Methodenartikel

Multi-omics-technieken voor het profileren van chromatinetoestandsovergangen in primaire cholangiocyten van muizen met weinig input

DOI:

10.3791/68606

⸱

3 juli 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit manuscript presenteert een uitgebreid protocol voor low-input ChIP-seq om histonmodificaties te profileren en ATAC-seq om de toegankelijkheid van chromatine in kleine hoeveelheden primaire cholangiocyten van muizen te beoordelen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Polycysteuze leverziekte (PLD) is een erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door de vorming van met vloeistof gevulde cysten afgeleid van cholangiocyten, wat leidt tot progressieve ziekte en een significante vermindering van de kwaliteit van leven van patiënten. De huidige behandelingen voor PLD zijn ontoereikend, wat de noodzaak van nieuwe therapeutische strategieën benadrukt. De rol van epigenetische regulatie in de progressie van PLD, met name de toegankelijkheid van chromatine en histonmodificaties, blijft onderbelicht. Traditionele epigenetische profileringstechnieken, zoals ChIP-seq en DNase-seq, vereisen grote aantallen cellen, die moeilijk te verkrijgen zijn uit primaire cholangiocyten. Om dit aan te pakken, hebben we ChIP-seq- en ATAC-seq-protocollen met lage input geoptimaliseerd voor een laag aantal primaire cholangiocyten. Deze benaderingen maken de analyse van histonmodificaties en de toegankelijkheid van chromatine mogelijk met minimale celinput. Low-input ChIP-seq maakt gebruik van microkokkennuclease (MNase) voor DNA-fragmentatie, terwijl ATAC-seq Tn5-transposase gebruikt om open chromatinegebieden vast te leggen. Deze multi-omics-technieken bieden waardevolle inzichten in de dynamiek van de chromatinetoestand tijdens overgangen van het lot van cholangiocyten bij PLD en andere galaandoeningen. Belangrijk is dat de geoptimaliseerde protocollen met vertrouwen toepasbaar zijn op andere primaire cellen met weinig input, waardoor epigenetische mechanismen in verschillende cellulaire contexten kunnen worden onderzocht. Dit werk presenteert een systematische benadering voor het bestuderen van veranderingen in de chromatinetoestand, wat bijdraagt aan de ontwikkeling van epigenetische gebaseerde therapeutische strategieën voor PLD en aanverwante ziekten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLD is een erfelijke aandoening die wordt gekenmerkt door de ontwikkeling van meerdere met vloeistof gevulde cysten afgeleid van cholangiocyten. Naarmate deze cysten zich geleidelijk uitbreiden, hebben ze een ernstige invloed op de kwaliteit van leven van patiënten 1,2. Bestaande behandelingsstrategieën voor PLD zijn ontoereikend en bieden slechts beperkte voordelen, terwijl ze vaak leiden tot hoge recidiefpercentages en complicaties 3,4. Daarom is er een dringende behoefte aan veiligere en effectievere therapeutische benaderingen om de onopgeloste klinische uitdagingen bij de behandeling van PLD aan te gaan.

Onder normale omstandigheden blijven cholangiocyten in rust, terwijl ze bij PLD overmatige proliferatie vertonen, een belangrijke aanjager van ziekteprogressie 5,6. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze cystische overgang blijven onduidelijk. Hoewel epigenetische regulatie, inclusief de toegankelijkheid van chromatine en histonmodificaties, een cruciale rol speelt bij de overgang van het lot van cellen 7,8, blijft de rol ervan bij de progressie van PLD onderbelicht. Veel epigenetische profileringstechnieken vereisen echter een groot aantal cellen. Traditionele ChIP-seq, die berust op chromatinefragmentatie door sonicatie, evenals chromatine-toegankelijkheidstesten zoals DNase-seq en MNase-seq, vereisen doorgaans meer dan 106 cellen - veel meer dan het aantal dat kan worden verkregen uit primaire cholangiocyten.

