
    10. Sussen de geconcentreerde peptiden opnieuw in 30 μL van 1% FA.
    11. Volgens de richtlijnen van je massaspectrometrieplatform kwantificeer je peptiden met een spectrofotometer op 205 nm om hun concentratie te bepalen.
    12. Overbrengen in een glazen flesje en houd het op 4 °C tot de MS-analyse.

3. MS analyse en bio-informatica

OPMERKING: Monsters werden geanalyseerd in de University of Sherbrooke Proteomics Core Facility met behulp van een massaspectrometer (MS) (bediend in Data-Dependent Acquisition met Parallel Acumulation-Serial Fragmentation (DDA-PASEF) modus).

  1. Massaspectrometrie
    1. Voor elk monster wordt 375 ng peptiden geïnjecteerd in een high-performance liquid chromatography (HPLC) systeem.
    2. Laad peptiden op een trapkolom met een constante debiet van 4 μL/min.
    3. Scheid de peptiden op een analytische C18-kolom met behulp van een 2-uur gradiënt van 5%-37% acetonitril in 0,1% FA bij een debiet van 400 nL/min.
    4. Voer elektrospray-ionisatie uit met de volgende instellingen: Capillaire spanning: 1500 V, Droog gas: 3,0 L/min, Droge temperatuur: 180 °C, TIMS-indruk: 2,6 mBar.
    5. Verkrijg het massaspectra in een bereik van 100-1700 m/z met DDA auto-MS/MS-modus.
      OPMERKING: Het instrument is ingesteld om laadtoestanden van 0 tot 5+ te detecteren. Een dubbele Trapped Ion Mobility Spectrometry (TIMS)-configuratie wordt gebruikt met een ramptijd van 100 ms en 10 Parallel Acumulation-Serial Fragmentation (PASEF) scans per acquisitiecyclus, wat resulteert in een duty cycle van 1,17 seconden. Dynamische uitsluiting is ingesteld op 0,4 min.
    6. Voer fragmentatie uit met behulp van een botsings-geïnduceerde dissociatie (CID) energie, lineair opgebouwd van 20-59 eV over een ionenmobiliteitsbereik van 0,6-1,6 Vs/cm².
      OPMERKING: De doelintensiteit is ingesteld op 20.000, met een intensiteitsdrempel van 2.500. Een standaard filterpolygoon wordt toegepast om voorlopers langs de diagonale scanlijn te prioriteren voor +2, +3 en +4 geladen peptiden in het m/z-ion mobiliteitsvlak.
  2. Data-voorverwerking: MaxQuant-analyse
    OPMERKING: De volgende stappen worden uitgevoerd met behulp van MaxQuant v.2.6.713 software om de lactylatiepeptiden te identificeren.
    1. Klik rechtsboven op het tabblad Configuratie en controleer of lactylatie als aanpassing is toegevoegd.
    2. Zo niet, gebruik dan de Unimod.org database14. Log in als gast en zoek op lactylatie (accessienummer #2114).
    3. Klik op de Toevoeg-knop. Schrijf Lactylation (K) in Naam, voer de compositie in zoals geschreven in Unimod door op de Wijzigen-knop te klikken.
    4. Controleer de verkregen monoisotopische massa. Klik op OK.
    5. Klik linksboven in het scherm, in het blauw, op de knop Wijzigingen opslaan .
    6. Klik linksboven op Ruwe gegevens. Laad ruwe gegevensbestanden en geef ze automatisch een naam met de knop Geen breuken .
    7. Stel het aantal threads linksonder in op basis van het aantal cores dat op de computer toegankelijk is.
    8. Klik in het tabblad Groepsspecifieke op Wijzigingen in het blauw.
    9. Voeg Lactylatie toe aan variabele-aanpassingen door op de pijltjesknop te klikken om aan het vierkant rechts toe te voegen.
    10. Klik op Label-free quantification. Voer LFQ in en verander het normalisatietype naar geen.
    11. Klik op Digestion. Zorg ervoor dat trypsine/p wordt toegevoegd aan het vierkant rechts.
    12. Verhoog het maximale aantal gemiste spleiven naar 4 , omdat lactylatie de spijsvertering van trypsine kan beïnvloeden.
    13. Klik op Instrument. Verander de peptidetolerantie van hoofdzoekers naar 20, aangezien lactylatie geen veelvoorkomende PTM is.
    14. Klik linksboven op Globale parameters. Voeg een Fasta-bestand toe, eerder gedownload van Uniprot of Ensembl, voor de bijbehorende soort.
