Dit protocol beschrijft een fixatiesysteem voor ultrasone transducers dat speciaal is ontworpen voor ultrasone stimulatie van het ruggenmerg bij wakkere muizen. De methode maakt gebruik van een fixatiesysteem om een nauwkeurige positionering van de ultrasone transducer te garanderen en tegelijkertijd de proefpersonen vrij te laten bewegen zonder de precisie van de stimulatie in gevaar te brengen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fixatie van ultrasone transducers voor neuromodulatie van het ruggenmerg bij muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gefocusseerde echografie (FUS) is naar voren gekomen als een innovatieve niet-invasieve neuromodulatietechnologie die een aanzienlijk potentieel heeft voor neurale regulatie van het ruggenmerg. Het bereiken van een stabiele transducerfixatie langs de wervelkolom brengt echter opmerkelijke technische uitdagingen met zich mee. Bestaande immobilisatiemethoden vereisen vaak langdurige anesthesie bij dieren of vertonen onvoldoende hechtingsbetrouwbaarheid. Deze kritieke beperkingen onderstrepen de dringende noodzaak om een nieuw fixatieparadigma te ontwikkelen dat zowel operationele stabiliteit als fysiologische compatibiliteit garandeert. Dit protocol introduceert een innovatief fixatiesysteem voor ultrasone transducers voor stimulatie van het ruggenmerg bij wakkere, vrij bewegende muizen. Het opzetten van een betrouwbare methode voor nauwkeurige plaatsing van ultrasone transducers op de wervelkolom is essentieel voor neurostimulatie-experimenten. Deze methode integreert drie fasen: chirurgische blootstelling van het T13-wervellichaam, precisieslijpen van de processus spinosus om een vlakke contactinterface te creëren, en veilige hechting van de metalen basis en collimator aan de wervelkolom met behulp van prothesebasismateriaal en lijmmengsel. Het maakt natuurlijk motorisch gedrag mogelijk door onbeperkte beweging en zorgt voor een stabiele positionering met minimale ruimtelijke variatie tussen sessies, waardoor onderzoek naar echo-gemedieerde ruggenmerginterventies in bewuste diermodellen wordt vergemakkelijkt. Het is met name relevant voor onderzoeken die gedragsbeoordelingen vereisen op het gebied van herstel van ruggenmergletsel, modulatie van de bloed-ruggenmergbarrière en chronische pijnmechanismen. Door een kritieke technische uitdaging aan te gaan in het onderzoek naar neuromodulatie bij wakkere dieren, biedt dit protocol een stabiele transducer-spinale interface zonder bewegingsbeperking, wat de weg vrijmaakt voor nauwkeurigere en betrouwbaardere experimentele resultaten.
Inleiding
Het ruggenmerg is een cruciaal knooppunt voor de integratie van informatie tussen het centrale en perifere zenuwstelsel, waardoor het waardevol is voor klinisch onderzoek op gebieden zoals transductie van pijnsignalen, reconstructie van motorische neurale netwerken en regulatie van neuroplasticiteit. Gefocusseerde echografie (FUS), een opkomende niet-invasieve neuromodulatietechnologie, is een belangrijk middel geworden voor neurale regulatie van het ruggenmerg. Met zijn fysieke kenmerken van diepe weefselpenetratie, ruimtelijke resolutie op millimeterniveau en controleerbare energie-outputparameters, strekt de toepassing zich uit van fundamenteel onderzoek naar neuromechanismen tot preklinische vertaalstudies van verschillende pathologische modellen van het ruggenmerg.