Dit manuscript biedt een uitgebreid protocol voor low-input ChIP-seq 9,10,11 om histonmodificaties te profileren en ATAC-seq 11,12,13 om de toegankelijkheid van chromatine in lage aantallen primaire cholangiocyten te beoordelen. Low-input ChIP-seq gebruikt MNase om DNA9 te fragmenteren, terwijl ATAC-seq DNA-fragmenten uit open chromatinegebieden vastlegt met behulp van Tn5-transposase12. Multi-omics-analyse die gebruik maakt van deze benaderingen biedt waardevolle inzichten in de dynamiek van de chromatinetoestand tijdens de overgang van het lot van cholangiocyten bij PLD en andere galaandoeningen, waardoor de ontwikkeling van epigenetisch gerichte therapieën wordt vergemakkelijkt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van oplossingen en cholangiocyten voor ATAC-seq

  1. Bereid ten minste 1 dag voorafgaand aan het ATAC-seq-experiment de ATAC-lysisbuffer voor met behulp van de reagentia die in tabel 1 worden vermeld.
    LET OP: ATAC Lysis Buffer kan minimaal 1 maand in het donker bij 4 °C worden bewaard.
  2. Voor vers geïsoleerde primaire cholangiocyten14 telt u de cellen met behulp van een hemocytometer onmiddellijk na isolatie en gaat u verder met het ATAC-seq-experiment.
    OPMERKING: Hoe eerder hoe beter om de impact op de levensvatbaarheid van de cellen te minimaliseren. Als het echter op ijs wordt bewaard, is het over het algemeen geen probleem om binnen 2 uur verder te gaan.

2. ATAC-seq

OPMERKING: Gebruik 100.000 cholangiocyten voor ATAC-seq. Bewaar de monsters en oplossingen op ijs. Voor het ATAC-seq-experiment duurt de hele procedure ongeveer 2 dagen.

  1. Centrifugeer 5 minuten bij 500 × g bij 4 °C.
  2. Gooi het supernatant weg, voeg 200 μL ATAC Lysis Buffer met proteaseremmer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 20 minuten op ijs. Piket de eerste 10 minuten voorzichtig om te mengen.
  3. Centrifugeer bij 1.500 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  4. Bereid de transpositiereactiebuffer (50 μl) voor door 3 μl enzymmix uit de ATAC DNA Library Prep Kit, 10 μl 5x buffer uit de ATAC DNA Library Prep Kit en 37 μl nucleasevrij water te mengen. Meng.
  5. Gooi het supernatant voorzichtig weg, plaats de verzamelde nucleaire pellet op ijs en voeg onmiddellijk 50 μL Transposition Reaction Buffer toe. Resuspendeer voorzichtig en incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C, waarbij je elke 10 minuten tegen de bodem van de buis veegt om te mengen.
    OPMERKING: Bereid de transpositiereactiebuffer voor voordat u het bovenstaande weggooit om te voorkomen dat de cellen uitdrogen.
  6. Zuiver DNA met behulp van de PCR-zuiveringskit volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Resterende proteïne G-kralen van het cholangiocyt-isolatieproces14 kunnen in deze stap worden verwijderd. DNA-monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C voor langdurige bewaring.
  7. Voer de opbouw van de bibliotheek uit met behulp van de ATAC DNA Library Prep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: Bewaar alle monsters en oplossingen op ijs, tenzij anders aangegeven. Hoewel de procedures kunnen verschillen tussen andere kitmerken, zijn ze allemaal compatibel met ons protocol.
    1. PCR-verrijking: Bereid de PCR-verrijkingsmix (50 μL) in een PCR-buisje door de volgende componenten in de gespecificeerde volgorde te mengen: 10 μL DNA-monster (uit stap 2.6), 14 μL nucleasevrij water, 10 μL 5x TAB, 5 μL PPM, 1 μL TAE, 5 μL P5 primer en 5 μL P7 primer. Piket voorzichtig om te mengen.
    2. Breng de buis over naar een PCR-instrument en voer het volgende programma uit: (72 °C gedurende 3 min) x 1 cyclus, (98 °C gedurende 30 s) x 1 cyclus, (98 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 30 s, 72 °C gedurende 3 min) x 15 cycli, en (72 °C gedurende 5 min) x 1 cyclus, en vasthouden op 4 °C.
    3. Zuivering: Breng de DNA Clean-kralen voor gebruik 30 minuten op kamertemperatuur en voer vervolgens een magnetische kralenzuivering in twee stappen uit.
      1. Eerste ronde: Voeg 30 μL DNA Clean Beads toe aan de PCR-producten (uit stap 2.7.2), pipetteer voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats het PCR-buisje op een magnetische scheider en wacht tot de oplossing helder wordt (~5 min). Breng het bovenstaande voorzichtig over in een nieuw buisje en gooi de DNA Clean-kralen weg.
      2. Tweede ronde: Voeg 7,5 μL DNA Clean Beads toe aan het verzamelde supernatans (uit stap 2.7.3.1), pipetteer voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op een magnetische scheider en wacht tot de oplossing helder wordt (~5 min). Gooi het bovenstaande voorzichtig weg.
    4. Houd de buis op de magnetische scheider en spoel de DNA Clean beads 2 x 30 s af met 200 μL vers bereide 80% ethanol bij kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande na elke spoeling voorzichtig weg. Terwijl de buis nog op de magnetische scheider zit, opent u het deksel van de buis en laat u de kralen 10 minuten aan de lucht drogen. Voeg ten slotte 22 μL nucleasevrij water toe om het DNA te elueren.
      OPMERKING: DNA-monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C voor langdurige bewaring.
  8. Sequence de bibliotheken met behulp van een standaard sequencer van de volgende generatie.
    OPMERKING: We raden aan om ten minste 50 miljoen pair-end reads te verkrijgen.