    15. Klik op de Identifier-regel en Test om zeker te zijn dat het Fasta-bestand correct kan worden gelezen.
    16. Klik op Eiwitkwantificatie in blauw. Voeg Lactylatie toe aan het vierkant rechts.
    17. Klik op Identificatie in blauw. Verander FDR naar 0,05. Zorg dat Tweede peptiden en Match tussen runs zijn gecontroleerd.
    18. Klik blauw op Label-free quantification . Vink de iBAQ- en Top3-vakjes aan.
    19. Klik rechtsboven op Prestatie.
    20. Klik onderaan op Start in blauw.
  3. Identificatie van lactylatie-eiwitten
    OPMERKING: Aan het einde van de MaxQuant-run worden meerdere uitvoerbestanden verkregen, zoals:
    • Lactylatie (K)Plaatsen: primair bestand van belang - bevat locatie-specifieke informatie over lactyleerde lysineresiduen in een precieze peptidesequentie (eiwit geïdentificeerd, lactylatie in sequentie, intensiteiten, betrouwbaarheidsniveau).
    • Lactylatieparameters: bevat alle informatie over instellingen en drempels die tijdens MaxQuant-analyse worden gebruikt.
    • Lactylatiepeptiden: geïdentificeerde peptiden, gemodificeerd en niet-gemodificeerd.
    • Lactylatie-eiwitgroepen: geïdentificeerde eiwitgroepen en hun verband met detecteerde lactylatie.
    Het gebruik van die bestanden hangt af van de onderzoeksvraag. De volgende stap beschrijft hoe je een lactylatie-site kunt identificeren.
    1. Open het Lactylation (K)Sites-bestand in Excel.
    2. Dupliceer het tabblad onderaan Lactylation (K)Sites om de originele data te behouden.
    3. Sorteer van A tot Z de kolommen Omgekeerd en Potentiële verontreiniging . Als er waarde in sommige rijen zit, verwijder die dan rijen.
    4. In dit nieuwe tabblad kun je alleen de benodigde kolommen behouden, zoals: (1) Eiwit: UniProt14 Primair accessienummer, (2) Posities binnen eiwitten: Voorspelde positie van lactylatie, belangrijk om te bevestigen zoals later beschreven, (3) Eiwitnamen, (4) Gennamen, (5) Aantal Lactylatie (K gedetecteerd op het bijbehorende peptide), (6) Lactylatie (K) Kansen (Kans van 1 op de positie van lactylatie), (7) Intensiteit (Som van alle individuele intensiteiten die tot het bijbehorende peptide behoren).
    5. Vul eventuele ontbrekende waarden in, zoals eiwitnamen of gennamen.
    6. Houd alleen het eerste toegangsnummer in de kolom ''Eiwitten''. De verkregen tabel geeft alle lactylatiepeptiden weer die zijn gedetecteerd, samen met het meest waarschijnlijke eiwit waarin dit peptide voorkomt.
      OPMERKING: Omdat lactylatie geen overvloedige PTM is, wordt verwacht dat tussen de 100 en 500 peptiden als lactylerend worden geïdentificeerd. Omdat gedetecteerde peptiden van de ene replicate tot de andere verschillen, is het mogelijk een drempel van ten minste detecteer in 2 biologische replicaten in te stellen.
    7. Om de positie van een gemodificeerd residu te bevestigen, gebruik je een alignment web-tool zoals BLAST van NIH15 of Align van UniProt16 met de peptidesequentie in de kolom ''Lactylation (K) Probabilities'' (wis elke waarschijnlijkheid) en de eiwitsequentie uit UniProt-database17.
      OPMERKING: Omdat meerdere lactylatieplaatsen in één eiwitsequentie kunnen worden geïdentificeerd, is het mogelijk deze plaatsen gelijktijdig uit te lijnen. Dit helpt ook om dubbele plaatsen te identificeren die op verschillende peptiden kunnen zitten maar op dezelfde locatie in de eiwitsequentie.
    8. De data-analyse hangt af van de onderzoeksvraag, maar het is noodzakelijk om stappen van normalisatie, centrering, schaalverdeling en log-transformatie te overwegen voordat je een statistische data-analyseuitvoert.
    9. Om de lactylatie-eiwitten die door MS-analyse zijn geïdentificeerd te bevestigen, volgt u het immunoprecipitatieprotocol.