Onderzoek toont aan dat FUS neurale circuits van het ruggenmerg op twee manieren kan reguleren: door ze te remmen of door ze te activeren door thermische en mechanische effecten. Het wordt ook gekenmerkt door zijn temporele omkeerbaarheid en veiligheid voor weefsels 1,2,3. In de studie van modellen voor ruggenmergletsel heeft FUS het motorisch vermogen van ratten verbeterd door ontstekingsreacties te moduleren en neuraal herstel te bevorderen 4,5,6. Bovendien is aangetoond dat FUS de bloed-ruggenmergbarrière opent en de efficiëntie van de lokale medicijnafgifte verbetert door middel van een door microbellen gemedieerd cavitatie-effect 7,8. Op het gebied van neuropathische pijn hebben Liao et al. bevestigd dat FUS neuropathische pijnmanifestaties bij ratten effectief verlicht door KCC2-expressie te reguleren en de CaMKIV KCC2-route9 te remmen. Song et al. toonden aan dat tsFUS met lage intensiteit toegepast op het lumbale ruggenmerg de mechanische allodynie significant verminderde en microgliale activering onderdrukte in een model voor chronische vernauwing bij ratten10. Het bereiken van nauwkeurige modulatie van het ruggenmerg met FUS hangt af van de ruimtelijke stabiliteit van het ultrasone energieafgiftesysteem. De huidige fixatiestrategieën zijn voornamelijk onderverdeeld in twee categorieën: 1) Rigide fixatiemethode: Het bereikt een nauwkeurige positionering door een stereotactisch frame te gebruiken, maar vereist continue anesthesie, die de neurale activiteit van de proefpersonen onderdrukt en de validiteit van gedragsbeoordelingen beïnvloedt 1,2,3,4,10 ; 2) Flexibele fixatiemethode: het maakt onderzoek naar bewuste proefpersonen mogelijk door gebruik te maken van een elastische riem, maar vanwege de grote mobiliteit van de wervelkolom zijn er verplaatsingsfouten en transducerloslating 6,8,9. Bovendien leidt de geometrische heterogeniteit van de lamina van de wervelkolom tot een aanzienlijke verzwakking van ultrasone energie, waardoor de efficiëntie van neurale modulatie wordt verminderd 7,8.
Deze studie stelt op innovatieve wijze een implanteerbaar gefocusseerd fixatieschema voor ultrasone transducers voor onderzoek naar neurale modulatie van het ruggenmerg bij bewuste, vrij bewegende muizen. Dit protocol maakt gebruik van een minimaal invasieve chirurgische benadering om de metalen basis, collimator en wervelkolom te integreren, ondersteunt het herhaaldelijk dragen van de ultrasone transducer, zorgt voor de consistentie van het ultrasone doel en houdt de ultrasone energieverzwakking door de lamina binnen een acceptabel bereik. De ontwikkelde methodologie richt zich op de kritische beperkingen van bestaande benaderingen, waardoor betrouwbaardere en reproduceerbare neuromodulatie-experimenten met het ruggenmerg mogelijk worden bij wakkere, zich gedragende dieren. De belangrijkste parameters zijn onder meer een incisie in de middellijn van 2,5 cm op T13, een fixatie op de roestvrijstalen metalen basis en een volumeverhouding van 3:1 tussen prothesebasismateriaal en cyanoacrylaatlijm. Beperkingen zijn onder meer matige chirurgische invasiviteit en operatorafhankelijke precisie bij de voorbereiding van het botoppervlak.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven die in deze studie worden beschreven, zijn goedgekeurd door het Institutional Ethical Committee of Animal Experimentation van Shenzhen Institutes of Advanced Technology (certificaatnummer: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). Alle experimenten gebruikten mannelijke C57BL/6J-muizen (8 weken oud). Muizen wogen 18-22 g op het moment van de operatie.
1. Anesthesie, inductie en onderhoud (5 ± 1 min)
- Laad het anesthesiecircuit 5 minuten voor.
- Stel de inductiekamer in om 4% isofluraan in medische lucht af te geven bij een debiet van 2 l/min.
- Schakel over op beademing van een gezichtsmasker na verlies van de oprichtreflex.
- Stel de verdamper zo af dat deze een concentratie van 1,5-2% isofluraan behoudt.
- Houd de lichaamstemperatuur van de muis met behulp van een warmhouddeken op 37 °C, met een streefbereik van 36-38 °C tijdens de anesthesie.
- Breng Terramycin oogzalf aan.
2. Positionering (1 ± 1 min)
- Gebruik een instelbare stereotactische adapter voor de muis.
- Buikligging van de muis met uitlijning van de wervelkolom om de fysiologische kromming van de wervelkolom te behouden.
- Zet de kop van de muis vast met behulp van oorstangen.
- Plaats de ledematen symmetrisch.
3. Voorbereiding van het chirurgisch veld (1 ± 1 min)
- Gebruik een elektrische tondeuse (mesafstand 0,1 mm) om het haar op de operatieplaats te verwijderen.
- Zorg ervoor dat het ontharingsgebied ongeveer 3 cm × 1 cm is.
- Voer drie scheerbeurten uit in de tegenovergestelde richting van de haargroei.
4. Incisie en benadering (2 ± 1 min)
- Veeg het gebied 3 keer af met jodofoor (intervallen van 30 s).
