Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Opzetten van een kweeksysteem voor chilitrips (Scirtothrips dorsalis hood) voor virulentiescreening van entomopathogene schimmels

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68600

⸱

18 juli 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

In dit artikel

Samenvatting

Er werd een bioassayprotocol met losstaande bladeren opgesteld voor het massaal kweken van chilitrips met behulp van een aangepaste methode met vrijstaande bladeren in agarhoudende glazen containers, wat een hoge overleving en gesynchroniseerde ontwikkeling garandeert. Dit systeem maakt een efficiënte screening van entomopathogene schimmelvirulentie tegen 2e instar-larven mogelijk en biedt een betrouwbare tripsvoorziening voor laboratorium-, kas- en veldevaluaties.

Samenvatting

De pepertrips (Scirtothrips dorsalis Hood) is een economisch belangrijke plaag van sier- en voedselgewassen in Taiwan. Entomopathogene schimmels (EPF) werken als een milieuvriendelijk biologisch bestrijdingsmiddel voor het beheersen van trips. Het is van cruciaal belang om de virulentie van EPF-isolaten tegen pepertrips onder laboratoriumomstandigheden te screenen voordat ze in het veld worden toegepast. Beperkte gegevens over de kweekmethode van pepertrips vormen echter een uitdaging voor grootschalige laboratoriumscreening. Om dit probleem aan te pakken, hebben we een aangepaste laboratoriumkweekmethode ontwikkeld voor de massaproductie van S. dorsalis.

De methode maakt gebruik van een opfoksysteem met vrijstaande bladeren met behulp van een agarhoudende glazen container die geschikt is voor het beoordelen van EPF tegen pepertrips. Dit geoptimaliseerde bioassaysysteem met losstaande bladeren is geschikt voor het beoordelen van de werkzaamheid van EPF tegen pepertrips. Het systeem heeft de capaciteit om grote aantallen tripsen te produceren in hetzelfde ontwikkelingsstadium voor virulentiescreening. Volgens de test toonde het resultaat aan dat Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213) isolaat de hoogste virulentie (53,6%) vertoonde tegen2e instar larven van chili trips 7 dagen na inoculatie (d.p.i.). Bovendien bleven de in agar ingebedde bladschijven meer dan 7 dagen vers, waardoor tripsen gedurende de hele observatieperiode konden overleven (90% overlevingspercentage van de controlebehandeling), wat de stabiliteit van het opfoksysteem aangeeft. Dit protocol demonstreert een stabiel kweeksysteem voor massaproductie en voor het evalueren van de virulentie van EPF-isolaten tegen pepertrips en dat kan nuttig zijn voor andere trips, waardoor screening op potentiële EPF-isolaten mogelijk is voor de bestrijding van trips in het veld.

Inleiding

De chilitrips (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) is een polyfaag ongedierte dat meer dan 100 plantensoorten aantast in 40 verschillende plantenfamilies, waaronder groenten en sier- en fruitgewassen1. Het is inheems in tropisch en subtropisch Azië-Zuidoost-Azië, India, Japan en Taiwan2. Voor zover wij weten, is de pepertrips de plaag van landbouw- en siergewassen, waaronder mango, thee, bosbes en lotus in Taiwan. In de afgelopen twee decennia is pepertrips in verschillende landen een belangrijke economische plaag geworden vanwege de toegenomen globalisering en de open handel in landbouwproducten. Bovendien droegen het hoge voortplantingsvermogen en het aanpassingsvermogen aan nieuw binnengevallen gebieden bij aan de verspreiding van deze plaag 1,3.