4. Immunoprecipitatie (IP)

  1. Eiwitextractie
    OPMERKING: Werk op ijs.
    1. Bereid de IP-lysis/wasbuffer voor (Tabel 3) en bewaar deze op 4 °C voor gebruik. Voeg de proteaseremmers vlak voor gebruik toe.
      OPMERKING: Voor de monstervoorbereiding kan een celpellet worden gebruikt dat is geconserveerd bij -80 °C. Bij het werken met verse cellen, volg dan de stappen 4.1.2 en 4.1.3. Anders suspendeer je de celpellet opnieuw in hetzelfde volume van IP-lysis/washbuffer als vermeld in stap 4.1.2 en ga je verder met stap 4.1.4.
    2. Voeg 1 ml IP-lysis/wash buffer toe en incubeer cellen op 4 °C gedurende 10 minuten.
    3. Oogst cellen met een celschraper en breng de lyse over naar een 1,5 mL microbuis.
    4. Incubeer met een zachte end-to-end rotatie gedurende 30 minuten op 4 °C.
    5. Centrifugeer op 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    6. Breng het heldere supernatant over naar een nieuwe 1,5 mL microbuis.
    7. Kwantificeer eiwit met een BCA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Vooronthulling van de kralen en KL-LA antilichaamincubatie
    OPMERKING: Werk op ijs. Voor elke experimentele conditie bereid je een controlebuis voor IP-buis (IgG van dezelfde soort als het KL-LA antilichaam) en een buis voor KL-LA IP.
    1. Breng 1 mg eiwitten over naar een nieuwe microbuis van 1,5 mL. Vul alle monsters af tot hetzelfde uiteindelijke volume met behulp van IP-lyse/wash buffer.
      OPMERKING: Dit protocol kan worden uitgevoerd met magnetische of agarosekralen. Voor de volgende stappen werden magnetische kralen gebruikt.
    2. Breng het benodigde volume kralen over naar een nieuwe 1,5 mL microbuis.
    3. Om de kralen vooraf te wassen, magnetiseer je ze 30 seconden of totdat de oplossing helder is. Gooi het heldere supernatant weg. Was de pareltjes 3 keer met 500 μL IP lysis/wash buffer. Gooi het transparante supernatant weg na elke wasbeurt. Voeg hetzelfde volume IP-buffer toe als het volume van de oorspronkelijk genomen kralen.
    4. Incubeer de eiwitmonsters met 10-15 μL van de voorgewassen kralen met zachte end-to-end rotatie gedurende 20 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Voor 1 mg eiwit gebruik je 10-15 μL magnetische kralen. Deze stap minimaliseert de binding van niet-specifieke eiwitten aan de kralen tijdens het immunoprecipitatieprotocol.
    5. Magnetiseer de kralen gedurende 30 seconden of totdat de oplossing helder is. Breng het heldere supernatant over naar een nieuwe 1,5 mL microbuis.
    6. Voeg 1,5 μL anti-KL-LAantilichaam toe aan één buis en de overeenkomstige hoeveelheid IgG aan een andere buis.
      OPMERKING: Voor 1 mg eiwit aan het begin van dit protocol gebruik 1,5 μg antilichamen.
    7. Incubeer de monsters met een zachte end-to-end rotatie 's nachts bij 4 °C.
  3. KL-LA immunoprecipitatie
    OPMERKING: Werk op ijs.
    1. Bereid de IP-lysis/wasbuffer voor (Tabel 3) en bewaar deze op 4 °C voor gebruik. Voeg de proteaseremmers vlak voor gebruik toe.
    2. Was de kralen vooraf zoals beschreven in stap 4.2.3.
      OPMERKING: Voor 1 mg eiwit aan het begin van dit protocol gebruik je 40 μL magnetische kralen.
    3. Incubeer de monsters met 40 μL voorgewassen magnetische kralen met zachte end-to-end rotatie gedurende 4 uur bij 4 °C.
    4. Magnetiseer de kralen gedurende 30 seconden of totdat de oplossing helder is. Verzamel het eerste heldere supernatant. Was de kralen 3 keer met 500 μL IP-lyse/wash buffer. Verwijder het transparante supernatant na elke wasbeurt.
      OPMERKING: De eerste supernatant kan worden gekwantificeerd en gebruikt in western blotting (WB). Het is nuttig om de effectiviteit van de immunoprecipitatie te evalueren.
    5. Suss de kralen opnieuw met 20 μL 2x Laemmli en 5% β-mercaptoethanolbuffer.
    6. Incubeer bij 95 °C gedurende 5 minuten voordat je op een SDS-PAGE gel laadt. Alternatief kunnen gedenatureerde monsters enkele weken worden bewaard bij -20 °C.
  4. WB-detectie
    1. Plaats de IP-buizen 30 seconden op de magnetische standaard voordat je het monster verzamelt en op een SDS-PAGE gel laadt.
    2. Voer WB uit met een antilichaam tegen het eiwit van belang en/of het anti-KL-La antilichaam om de pull-down van lactylatie-eiwitten in 5% Bovine Serum Albumine (BSA) te bevestigen. Secundaire antilichamen werden verdund bij 1:5000 in 5% BSA.
    3. Detecteer de banden met HRP-gebaseerde chemiluminescentiedetectie.