- Palpeer de laatste rib (bevestigd aan de T13-wervel bij muizen) en gebruik deze als
het belangrijkste herkenningspunt. Maak een incisie van 2,5 cm ter hoogte van de T13-wervels langs
de dorsale middellijn met behulp van een scalpel. - Ontleed achtereenvolgens de onderhuidse fascia.
- Leg de paraspinale spieren bloot door de anatomische vlakken.
5. Dissectie van de paraspinale spier (5 ± 1 min)
- Stel de vergroting van de chirurgische microscoop in op 5x voor een optimale visualisatie van paraspinale spieren en wervelstructuren.
- Voer een scherpe dissectie van de paraspinale spieren uit met behulp van een microschaar.
- Snijd de dorsale en laterale paraspinale spieren volledig weg met behoud van de ventrale spierlagen.
- Behandel bloedingen met resorbeerbaar hemostatisch gaas.
6. Installatie op metalen basis (1 ± 1 min)
- Monteer de bevestigingsstang (kunststof) op de stereotactische adapter.
- Monteer de op maat gemaakte metalen basis (roestvrij staal, 0,28 g) aan het distale uiteinde van de staaf (Afbeelding 1A).
- Plaats de op maat gemaakte metalen basis bilateraal bij de T13 spinale transversale processen.
- Controleer de stabiliteit van de koppeling.
7. Voorbereiding van de botinterface (2 ± 1 min)
- Verwijder achtergebleven spierweefsel van de lamina en processus spinosus onder de chirurgische microscoop.
- Bereik volledige hemostase met steriele compressie van katoenen pledgets.
- Creëer een vlak contactoppervlak met behulp van een precisiebotboor met continue zoute irrigatie. Laat de boor draaien met een snelheid van 5.000-10.000 tpm om de warmteontwikkeling te minimaliseren. Draag een oogbescherming en een masker tijdens het boren.
- Verwijder botstof met met zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes.
8. Afdichting bevestigingssysteem (3 ± 1 min)
- Meng basismaterialen voor kunstgebitten en cyanoacrylaatlijm (502-lijm) in een volumeverhouding van 3:1. Draag nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril om huid-/oogcontact te voorkomen.
- Bevestig de ultrasone collimator (plastic, 0,6 g, Figuur 1B) en de metalen basis aan de wervelkolom met behulp van het lijmmengsel (Figuur 1C).
- Laat het lijmmengsel uitharden onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden (24 ± 1 °C, 40-60% relatieve vochtigheid). Houd de statische positionering gedurende 60 s aan tot visuele bevestiging van volledige stolling (verlies van oppervlakteglans en vorming van een stijve interface).
- Scheid de metalen basis van de plastic bevestigingsstang.
- Verificatie van de fixatiestabiliteit: Oefen een lichte rotatiekracht uit op de metalen basis in het horizontale vlak. Observeer de collimator-wervelinterface onder een vergroting van 5x voor elke verplaatsing (tolerantie van <0,1 mm). Als de beweging de tolerantie overschrijdt, breng dan het lijmmengsel opnieuw aan (stap 8.2) en herhaal de uitharding (stap 8.3).
9. Wondsluiting (1 ± 1 min)
- Lijn de wondranden uit om de metalen basis volledig in te kapselen.
- Voer onderbroken hechting uit met 4-0 zijden hechtingen.
- Veeg de incisie af met jodofoor.
- Verwijder achtergebleven bloed-/botresten op de laminaire blootstellingsplaats van de collimator en pak deze in met steriel katoen voor afdichting en hemostase.
10. Postoperatieve behandeling
- Thermoregulatie: Houd de muis op een verwarmende deken (37°C) totdat het lopen volledig is hersteld (meestal 2-3 uur na de anesthesie).
- Postoperatieve antibiotische profylaxe: Dien cefazoline-natrium (50 mg/kg, opgelost in 0,9% zoutoplossing toe tot een concentratie van 50 mg/ml) via subcutane injectie in het dorsale nekgebied onmiddellijk na de operatie.
- Zorg voor wondhygiëne. Reinig de wond de eerste 3 dagen eenmaal daags met een met zoutoplossing bevochtigd wattenstaafje en inspecteer de operatieplaats dagelijks op tekenen van infectie, dehiscentie of ontsteking.
- Postoperatieve analgesie: Carprofen (5 mg/kg, subcutaan) elke 12 uur toedienen gedurende 3 dagen na de operatie11.
OPMERKING: Figuur 1D toont het fixatiesysteem dat na herstel in een levende muis is geïmplanteerd.