3. Bereiding van oplossingen en cholangiocyten voor ChIP-seq met lage input

  1. Bereid ten minste 1 dag voorafgaand aan het ChIP-seq-experiment met weinig input de ChIP Lysis Buffer, ChIP MNase Buffer, ChIP Stop Buffer, ChIP 2x RIPA Buffer, ChIP RIPA Buffer en ChIP LiCl Buffer voor met behulp van de reagentia vermeld in Tabel 2, Tabel 3, Tabel 4 en Tabel 5.
    OPMERKING: Bovenstaande oplossingen kunnen minimaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
  2. Voor vers geïsoleerde primaire cholangiocyten14, telt u de cellen met behulp van een hemocytometer onmiddellijk na isolatie en gaat u verder met het ChIP-seq-experiment met lage input.
    OPMERKING: Hoe eerder hoe beter om de impact op de levensvatbaarheid van de cellen te minimaliseren. Als het echter op ijs wordt bewaard, is het over het algemeen geen probleem om binnen 2 uur verder te gaan.

4. Dag 1 van ChIP-seq met lage input: cellyse, MNase-vertering en incubatie van antilichamen

OPMERKING: Voor het ChIP-seq-experiment met weinig input duurt de hele procedure ongeveer 3 dagen.

  1. Verdeel cholangiocyten in aliquots van 100.000 cellen per buisje en bewaar de monsters en oplossingen op ijs.
    OPMERKING: Als u een ChIP-seq-experiment met weinig input uitvoert voor meerdere histonmodificaties, is het acceptabel om het volume proportioneel op te schalen voordat het histonmodificatie-antilichaam wordt toegevoegd. De reagensvolumes in de volgende stappen zijn gebaseerd op één buisje met 1 × 105 cellen.
  2. Centrifugeer 5 minuten bij 2.000 × g bij 4 °C.
  3. Gooi het supernatant weg, voeg 19 μL ChIP Lysis Buffer met Proteaseremmer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Vermijd het genereren van bubbels.
  4. Voeg 19 μL ChIP MNase Buffer toe en pipetteer voorzichtig om te mengen.
  5. Voeg 2 μL MNase (0,01 E/μL) toe en pipetteer voorzichtig om te mengen. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: De incubatietijd is kritiek. De uiteindelijke concentratie van MNase is 0,0005 U/μL. De optimale concentratie MNase kan worden bepaald op basis van het celtype en het aantal.
  6. Plaats het monster onmiddellijk op ijs, voeg 5 μL ChIP STOP Buffer toe om de spijsvertering te beëindigen en pipetteer voorzichtig om te mengen.
  7. Voeg 45 μL ChIP 2x RIPA Buffer met Proteaseremmer toe, pipetteer voorzichtig om te mengen en incubeer verder op ijs gedurende 10 min.
  8. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng het bovenstaande langzaam over in een nieuw buisje.