Resultaten

Als voorbeeld werd de slokdarmplaveiselcelcel TE11-celcellijn gekweekt totdat 80% confluentie was bereikt. Volgens de workflow zoals geïllustreerd in Figuur 1 en de MaxQuant-analyse zoals beschreven in dit protocol, werd het lactyloom bepaald. In die cellen werden 137 peptiden geïdentificeerd als potentieel lactyleerd, wat 82 unieke eiwitten vertegenwoordigt, aangezien meerdere locaties op hetzelfde eiwit werden geïdentificeerd (Figuur 2A). Let op dat dit geen rekening houdt met unieke peptiden. Er wordt verwacht dat er tussen de 100 en 500 geïdentificeerde peptiden worden verwacht in die experimenten in oesofageale plaveiselcelcellinen.

Lactylatie-eiwitten die werden geïdentificeerd, zijn gerelateerd aan verschillende biologische processen, zoals chromatine-remodellering of chromatineassemblage, die in de literatuur al waren beschreven als verrijkt met lactylereiwitten (Figuur 2B). Enkele van de eerste geïdentificeerde lactylatie-eiwitten waren histonen, die ook in deze gegevens voorkomen, zoals histon H1.2 (Tabel 4). Lactylatie kon worden geïdentificeerd op verschillende lysineresiduen van hetzelfde eiwit. Zo werden twee lactylatieplaatsen geïdentificeerd op histon H1.2: lysines (K) 168 (waarschijnlijk) en 191. Bij het eerste peptide (Tabel 4, regel 2) werd waargenomen dat het K168-residu een hogere kans heeft om met 0,733 op 1 te lactyleren te zijn, terwijl K169 slechts een kans van 0,267 heeft. HNRNPA1 is een goed voorbeeld van een peptide die uitgelijnd moet worden om het juiste gemodificeerde residu te bepalen.