De pepertrips voedt zich voornamelijk met jong gebladerte, scheuten, bloemblaadjes en onrijpe vruchten, wat leidt tot necrose en het afsterven van weefsels3. Bovendien dienen ze als vector voor verschillende plantenziekten, waaronder het arachideknopnecrosevirus (GBNV), het arachidechlorotische fanspotvirus (GCFSV), het arachidegeelvlekkenvirus (GYSV)4 en het tabaksstreepvirus (TSV)5. Als gevolg hiervan kan het voeren door chilitrips de opbrengst en waarde van aangetaste gewassen aanzienlijk verminderen. Succesvol beheer van chilitrips is afhankelijk van een geïntegreerd plaagbestrijdingsplan dat gebruikmaakt van culturele, biologische en chemische bestrijdingsstrategieën1. In Taiwan gebruiken biologische boeren vaak niet-chemische materialen, zoals olie en neemolie met een smal bereik, of biologische bestrijdingsmethoden, waaronder het gebruik van roofmijten en minuscule piratenwantsen (door persoonlijke observatie). Op basis van feedback van boeren kan de toepassing van deze oliën tijdens het bloesem- en vruchtseizoen echter de bestuiving verstoren en stuifmeel beschadigen, wat leidt tot een vermindering van de opbrengst en de economische waarde. Daarom is het ontwikkelen van effectieve alternatieve bestrijdingsmaatregelen voor pepertrips cruciaal voor biologische boeren.

Entomopathogene schimmels (EPF) zijn een groep insectendodende schimmels waarvan is aangetoond dat ze een effectieve en duurzame plaagbestrijdingstechniek zijn 6,7,8. Verschillende onderzoeken hebben de effectiviteit van EPF tegen pepertrips aangetoond. Commerciële EPF's, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) en Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), hebben een significante bestrijding van chilitrips op rozenplanten vertoond 9,10. Populaties van chilitrips op peperplanten kunnen ook worden verminderd door Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11. Andere EPF's, zoals Lecanicillium lecanii en Purpureocillium lilacinum, zijn getest tegen pepertrips in verschillende gewassen, waaronder chiliplant en thee, en waren effectief bij het bestrijden van deze plaag12,13.

Sommige eerdere onderzoeken naar de werkzaamheid van EPF's voor tripsbestrijding in kassen of op het veld werden uitgevoerd zonder eerst te screenen op de meest effectieve EPF-soorten/-stammen, waardoor hun werkzaamheid werd beperkt. Zorgvuldige screening van EPF's kan de plaagbestrijding aanzienlijk verbeteren. Veel studies hebben tripsen gekweekt voor bioassays op intacte planten in kooien11,14. Hoewel een intact opkweeksysteem een meer natuurlijke omgeving voor trips biedt, vormen ze een uitdaging bij het beheren van verschillende ontwikkelingsstadia, aangezien tripsen in elke fase verschillend gedrag vertonen. Deze variabiliteit kan de selectie van gerichte stadia voor specifieke experimentele doeleinden bemoeilijken. Bovendien kunnen de bodemgesteldheid in het intacte kweeksysteem van invloed zijn op de verpopping en eclotie van pepertrips, waardoor het aantal individuen dat beschikbaar is voor volgende bioassays wordt verminderd15, waardoor de middelen voor verdere bioassays worden beperkt. Bovendien hebben kweeksystemen voor hele planten meer ruimte en voortdurende zorg voor planten nodig, omdat gestreste planten het gedrag van trips kunnen veranderen en tijdrovender en arbeidsintensiever kunnen zijn. Er zijn weinig meldingen van tripskweeksystemen op basis van niet-levend plantaardig materiaal (bijv. losgemaakt plantaardig weefsel of kunstmatig dieet) voor laboratoriumexperimenten met bioassays, maar de details van deze methoden waren vaak onduidelijk of werden weggelaten 12,16.

Deze studie had tot doel een eenvoudig, kosteneffectief en duurzaam massakweeksysteem van pepertrips onder laboratoriumomstandigheden te ontwikkelen. In dit protocol werd een bladschijvenhoudermethode7 aangepast om een efficiëntere en gecontroleerde aanpak te bieden voor het massaal kweken van trips, waardoor een nauwkeurige selectie van ontwikkelingsstadia voor bioassays mogelijk is via een strikte controle van de omgevingsomstandigheden. Daarnaast werd een stabiel en reproduceerbaar bioassaysysteem ontwikkeld om de virulentie van entomopathogene schimmelisolaten (EPF) te evalueren met 50% letale tijd (LT50) en 50% mediane letale concentratie (LC50), die verwijzen naar de geschatte tijd onder een specifieke dosering, en de concentratie van schimmelsuspensie die nodig is om 50% mortaliteit van chilitrips te veroorzaken, respectievelijk. Door toepassing van deze methode kunnen de in het veld verzamelde trips correct worden geïdentificeerd en kunnen de stabiele laboratoriumkolonies van trips worden onderhouden om de werkzaamheid van verschillende schimmelisolaten te testen met behulp van een eenvoudigere en meer reproduceerbare methodologie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Het volledige experimentele stroomschema wordt weergegeven in figuur 1.