11. Verwijdering van gevaarlijke afvalstoffen
- Verzamel botstof en met bloed verontreinigde materialen in lekvrije zakken voor biologisch gevaarlijk afval die zijn geëtiketteerd met "Biohazard"-symbolen voor overdracht naar een erkende faciliteit voor de verwijdering van medisch afval.
- Plaats niet-uitgehard prothesebasismateriaal en 502 lijmresten in verzegelde chemisch bestendige containers met het label "Chemisch afval" en bewaar ze in een daarvoor bestemde geventileerde kast voor verwijdering via protocollen voor het beheer van chemisch afval.
- Gooi naalden, scalpelmesjes en botboren weg in prikbestendige naaldcontainers die zijn gemarkeerd met "Biohazard"-labels.
12. Veiligheidswaarschuwingen
- Vermijd bij het hanteren van materialen op basis van kunstgebitten direct huidcontact door nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril te dragen, en voer het mengen en uitharden uit in een goed geventileerde zuurkast om het inademen van vluchtige monomeren te minimaliseren.
- Gooi restmateriaal weg als chemisch afval volgens de richtlijnen van de instelling. Voor 502 cyanoacrylaatlijmen, voorkom huid- of oogcontact en spoel onmiddellijk af met water gedurende 15 minuten als blootstelling optreedt, en zoek medische hulp. Gebruik ze in geventileerde ruimtes, bewaar ze op koele, droge plaatsen uit de buurt van ontstekingsbronnen en vermijd contact met katoenen of wollen stoffen.
- Zet bij het gebruik van precisieboren het handstuk vast, draag een gelaatsscherm en een chirurgisch masker en irrigeer de boorlocatie met zoutoplossing om thermisch letsel te voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Open veld test
De openveldtest was ontworpen om mogelijke gedragsveranderingen bij muizen na een operatie te evalueren (Figuur 2A). Een standaard open veldkamer van 40 cm × 40 cm werd gebruikt om voldoende activiteitsruimte voor de muizen te garanderen, terwijl de relatief consistente omgevingsomstandigheden behouden bleven en externe interferentie tot een minimum werd beperkt. Het experiment bestond uit twee fasen: voor de operatie en 7 ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Deze studie presenteert een nieuw protocol voor wervelkoppeling dat nauwkeurige ultrasone neuromodulatie van het ruggenmerg mogelijk maakt bij wakkere, zich vrij gedragende muizen. In tegenstelling tot conventionele fixatiebenaderingen, overwint deze methodologie de beperkingen van conventionele fixatiebenaderingen. In tegenstelling tot stijve stereotactische frames die continue anesthesie nodig hebben (die neurale activiteit onderdrukt en gedragsbeoordelingen bemoeilijkt
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het High-Level Talent Scientific Research Startup Project van het University of Hong Kong-Shenzhen Hospital in het kader van Grant HKUSZH202207003. We danken oprecht alle laboratoriumleden voor hun hulp bij protocoloptimalisatie en dierenverzorging, en Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences (SIAT), voor hun institutionele steun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Anesthesia Inductiekamer | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Cyanoacrylaatlijm (502 Lijm) | Beijing Chemical Works | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=true&id=736 869038961<k2=1752156592779 mdbp47qqp4vyv57mq156e&ns=1& priceTId=214780251752156543206 3926e1996&query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82&skuId=52584 34238219 | |
| Basismaterialen voor kunstgebitten | New Century Dental | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Fixatiestang | Op maat | ||
| Isofluraan | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Metaalbasis | Op maat | ||
| Micro-instrument | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | ||
| Precisieboor | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Multikanaals anesthesiesysteem voor kleine dieren | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Stereotactische adapter voor muizen en jonge ratten | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =true&id=651346369142<k2=1752 157416717wlsrozz5uroehtbq5ycim4 &ns=1&priceTId=214781ce1752157 3520498589e101a&query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A&skuId=4891677573 207&spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D&xxc= taobaoSearch | |
| Chirurgisch microscoop | Shenzhen Zongshi Scientific Instruments Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Chirurgische hechtdraad (Prolene) | Ethicon (Johnson & Johnson) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =true&id=774292384846<k2= 1752157506907c0321finubb5 rpkub6av6n&ns=1&priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a&query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF&skuId=594224 1331046&spm=a21n57.1.hoverI | |
| Terramycin oogzalf | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Ultrasoon collimator | Op maat |
Referenties
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