Om de lactylatie van HNRNPA1 te valideren op basis van de lactylomeresultaten (Tabel 4), werd een IP-assay uitgevoerd gericht op deze posttranslationele modificatie. Eerst werden G-kralen en A/G-korrels vergeleken om te bepalen welk type kraal de optimale interactie vertoont met het anti-KL-LA-antilichaam. Na het uitvoeren van IP met een KL-LA-antilichaam en gevolgd door een WB tegen KL-LA, werd een zichtbare verrijking van KL-LA-eiwitten waargenomen, vergeleken met de input, zoals verwacht, bij beide kraaltypes (Figuur 3). Deze resultaten tonen de efficiëntie en robuustheid van het protocol bij het verrijken van lactylatie-eiwitten. Er werd geen duidelijk verschil waargenomen tussen beide geteste kraaltypes. Om de doelwitten die door MS zijn geïdentificeerd te valideren, kunnen specifieke IPs vervolgens worden bevestigd. Zo werd de lactylatie van HNRNPA1, die door MS werd geïdentificeerd (Tabel 4), gekalibreerd. Een specifieke band die overeenkomt met HNRNPA1 werd gedetecteerd na KL-LA IP en HNRNPA1 WB, wat aangeeft dat HNRNPA1 wordt gemodificeerd door lactylatie (Figuur 4). Hoewel zowel G- als A/G-korrels het doeleiwit succesvol immuunprecipiteerden, wordt bij A/G-korrels een intenser signaal van HNRNPA1 waargenomen, wat wijst op verhoogde affiniteit of herstel.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de workflow voor de lactylome-analyse. Afkortingen: IP = immunoprecipitatie; KL-LA = L-lactyllysine; LC-MS/MS = vloeistofchromatografie-tandem massaspectrometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Representatieve resultaten voor enkele eiwitten verkregen voor het lactyloom van TE11-cellen. (A) Totaal aantal geïdentificeerde eiwitten en peptiden. Meerdere lactylatieplaatsen kunnen op hetzelfde eiwit worden geïdentificeerd. (B) Top 5 biologische processen verrijkt voor lactylatie-eiwitten in TE11-cellen, verkregen met behulp van de STRING-database. De P-waarde werd gecorrigeerd voor meerdere tests met Benjamini-Hochberg. Het aantal in elke balk geeft het aantal eiwitten in het netwerk aan dat als lactyleerd werd geïdentificeerd uit het totale aantal eiwitten in deze Genontologie (GO). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Immunoprecipitatie van KL-LA met behulp van G- of A/G-kralen en WB-detectie van Pan-KL-LA in TE11-cellen. Detectie van Pan-KL-LA dient als een cruciale controle om de effectiviteit en specificiteit van de immunoprecipitatie van deze PTM te bevestigen. Dit experiment zorgt ervoor dat de IP eiwitten met de KL-LA-modificatie succesvol verrijkt. (*) geeft de zware en lichte ketens van het antilichaam aan, zoals duidelijk waargenomen in IP: IgG-lanes (control IP) (N = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Immunoprecipitatie van KL-LA met G- of A/G-kralen en detectie van HNRNPA1 door WB. Detectie van HNRNPA1 door WB in KL-LA-specifieke immunoprecipitaties met G- of A/G-kralen bevestigt de lactylatie in TE11-cellen (N = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OplossingEindconcentratie
Ureum8 M
Ammoniumbicarbonaat1 M
HEPES20 mM

Tabel 1: Lactylome lysebuffer. Voorbereiden in MS-water en pH instellen naar 8.

Oplossing - lactylome wasbufferEindconcentratie
NaCl100 mM
EDTA1 mM
Tris-HCl20 mM
Voeg toe voor Lactylome IP-bufferEindconcentratie
NP-400.5%

Tabel 2: Lactylome wasbuffer en IP-buffer. Voorbereiden in MS-kwaliteit water en de pH aanpassen naar 8 voor beide oplossingen.

OplossingEindconcentratie
Natriumchloride100 mM
Natriumfluoride50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)50 mM
β-glycerofosfaat40 mM
EDTA (pH 8)5 mM
Glycerol5%
Triton X-1001%
Voeg verse toevoeging:
Protease Inhibitor Cocktail 100X1X
PMSF1 mM
Orthovanadate0,2 mM

Tabel 3: IP-lysis/wasbuffer. Het moet vrij zijn van denaturanten, omdat deze de aanwezigheid van PTM's op eiwitten kunnen destabiliseren.

Posities binnen eiwittenEiwitEiwitnamenGennamenAantal lactyleringen (K)Lactylatiekansen (K)Intensiteit
168P16403Histon H1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0,733)K(0,267)1.98E+04
191P16403Histon H1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0Alfa-2-macroglobuline-achtig eiwit 1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0Chromobox eiwithomoloog 3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0Chromobox eiwithomoloog 3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2Eiwit JTBJTB2K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651Heterogeen nucleair ribonucleoproteïne A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

Tabel 4: Representatieve resultaten voor lactylatiepeptiden verkregen voor de TE11 slokdarmplaveiselcelcel. Deze tabel is verkregen na de MaxQuant-analyse.