1. Chili trips veld inzameling en onderhoud van de kolonie

  1. Inzameling van pepertrips
    1. Onderzoek visueel beide zijden van bladeren en in bloemen op aantasting van chilitrips op bosbessenplanten in een aangetaste bosbessenboerderij.
    2. Noteer de details van elk monster (bijv. een deel van de plant en de ernst van de plaag) en bevestig de productiepraktijken met boeren, zoals conventionele landbouw of biologische landbouw, inclusief de toepassing van minerale olie en natuurlijke vijanden.
    3. Snijd de met chilitrips besmette bladeren en bloemen af en doe ze in de plastic zak met ritssluiting (Tabel met materialen), sluit de zak met ritssluiting af met wat lucht erin om de trips in leven te houden. Breng het monster binnen 3 uur naar het laboratorium.
      OPMERKING: Plaats het monster in een koeler wanneer de tijd van afname in het veld meer dan 3 uur is.
    4. Bereid een glazen kweekbak voor (35 mm hoog, 45 mm binnendiameter), plaats drie lagen rond keukenpapier (diam. 40 mm) op de bodem van de glazen kweekbak en voeg vervolgens 8-10 druppels (400-500 μL) gefilterd water toe (Figuur 1 en Tabel met materialen).
    5. Verzamel een jong, rood mangoblad van de mangovelden (Figuur 1). Was het blad en controleer onder een optische microscoop (Materiaalopgave) op insecteneieren of andere insectenbesmetting voordat u de glazen kweekcontainer klaarmaakt. Snijd het mangoblad met een leren snijder (Materiaaltabel) in een ronde schijf (40 mm) en leg deze op de natte papieren handdoek.
      OPMERKING: Mangobladeren zijn stabielere bronnen voor het voeden van trips dan jonge bosbessenbladeren, die alleen seizoensgebonden groeien.
    6. Observeer de pepertrips onder een optische microscoop met een vergroting van 10x en breng 10 volwassen tripsen (vijf mannetjes en vijf vrouwtjes) met een fijne verfkwast (Materiaaltabel) over in de glazen kweekcontainer.
    7. Sluit elke glazen kweekcontainer af met twee lagen parafilm (Materiaaltabel) en maak ongeveer 40 kleine gaatjes met behulp van een #00 insectenpin voor ventilatie (Materiaaltabel).
    8. Bewaar de glazen kweekcontainer in een broedmachine op 25 ± 1 °C, ~70% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van licht:donker (L:D) = 12 uur: 12 uur (Materiaaltabel).
    9. Verwijder de volwassenen met een kwast na 48 uur.
      LET OP: Op basis van onze observatie leggen de vrouwelijke tripsen eieren ~2 dagen nadat ze zijn overgebracht naar de glazen kweekcontainer.
    10. Observeer de bladweefsels met eieren onder een stereomicroscoop om de ovipositie verder te bevestigen (Figuur 1 en Materiaaltabel). Leg een verse mangobladschijf op het blad met eieren en voeg 8-10 druppels gefilterd water toe op het keukenpapier om de luchtvochtigheid op peil te houden.
  2. Behoud van de populatie pepertrips
    OPMERKING: De eieren komen na ~ 5-7 dagen uit in larven van 1st instar.
    1. Breng het blad met 1st instar larven direct over in een nieuwe glazen kweekcontainer.
      OPMERKING: Breng met een kwast de larven van 1st instar voorzichtig over in een nieuwe glazen kweekcontainer, om besmetting door de rotte en onverwachte schimmelgroei op de mangobladeren te voorkomen. Op basis van onze observatie legt een volwassen vrouwtje gemiddeld 6 eieren per dag.
    2. Observeer de pepertrips dagelijks. Voeg elke 4 dagen 8-10 druppels gefilterd water toe aan de papieren handdoek. Voeg elke 4 dagen een verse mangobladschijf toe aan de container, voordat het oude blad uitdroogt.
      OPMERKING: 1st instar larven komen in ~7-10 dagen uit tot volwassenen, afhankelijk van de omgevingsfactoren zoals temperatuur en vochtigheid.
    3. Observeer de populatie pepertrips dagelijks totdat de trips zich ontwikkelen tot volwassen trips, en herhaal de stappen uit stap 1.1.4 voor het behoud van de populatie op de lange termijn.
  3. Massale opkweek van pepertrips
    1. Verzamel vrouwelijke volwassenen uit de onderhouden populatie en bereid een glazen kweekcontainer voor op basis van de bovenstaande stappen.
    2. Breng 10 volwassen vrouwtjes over in de container en volg de stappen van stap 1.1.4 tot 1.1.10 om een blad met eieren te verkrijgen.
      LET OP: Een volwassen vrouwtje legt gemiddeld 6 eieren per dag.
    3. Breng de larven van ~120 1st instar voorzichtig over in een nieuwe glazen kweekbak met behulp van een kwast.
    4. Observeer de pepertrips dagelijks. Voeg elke 4 dagen 8-10 druppels gefilterd water toe op de papieren handdoek. Voeg elke 4 dagen een verse mangobladschijf toe aan de container voordat het oude blad uitdroogt.
    5. Verzamel 1st instar-larven 5-7 dagen nadat de eieren zijn gelegd; verzamel 2e instar-larven na 7-10 dagen; verzamel volwassenen na ~14 dagen voor de bioassay (Figuur 2).
      OPMERKING: Observeer de morfologie om verschillende stadia van pepertrips te onderscheiden voor verdere experimenten (Figuur 2).