    OPMERKING: Resterende proteïne G-kralen van het cholangiocyt-isolatieproces14 kunnen in deze stap worden verwijderd.
  9. Voeg 40 μL ChIP RIPA Buffer toe.
  10. Voeg voor immunoprecipitatiemonsters (IP) 1 μg antilichaam per monster toe en incubeer de suspensie op een rotator (20 rpm) bij 4 °C gedurende een nacht.
  11. Voeg voor invoermonsters geen antilichamen toe en incubeer de suspensie 's nachts op een rotator (20 tpm) bij 4 °C.

5. Dag 2 van Low-input ChIP-seq: immunoprecipitatie, wassen en elutie

OPMERKING: Volg voor IP-voorbeelden de stappen 5.1-5.7. Volg de stappen 5.8-5.12 voor invoervoorbeelden.

  1. Was Protein G kralen voor met 1 ml ijskoude ChIP RIPA Buffer.
  2. Voeg 400 μg Proteïne G-korrels toe aan de monsters en incubeer met rotatie (20 rpm) bij 4 °C gedurende 2 uur.
  3. Was de kralen 5 x 5 min met 150 μL ijskoude ChIP RIPA Buffer gedurende 5 min op 4 °C op een rotator (20 rpm). Verwijder het bovenstaande met behulp van een magnetische scheider.
  4. Was de parels met 150 μL ijskoude ChIP LiCl Buffer gedurende 5 min op 4 °C op een rotator (20 rpm). Verwijder het bovenstaande met behulp van een magnetische scheider.
  5. Voeg 30 μL ChIP Elution Buffer toe (29 μL nucleasevrij water en 1 μL Proteïnase K) om de korrels te resustribueren en schud bij 900 rpm bij 55 °C gedurende 90 min. Veeg regelmatig voorzichtig met de tube om de kralen in suspensie te houden.
  6. Verzamel het bovenstaande met behulp van een magnetische scheider en breng het langzaam over in een nieuwe buis. Incubeer gedurende 40 minuten bij 72 °C om proteïnase K te inactiveren.
  7. Meet de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer.
    OPMERKING: DNA-monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C voor langdurige bewaring.
  8. Voeg voor invoermonsters 1 μL proteïnase K toe en schud gedurende 900 minuten bij 900 tpm bij 55 °C.
  9. Zuiver DNA met behulp van fenol-chloroform-extractie. Voeg 130 μL DNA-extractiereagens toe en draai krachtig totdat de oplossing roze wordt. Centrifugeer op 20.000 × g gedurende 5 min.
  10. Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis, voeg 130 μL ijskoude isopropanol toe en voeg vervolgens 1 μL glycogeen en 6,5 μL 3M NaAc toe. Centrifugeer bij 20.000 × g gedurende 15 min.
  11. Gooi het supernatant weg, was eenmaal met 1 ml 70% ethanol en centrifugeer gedurende 15 minuten op 20.000 × g . Droog de pellet en resuspendeer deze in 30 μL nucleasevrij water.
  12. Meet de DNA-concentratie met behulp van een fluorometer.
    OPMERKING: DNA-monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C voor langdurige bewaring.