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe immunoprecipitatie van KL-LA-gemodificeerde eiwitten in MS kan worden gebruikt om nieuwe lactylatie-eiwitten en hun lactylatieplaatsen te ontdekken. Dit lactylomprotocol wordt uitgevoerd met geconjugeerde kralen, maar kan worden bereikt met KL-LA-antilichaam of zelfs KD-LA-antilichaam afhankelijk van de onderzoeksvraag. Als men een antilichaam gebruikt in plaats van geconjugeerde kralen, bevordert het kiezen van een polyklonaal antilichaam de vorming van strakkere complexen omdat het aan meerdere epitopen kan binden; deze aanpak kan echter variabiliteit introduceren. Een voordeel van het gebruik van geconjugeerde kralen is dat ze voorkomen dat het antilichaam uitspoelt - vrijkomt uit de vaste steun - wat de MS-monsters kan besmetten. Het is ook tijdbesparender dan het gebruik van een niet-geconjugeerd antilichaam.

Bovendien is het belangrijk op te merken dat de hoeveelheid geïdentificeerde peptiden in dit type analyse door meerdere factoren kan worden beïnvloed1. Ten eerste speelt antilichaamspecificiteit een cruciale rol bij het waarborgen dat het juiste eiwit wordt vastgelegd. Het toevoegen van een stap van pre-clearing met agarosekorrels kan een manier zijn om niet-specifieke interacties te verwijderen. Aan de andere kant is het onbekend of lactylatie de trypsine-vertering kan beïnvloeden, aangezien het peptiden aan de c-terminale kant van het arginineresidu splijt, maar vooral lysineresidu. Als dit het geval is, kan dit mogelijk leiden tot een verminderde peptodekking. Daarom is het mogelijk om andere opties voor proteasen te overwegen. In dit protocol wordt de parameter ''Max. gemiste splitsing''' verhoogd om rekening te houden met deze beperking. Tot slot moet ook de voorbereiding en hantering van monsters, zoals het gebruik van handschoenen om besmetting van monsters met keratine van de huid te voorkomen, of de stabiliteit van modificatie, aangezien PTM-omzet een dynamisch en soms snel proces6 is, ook worden overwogen.

In tegenstelling tot de bredere MS-benadering die leidde tot lage detectie van laag-abundantie PTM, zoals lactylatie, maakt identificatie van verrijkte KL-LA peptiden via MS-gebaseerde proteomics gedetailleerde PTM-site-analyse mogelijk, zoals het identificeren van nieuw gekarakteriseerde lactylatieplaatsen en lactylatie-eiwitten19. Western blot kan informatie geven over het algemene lactylatiepatroon in cellen, maar kan geen informatie geven over eiwitspecifieke lactylatie. Daarom is IP de meest gebruikte benadering om MS-detecteerde PTM20 te bevestigen. Proximity ligation assay (PLA) is een andere techniek die kan worden gebruikt om de lactylatie van potentiële doelen die door proteomics21 zijn geïdentificeerd te bevestigen. Deze techniek kan ook de lokalisatie van de gemodificeerde eiwitten aangeven, maar heeft een lagere specificiteit. Het gebruik van een lactylatie-specifieke IP-benadering is geschikt voor een brede PTM-screening, maar het kan interessant zijn om eiwitspecifieke IP uit te voeren, afhankelijk van de onderzoeksvraag.

Bij het kwantificeren van het aandeel van een specifiek lactylereiwit in een totaal eiwitextract, is het uitvoeren van een IP alleen niet voldoende. Hoewel IP met KL-LA-kralen het vangen van lactylatie-eiwitten mogelijk maakt, kwantificeert het de lactylatie niet nauwkeurig, omdat het beperkt is tot het verrijken van doeleiwitten. Daarom is massaspectrometrie vereist, wat een meer gedetailleerde analyse biedt die precieze kwantitatieve meting van lactylatie mogelijk maakt. Het uitvoeren van IP van een potentieel lactylerend eiwit met een antilichaam tegen dat eiwit, gevolgd door massaspectrometrieanalyse, kan dus het percentage lactylatie-eiwitten in een totaal eiwitmonster bepalen, terwijl het uitvoeren van IP een efficiënte methode is om de lactylatie van de door MS geïdentyleerde eiwitten te bevestigen.