2. Moleculaire identificatie van pepertrips

OPMERKING: Tripsen die op het veld worden verzameld, moeten tot op soortniveau worden geïdentificeerd door moleculaire identificatie met behulp van een fragment van het mitochondriale cytochroomoxidase I (COI)-gen, een veelgebruikte marker voor chilitrips17,18.

  1. Extractie van genomisch DNA van chilitrips
    1. Verzamel een volwassen pepertrips in een centrifugebuis van 1,5 ml (Materiaaltabel).
    2. Homogeniseer de chilitrips met behulp van een pelletstamper en isoleer vervolgens genomisch DNA met behulp van de commerciële kit volgens het protocol van de fabrikant (Materiaaltabel).
  2. PCR-amplificatie en DNA-sequencing
    1. Amplificeer het verwachte DNA-fragment van de chilitrips met behulp van PCR Master Mix (2x) met een COI-primerpaar, voorwaartse primer LCO 1490 en omgekeerde primer HCO 2198, die het gedeeltelijke mitochondriale COI-gen amplificeert (Table of Materials).
      1. Bereid een PCR-mengsel van 20 μl voor met 2 μl tripsgenomische DNA-sjabloon, 1 μl voorwaartse en achterwaartse primers, 10 μl 2x PCR Master Mix en 6 μl ddH2O (materiaaltabel).
      2. Voer de PCR uit met een Thermal Cycler onder de volgende cyclusomstandigheden: initiële denaturatie bij 94 °C gedurende 2 min, 35 cycli van 94 °C gedurende 30 s, 52 °C gedurende 1 min, 72 °C gedurende 1 min, gevolgd door een uiteindelijke verlenging van 72 °C gedurende 10 minuten (Materiaaltabel).
    2. Controleer het PCR-amplicon door elektroforese in een 1% agarosegel om het resultaat van de amplificatie te verifiëren (Figuur 3).
    3. Snijd de doelband weg (de verwachte amplicongrootte was 658 bp) en zuiver de COI PCR-amplicon van de chilitrips met behulp van een gel/PCR-zuiveringskit volgens het protocol van de fabrikant. Stuur het gezuiverde product voor sequencing via een commerciële sequencingservice. (Tabel met materialen).
  3. Sequentie analyse
    1. Beoordeel de sequentiekwaliteit met behulp van de software waarnaar wordt verwezen (Materiaaltabel).
    2. Open het FASTA- of TXT-bestand en snijd handmatig de basissen van lage kwaliteit bij aan zowel de 5" als de 3" uiteinden door de ongewenste sequenties te verwijderen.
    3. Voer een BLAST-zoekopdracht uit in de NCBI-database (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) met behulp van standaardparameters om de soortidentiteit te bevestigen.