6. Dag 3 van low-input ChIP-seq: Bibliotheekconstructie en -sequencing

  1. Voer de opbouw van de bibliotheek uit met behulp van een ChIP DNA Library Prep Kit volgens de instructies van de fabrikant.
    OPMERKING: De stappen omvatten Eindvoorbereiding, Adapterligatie en Bibliotheekversterking. Pipet: 5 ng ChIP-samples (invoer- en IP-samples) voor de opbouw van bibliotheken. Bewaar alle monsters en oplossingen op ijs, tenzij anders aangegeven. Hoewel de procedures kunnen verschillen tussen andere kitmerken, zijn ze allemaal compatibel met ons protocol.
  2. Eindvoorbereiding: Bereid de reactiebuffer van de eindvoorbereiding (65 μl) voor in een PCR-buisje door 5 ng DNA-monster (uit stap 5.6 of stap 5.11), 15 μl End Prep Mix 4, 6,5 μl Tris EDTA en nucleasevrij water te mengen tot een eindvolume van 65 μl. Piket voorzichtig om te mengen. Breng de buis over naar een PCR-instrument en voer het volgende programma uit: 20 °C gedurende 15 min, 65 °C gedurende 15 minuten en vasthouden op 4 °C (heet deksel: 105 °C).
  3. Adapter ligatie: Verdun DNA-adapter S in een verhouding van 1:100. Bereid de Adapter Ligation Reaction Buffer (100 μL) voor in een PCR-buisje door 65 μL End Preparation Products (uit stap 6.2), 25 μL Rapid Ligation buffer 2, 5 μL Rapid DNA-ligase en 5 μL verdunde DNA Adapter S te mengen. Piket voorzichtig om te mengen. Breng de buis over naar een PCR-instrument en voer het volgende programma uit: 20 °C gedurende 15 min, gevolgd door een stop bij 4 °C (heet deksel: 105 °C).
  4. Zuivering:
    1. Breng de DNA Clean kralen voor gebruik 30 minuten op kamertemperatuur. Voeg 60 μL DNA Clean-kralen toe aan de Adapter Ligation-producten (vanaf stap 6.3). Piket voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Plaats het PCR-buisje op een magnetische scheider en wacht tot de oplossing helder wordt (~5 min). Gooi het bovenstaande voorzichtig weg.
    3. Houd de buis op de magnetische scheider. Spoel de DNA Clean beads 2 x 30 s af met 200 μL vers bereide 80% ethanol op kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande na elke spoeling voorzichtig weg.
    4. Terwijl de buis nog op de magnetische scheider zit, opent u het deksel van de buis en laat u de kralen 5 minuten aan de lucht drogen. Voeg ten slotte 22,5 μL 10 mM Tris-HCL (PH 8,0) toe om het DNA te elueren.
  5. Bibliotheekamplificatie: Bereid de bibliotheekamplificatiereactiebuffer (50 μl) voor in een PCR-buisje door 20 μl zuiveringsproducten (uit stap 6.4), 2,5 μl i5 PCR primer, 2,5 μl i7 PCR primer en 25 μl amplificatiemix te mengen. Piket voorzichtig om te mengen. Breng de buis over naar een PCR-instrument en voer het volgende programma uit: (95 °C gedurende 3 min) x 1 cyclus, (98 °C gedurende 20 s, 60 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 30 s) x 18 cycli, (72 °C gedurende 5 min) x 1 cyclus, en houd op 4 °C.
  6. Zuivering: Breng de DNA Clean-kralen voor gebruik 30 minuten op kamertemperatuur en voer vervolgens een magnetische kralenzuivering in twee stappen uit.
    1. Eerste ronde: Voeg 30 μL DNA Clean beads toe aan de Library Amplification producten (uit stap 6.5). Piket voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats het PCR-buisje op een magnetische scheider en wacht tot de oplossing helder wordt (~5 min). Breng het bovenstaande voorzichtig over in een nieuw buisje en gooi de DNA Clean-kralen weg.
    2. Tweede ronde: Voeg 7,5 μL DNA Clean Beads toe aan de verzamelde supernatant. Piket voorzichtig om te mengen en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op een magnetische scheider en wacht tot de oplossing helder wordt (~5 min). Gooi het bovenstaande voorzichtig weg. Houd de buis op de magnetische scheider. Spoel de DNA Clean beads 2 x 30 s af met 200 μL vers bereide 80% ethanol op kamertemperatuur. Gooi het bovenstaande na elke spoeling voorzichtig weg. Terwijl de buis nog op de magnetische scheider zit, opent u het deksel van de buis en laat u de kralen 10 minuten aan de lucht drogen. Voeg ten slotte 22,5 μL 10 mM Tris-HCl (PH 8,0) toe om het DNA te elueren.
      OPMERKING: DNA-monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C voor langdurige bewaring.
  7. Sequentie van de bibliotheken in een standaard sequencer van de volgende generatie.
    OPMERKING: We raden aan om ten minste 10-20 miljoen paar-end reads te verkrijgen.