In een IP met niet-geconjugeerde antilichamen is het optimaliseren van de korrel-tot-antistofverhouding essentieel om een optimale vangst van lactylatie-eiwitten te waarborgen. Inderdaad, de balans tussen deze twee componenten heeft directe invloed op de specificiteit en efficiëntie van de IP. Een overschot aan antilichamen kan leiden tot niet-specifieke binding, wat achtergrondruis verhoogt en de algehele nauwkeurigheid van detectie vermindert. Daarentegen kan het tegenovergestelde leiden tot een inefficiënte verrijking van doeleiwitten, wat resulteert in zwakkere signalen en verminderde gevoeligheid. Deze technische overwegingen zijn cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare en precieze resultaten bij het bestuderen van lactyleerde eiwitten.

Samenvattend kan dit protocol worden gebruikt om veranderingen in lactylatieprofielen na homeostase-deregulatie te monitoren, zoals kanker 8,10, die invloed kunnen hebben op de medicijngerelateerde respons. Identificatie van biomarkers zou zelfs met deze methode kunnen worden bereikt. Toepasbaar op meerdere cellijnen, weefseltypen en zelfs patiëntbiopsieën, biedt deze techniek het potentieel om het begrip van PTM-gedreven celsignalering bij ziekte of normale omstandigheden te verdiepen.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflict om te melden.

Dankbetuigingen

Wij danken alle leden van het Giroux Lab oprecht voor de wetenschappelijke discussies. Wij zijn dankbaar voor het proteomische en massaspectrometrieplatform van de Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen - Université de Sherbrooke voor het leveren van diensten en begeleiding. VG wordt ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (RJPIN-2019-06185) en de Canadian Institutes of Health Research (178171). VG bekleedt de Canada Research Chair Tier 2 in gastro-intestinale stamcelbiologie. MH heeft beurzen ontvangen van het Centre de Recherche en Inflammation et Oncologie Digestive de l'Université de Sherbrooke, Université de Sherbrooke-Fondation De Sève, CRCHUS, het TRaIning A New generation of researchers in Gastroenterology and LivEr (TRIANGLE) programma, en FRQ. FMB is FRQS Merit Research Scholar (366044). VG en FMB zijn leden van het door FRQS gefinancierde "Centre de Recherche du CHUS".

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 uL Zip Tip C18 Pierce87784
Acclaim PepMap100 C18Dionex Corporation1649460,3mm i.d. x 5mm
Acetonitrile (MS grade)FisherA955-4
Ammonium bicarbonateSigma-AldrichA6141-500
Anti-HNRNPA1 monoklonaal antilichaamNovus Biologicals NB100-672
Anti-L-Lactyllysine (KL-La) monoklonaal antilichaamPTM-BioPTM1401RM
Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld antilichaamCST7076S
Anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld antilichaamCST7074S
Azure 280BiosystemsAZI280-01
BCA kitThermo Fisher ScientificP123227
Rund Serum Albumine (BSA)Wisent800-095-EG
Captive Spray nanoESI bronBruker Daltonics
ChloroacetamideSigma-AldrichC0267
Clarity Max Western ECL SubstraatBio-Rad1705062
Dithiothreitol (DTT)Thermo Fisher ScientificR0861
Dynabeads Protein G kralen voor ImmunoprecipitatieThermo Fisher Scientific10004D
EDTASigma-AldrichE9884
Formic acid (FA; MS grade)Thermo Fisher ScientificA117-50
GlycerolFisher ScientificBP229-1
HEPES (1M)Wisent330-050-EL
Hypersep C18 100mg kolomFisher60108-302
KL-LA agarose geconjugeerde kralenPTM-BioPTM-1404
Laemmli 2X (SDS, Bromophenol)Wisent, J.T.Baker800-100-CG, D293-01
Laag bindende microtube 0,5 mLSarstedt72.704.600
Laag bindende microtube 1,5 mLThermo Fisher ScientificP190410
Microtube 1,7 mLAxygenMCT-175-C
NanoElute HPLC systeemBruker Daltonics1,9um deeltjesgrootte, 75um i.d. x 25cm
Normaal Konijn IgG polyklonaal antilichaamMillipore Sigma12-370
PepSepBruker Daltonics1811112
Fosfaat-gebufferd zoutwater (PBS)Wisent311-425-CL
PMSFThermo Fisher Scientific36978
Protease inhibitor cocktail (PIC)Sigma-AldrichP8340-5
Sera-Mag SpeedBeads Protein A/G Magnetische DeeltjesThermo Fisher Scientific09-981-920
NatriumchlorideSigma-AldrichS9888-500
NatriumfluorideSigma-AldrichS1504
NatriumorthovanadateSigma-AldrichS6508
TimsTOF pro massaspectrometer Bruker Daltonics
Trifluorazijnzuur (TFA)Thermo Fisher ScientificA116-50
Tris-HClWisent600-125-IK
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trypsine (MS grade)Pierce90058
UreaThermo Fisher ScientificU15-500
Vaccufuge plusEppendorf22820168
Water (MS grade)VWR10803-890A
β-glycerofosfaatSigma-AldrichG5422
β-mercaptoethanolSigma-AldrichM3148