3. Bereiding van entomopathogene schimmels

OPMERKING: De EPF-isolaten die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in tabel 1.

  1. Herstel van schimmelisolaten uit de bibliotheek met schimmelbronnen
    1. Ontdooi de geconserveerde schimmelconidiabouillon (conidia gesuspendeerd in 30% glycerine) uit een vriezer van -80 °C.
    2. Breng ongeveer 10 μl van de conidia suspensie over en verdeel gelijkmatig over een 5,5 cm 1/4 Sabouraud dextrose agar (SDA) plaat met behulp van een celspreider in een laminaire stromingskap. Het medium wordt bereid door 0,75 g Sabouraud dextrosebouillon en 1,5 g agar te mengen in 100 ml dubbel gedestilleerd water (ddH2O) (Materiaaltabel).
    3. Sluit de petrischaal af met parafilm (Tabel van materialen) en breng de plaat gedurende 10-14 dagen over in de donkerbroedmachine bij 25 °C.
    4. Subcultureer het actief groeiende schimmelmycelium door op een verse 1/4 Sabouraud dextrose-agar (SDA) plaat te strijken. Incubeer schimmels gedurende 10-14 dagen in het donker bij 25 °C om de conidiale ontwikkeling vóór de oogst mogelijk te maken.
      OPMERKING: Gebruik schimmelculturen die ongeveer 10 dagen oud zijn voor volgende bioassays. Culturen ouder dan 14 dagen worden niet aanbevolen voor virulentietesten vanwege mogelijke verminderingen van de levensvatbaarheid van conidials.
  2. Bereiding van conidia suspensie
    1. Voeg 2-3 ml 0,03% Tween 80 toe aan het oppervlak van een 10-14 dagen oude schimmelcultuur op 1/4 SDA. Schraap de conidia voorzichtig met behulp van een steriele lus (Tabel met materialen).
    2. Breng de schimmelsuspensie over in een schone centrifugebuis van 15 ml.
    3. Homogeniseer de suspensie door vortex op de maximale snelheid en filtreer deze door filterpapier om hyfaal vuil te verwijderen en een zuivere conidia suspensie te verkrijgen.
    4. Gebruik een hemocytometer (materiaaltabel) om het aantal conidia onder een lichtmicroscoop te controleren en verdun de suspensie tot 108 conidia/ml.
    5. Breng de conidiale suspensie over in een microsproeier die is gesteriliseerd met UV-licht voor daaropvolgende bioassaytoepassing.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de conidiale suspensie voor elke overdracht grondig wordt gevortexed om bezinking te voorkomen. Steriliseer de microsproeier voor gebruik door deze gedurende 30 minuten bloot te stellen aan ultraviolette straling in een laminaire stromingskap.

4. Virulentiescreening tegen pepertrips

  1. Bereiding van 2e instar larven
    1. Verzamel de 2e instar-larven door de stappen 1.3.1-1.3.5 te volgen voor het volgende experiment.
      OPMERKING: Onderscheid de2e instar-larven aan de hand van hun gele lichaamskleur en brede buik in vergelijking met de eerste instar-larven (Figuur 2).
  2. Voorbereiding van de inoculatiecontainer
    LET OP: Selecteer de bladsoort op basis van het doelgewas van pepertrips. In dit onderzoek werden chilitrips verzameld uit het veld met aangetaste blauwe bes 'Biloxi' (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp) bladeren. Daarom zal de bioassay van EPF tegen chilitrips worden uitgevoerd op blauwe bessenbladeren.
    1. Verzamel jonge bosbessenbladeren van een bosbessenkwekerij en was de bosbessenbladeren om oppervlaktestof en eventuele andere geleedpotigen te verwijderen.
    2. Droog de bladeren aan de lucht of gebruik papieren handdoeken om water weg te vegen; Controleer vervolgens het oppervlak van de bosbessenbladeren op andere geleedpotigen of eieren onder een stereomicroscoop. Verwijder eventuele geleedpotigen, indien aanwezig.
    3. Snijd een bladschijf met een diameter van 2,8 cm af met een leren snijder (materiaaltabel), desinfecteer het blad met 1% bleekmiddel (natriumhypochlorietoplossing) en spoel 2x af met gesteriliseerd water om eventuele bleekresten op bladeren te verwijderen.
      NOTITIE: Bereid de bladschijf voor voordat de agar stolt om ervoor te zorgen dat de bladschijf goed in de wateragar kan worden ingebed.
    4. Autoclaaf een 2,5% wateragaroplossing (2,5 g agar per 100 ml ddH2O) voor sterilisatie.
    5. Giet 3 ml 2,5% wateragar in kleine glazen recipiënten (35 mm hoog, 30 mm binnendiameter) in een laminaire stromingskap voordat de agar stolt. Laat de agar afkoelen tot ongeveer 40 °C tot hij een halfvaste toestand bereikt.
    6. Plaats de bladschijf (met de adaxiale kant naar boven) voorzichtig op de agar en veranker deze lichtjes met minimale blootstelling boven het agaroppervlak. Zodra de wateragar volledig is gestold, zijn de glazen containers klaar voor de bioassay.
  3. EPF-inoculatie en observatie
    1. Draai de conidiale suspensie voorafgaand aan het aanbrengen grondig. Breng met behulp van een microsproeier gelijkmatig 0,1 ml van de suspensie (bereid in stap 3.2.4) aan op het oppervlak van elke bladschijf vanaf een afstand van ongeveer 10 cm in de glazen houder.
      OPMERKING: Test de spuitgebieden voor het experiment. Zorg ervoor dat het spuiten de hele bladschijf gelijkmatig bedekt met een dunne laag. Als druppels zich ophopen in stilstaand water op het blad, verminder dan het inoculatievolume om overbevochtiging te voorkomen.
    2. Laat de conidia suspensie op het blad 30 minuten aan de lucht drogen onder steriele omstandigheden (bijv. in een laminaire stromingskap).
    3. Breng 10 van de 2e instar-larven over in elke container met behulp van een fijne verfborstel en sluit elke glazen kweekcontainer af met twee lagen parafilm.
    4. Maak ~30 kleine gaatjes door een #00 insectenpin (Table of Materials) te gebruiken voor ventilatie.
    5. Inoculeer de container bij 25 ± °C incubator met ~70% relatieve vochtigheid en een fotoperiode van L:D = 12 uur: 12 uur.
    6. Observeer en registreer de mortaliteit van chilitrips onder een stereomicroscoop met een vergroting van 10x per dag gedurende 7 dagen.
    7. Bewaar de dode larven in de glazen container voor observatie van mycose om de EPF-infectie te bevestigen.

5. Bioassay van geselecteerde EPF-isolaten

OPMERKING: Voor een dosisafhankelijke bioassay tegen pepertrips kan worden gekozen voor het meest virulente EPF-isolaat of meerdere isolaten met een hoge virulentie. Drie verschillende conidiale concentraties, variërend van 106 tot 108 conidia/ml, werden gebruikt om de relatie tussen dosis en pathogeniteit te beoordelen.

  1. Bereiding van conidia suspensie
    1. Herstel het geselecteerde EPF-isolaat volgens stap 3.1.
    2. Bereid drie concentraties conidia suspensies (106, 107 en 108 conidia/ml) zoals beschreven in stap 3.2.
  2. Bereiding van 2e instar larven
    1. Verzamel de larven van de tweede instar door stap 4.1 te volgen om nieuw uitgekomen volwassenen te verkrijgen.
  3. Voorbereiding van de inoculatiecontainer
    1. Volg stap 4.2. Om de inoculatiecontainer voor te bereiden met bosbessenbladschijven ingebed in wateragar.
  4. EPF-inoculatie en observatie
    1. Voer de EPF-inoculatie uit met drie concentraties conidia suspensie, zoals beschreven in stap 4.3.