Referenties

  1. Li, H., Sun, L., Gao, P., Hu, H. Lactylation in cancer: Current understanding and challenges. Cancer Cell. 42 (11), 1803-1807 (2024).
  2. Lu, Z., et al. Lactylation: The emerging frontier in post-translational modification. Front Genet. 15, 1423213(2024).
  3. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  4. Niu, Z., et al. HBO1 catalyzes lysine lactylation and mediates histone H3K9la to regulate gene transcription. Nat. Commun. 15 (1), 3561(2024).
  5. Zhao, Q., et al. Non-enzymatic lysine D-lactylation induced by glyoxalase II substrate SLG dampens inflammatory immune responses. Cell Res. 35 (2), 97-116 (2025).
  6. Moreno-Yruela, C., et al. Class I histone deacetylases (HDAC1-3) are histone lysine delactylases. Sci Adv. 8 (3), eabi6696(2022).
  7. Yang, W., et al. Hypoxic in vitro culture reduces histone lactylation and impairs pre-implantation embryonic development in mice. Epigenetics Chromatin. 14 (1), 57(2021).
  8. Yang, Z., et al. Lactylome analysis suggests lactylation-dependent mechanisms of metabolic adaptation in hepatocellular carcinoma. Nat. Metab. 5 (1), 61-79 (2023).
  9. Zhang, N., et al. Protein lactylation critically regulates energy metabolism in the protozoan parasite Trypanosoma brucei. Front Cell Dev Biol. 9, 719720(2021).
  10. Yu, J., et al. Histone lactylation drives oncogenesis by facilitating m(6)A reader protein YTHDF2 expression in ocular melanoma. Genome Biol. 22 (1), 85(2021).
  11. Kim, M. -S., Zhong, J., Pandley, A. Common errors in mass spectrometry-based analysis of post-translational modifications. Proteomics. 16 (5), 700-714 (2016).
  12. Conradi, C., Shiu, A. Dynamics of post-translational modification systems: Recent progress and future directions. Biophys J. 114 (3), 507-515 (2018).
  13. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  14. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Unimod: Protein modifications for mass spectrometry. Proteomics. 4 (6), 1534-1536 (2004).
  15. Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
  16. Zaru, R., Orchard, S. UniProt Consortium. UniProt Tools: BLAST, Align, Peptide Search, and ID Mapping. Curr Protoc. 3 (3), e697(2023).
  17. UniProt Consortium. UniProt: The universal protein knowledgebase in 2025. Nucleic Acids Res. 53 (D1), D609-D617 (2025).
  18. Sun, J., Xia, Y. Pretreating and normalizing metabolomics data for statistical analysis. Genes Dis. 11 (3), 100979(2023).
  19. Yang, Y., Qiao, L. Data-independent acquisition proteomics methods for analyzing post-translational modifications. Proteomics. 23 (7-8), e2200046(2023).
  20. Doll, S., Burlingame, A. L. Mass spectrometry-based detection and assignment of protein post-translational modifications. ACS Chem Biol. 10 (1), 63-71 (2015).
  21. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. J Vis Exp. (185), e64294(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Prote nelactyleringposttranslationele modificatieimmunoprecipitatie van peptidenprote nextractieprote nedigestieslokdarmcarcinoomcellenlysine modificatiecelssignalering

Gerelateerde artikelen