6. Statistische analyse

  1. Berekening van de sterfte
    1. Transformeer de mortaliteitsgegevens van elke schimmelstam door Arcsin-transformatie voorafgaand aan het uitvoeren van eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) om verschillen tussen schimmelbehandelingen te beoordelen (significantieniveau ingesteld op p < 0,05).
    2. Voer post-hoc vergelijkingen van behandelingsmiddelen uit met behulp van Tukey's Honest Significant Difference (HSD)-test.
  2. Berekening van de mediane letale tijd (LT50) en de mediane letale concentratie (LC50)
    1. Bereken de mediane letale tijd (LT50) en de mediane letale concentratie (LC50) met behulp van Probit-regressieanalyse.
    2. Maak en vul variabelen in met de naam 'totaal', 'respons' en 'duur' (voor LT50) of 'concentratie' (voor LC50) met de waargenomen gegevens in de software-interface.
      OPMERKING: Als de cumulatieve mortaliteit binnen de observatieperiode niet hoger is dan 50%, kunnen LT50- en/of LC50-waarden niet betrouwbaar worden geschat.
    3. Voer Probit-analyse uit door te navigeren naar Analyseren | Regressie | Probit. Stel het "totaal" in als het totale aantal geteste insecten, "respons" als het aantal dode insecten en "duur" of "concentratie" als de covariabele. Stel het significantieniveau voor de heterogeniteitsfactor in op 0,05 door op Opties te drukken en het significantieniveau voor het gebruik van de heterogeniteitsfactor in te stellen op 0,05.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het experimentele stroomschema dat in deze studie werd gepresenteerd, toonde aan dat het stabiele opkweeksysteem van de pepertrips kon worden vastgesteld, beginnend bij het verzamelen op het veld tot het screenen van de virulentie van EPF-isolaten (Figuur 1). Hoewel morfologische waarneming chilitrips kan onderscheiden van andere trips, kan het gebruik van de gedeeltelijke COI-sequentie als moleculaire marker, inclusief PCR-a...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Chili-trips is een wereldwijd belangrijke plaag die tal van economisch belangrijke gewassen aantast, zoals maïs, pinda, paprika, soja, aardbei, zoete aardappel en tomaat 1,11,19. De huidige bestrijdingsstrategieën zijn gebaseerd op geïntegreerde benaderingen met culturele praktijken, biologische bestrijdingsmiddelen en chemische behandelingen, waaronder het gebruik van natuurlijke vijanden, nema...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling bij dit werk.

Dankbetuigingen

We danken in het bijzonder de heer Lin, Huanf-Jen van de blauwe bessenboerderij Humi (Wufeng Dist., Taichung City), die de blauwe bessenplanten leverde. Dit onderzoek werd ondersteund door 113-2313-B-005 -024 -MY3 van de National Science and Technology Council (NSTC).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#00 insect pinEntosphinx DMM0220Made in UK
1.5 mL centrifuge tubeCorning incorporatedMCT-175-CMade in USA
10 μL Inoculating LoopNEST Scientific718201Made in USA
100 bp DNA Ladder IIIGeneaidDL007Made in Taiwan.
2x SuperRed PCR Master MixBiotoolsTE-SR01Made in Taiwan
6 cm Petri dishAlpha Plus Scientific16021Made in Taiwan
agarBioman ScientificAGR001.1Microbiology grade
agaroseBioman ScientificPB1200Made in Taiwan
BioGreen Safe DNA Gel BufferBioman ScientificSDB001TMade in Taiwan
Easy DNA High-Speed Extraction Tissue KitFisher BiotecET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (Made in Australia)
Forward primer: LCO 1490Genomics PO-PR220919G6Sequence: 5’-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’
GenepHlow Gel/PCR KitGeneaidDFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
glass rearing container Sunshine Lab Equipment companySize: 35 mm in height, 45 mm in inner diameter. Can be repalce by any simular size of plastic or glass cup.
hemocytometerPaul Marienfeld640030Made in Germany
incubatorHipointF740Made in Taiwan
leather cutterReal Handmade Workshophttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
MiniAmp Thermal CyclerThermo Fisher ScientificA37834Made in USA
optical microscope Nikon Ci-LMade in Japan
painting brushTian Cheng brush company4716608400352Can be replace by fine-tipped watercolor brush, equivalent to a size 0 or 1 round brush.
paper towelmay flowerBLS007-8Made in Taiwan
Parafilm MBemisPM-996Made in USA
pellet pestleBioman ScientificGT100RMade in Taiwan
Reverse primer: HCO 2198Genomics PO-PR220919G6Sequence: 5’-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’
Sabouraud Dextrose BrothHiMediaMH033-500GMade in India
stereomicroscopeSoptopSZN71Made in Taiwan
TAE buffer 50XBioman ScientificTAE501000Made in Taiwan
Tween 80PanReac AppliChem142050.1661Made in Taiwan
zipper bagwenchen plastic company1809000061size: 12 cm in wide and 17 centimeters in long. (Made in Taiwan)

Referenties

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
  2. Hoddle, M. Scirtothrips dorsalis (chilli thrips). CABI Compendium. , Wallingford, CT, USA. (2022).
  3. Liburd, O. E., Panthi, B. R., Phillips, D. A. Chilli thrips on blueberries in Florida: ENY2053/IN1298. EDIS. 2020 (6), (2020).
  4. Gopal, K., Krishna Reddy, M., Reddy, M., Muniyappa, V. Transmission of peanut yellow spot virus (PYSV) by thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in groundnut. Arch Phytopathol Plant Prot. 43 (5), 421-429 (2010).
  5. Prasada Rao, R., et al. The host range of tobacco streak virus in India and transmission by thrips. Ann Appl Biol. 142 (3), 365-368 (2003).
  6. Chang, J. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Front Sustain Food Syst. 5, 596316(2021).
  7. Yang, C. J., Nai, Y. S. Assessment of aphidicidal effect of entomopathogenic fungi against mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J Vis Exp. (197), e65312(2023).
  8. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. J Vis Exp. (175), e62882(2021).
  9. Aristizábal, L., Chen, Y., Cherry, R., Cave, R., Arthurs, S. Efficacy of biorational insecticides against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae), infesting roses under nursery conditions. J Appl Entomol. 141 (4), 274-284 (2017).
  10. Francis, J. R., Manchegowda, H. K. Molecular phylogenetic identification of Metarhizium and Beauveria and their bio-efficacy against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. Int J Trop Insect Sci. 43 (3), 909-918 (2023).
  11. Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).
  12. Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae). Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).
  13. Panyasiri, C., et al. Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant. Insects. 13 (8), 684(2022).
  14. Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis). Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).
  15. Han, D., et al. Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae). Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).
  16. Tatara, A. Effect of temperature and host plant on the development, fertility and longevity of Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae). Appl Entomol Zool. 29 (1), 31-37 (1994).
  17. Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification. Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).
  18. Silva, R., et al. Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region. Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).
  19. Venette, R., Davis, E. Chilli thrips/yellow thrips, Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae) mini pest risk assessment. , Univ Minnesota Tech Bull. (2004).
  20. Mandi, N., Senapati, A. Integration of chemical, botanical and microbial insecticides for control of thrips, Scirtothrips dorsalis Hood infesting chilli. J Plant Prot Sci. 1 (1), 92-95 (2009).
  21. Samota, R., Jat, B., Choudhary, M. D. Efficacy of newer insecticides and biopesticides against thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in chilli. J Pharmacogn Phytochem. 6 (4), 1458-1462 (2017).
  22. Panthi, B. R., Renkema, J. M., Lahiri, S., Liburd, O. E. The short-range movement of Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae) and rate of spread of feeding injury among strawberry plants. Environ Entomol. 50 (1), 12-18 (2021).
  23. Priyanka, T., et al. Biology and morphometrics of Thrips parvispinus (Karny) (Thysanoptera: Thripidae) on chilli, Capsicum annuum L. Pest Manag Hortic Ecosyst. 30 (1), 85-92 (2024).
  24. Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies. Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).
  25. Xu, X. M., Guerin, L., Robinson, J. Effects of temperature and relative humidity on conidial germination and viability, colonization and sporulation of Monilinia fructigena. Plant Pathol. 50 (5), 561-568 (2001).
  26. Lee, S. J., et al. Transcriptional response of bean bug (Riptortus pedestris) upon infection with entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana JEF-007. Pest Manag Sci. 75 (2), 333-345 (2019).
  27. Yang, Y. -T., et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae). Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).
  28. Qayyum, M. A., et al. Entomopathogenic fungi: prospects and challenges. Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Bioassay op losgekoppelde bladerenmassaproductiebiologische bestrijdinglaboratoriumkweekschimmelisolaten
Opzetten van een kweeksysteem voor chilitrips (Scirtothrips dorsalis hood) voor virulentiescreening van entomopathogene schimmels
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.