7. Data-analyse van ATAC-seq en Low-input ChIP-seq

  1. Voorbereiden van de virtuele analyseomgeving (miniconda)
    1. Download Miniconda3 van de website met behulp van de volgende opdrachten en volg de installatie-instructies van Miniconda.
      wat https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. Creëer een virtruele omgeving voor de analysepijplijn van zowel ATAC-seq als ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda activeren NGSpipeline
      Conda installeren Bioconda::Fastqc Bioconda::Multiqc Bioconda::Trim-Galore BioConda::Bowtie2 BioConda::Samtools BioConda::Macs2 BioConda::d eeptools Bioconda::p iCard BioConda::IGV
    3. Download het referentiegenoomsequentiebestand en maak een uitlijningsindex voor bowtie2-uitlijning.
      wat https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      gunzip GRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. Voer kwaliteitscontrole uit van ATAC-seq-lezingen en ChIP-seq-lezingen met FastQC en vat het kwaliteitscontrolerapport samen met behulp van MultiQC om de GC-bias van de sequencingresultaten en voldoende bibliotheekcomplexiteit voor downstream-analyse te garanderen. Gooi de sequentiebibliotheek met aanzienlijk verschillende kwaliteitscontroleresultaten weg.
    fastqc -o ......
    MultiQC
  3. Trim sequencing adapter met behulp van trim galore.
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j -o
  4. Map trimmed leest naar mm10 referentiegenoomassemblage met Bowtie2 met behulp van standaardparameters, en geeft toevoegingsparameters (--zeer-gevoelig -X 2000) door aan bowtie2 voor ATAC-seq vanwege de brede lengteverdeling van het ATAC-seq-fragment.
    1. Voor ATAC-seq:
      bowtie2 -p --zeer-gevoelig -X 2000 -x -1 -2 | samtools bekijken -S -O BAM -@ -o
    2. Voor ChIP-seq:
      bowtie2 -p -x -1 -2 | samtools VIEW -S -O BAM -@ -o
  5. Verwijder lezingen met een lage uitlijningsscore (q30) en lezingen die zijn uitgelijnd met het genoom van de mitochondriën en het niet-standaard chromosoom.
    samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'willekeurig' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
  6. Gebruik de opdracht Picard MarkDuplicates om PCR-duplicaten te verwijderen.
    picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=true
  7. Oproeppiek met behulp van MACS2 callpeak-opdracht met parameter -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
    macs2 callpeak -f BAMPE -t -g mm -n -B -q 0.01
  8. Genereer BigWig-bestanden met behulp van de opdracht Deeptools BamCoverage.
    Samtools Index -@ 4
    bamCoverage -b     -o -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
  9. Gebruik de IGV-genoombrowser om het narrowPeak-bestand van macs2 en BigWig-bestanden van Deeptools BamCoverage te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om het chromatinelandschap van primaire cholangiocyten te genereren, hebben we de low-input ChIP-seq- en ATAC-seq-protocollen geoptimaliseerd voor lage aantallen (~100.000) primaire cholangiocyten. De resultaten van agarosegelelektroforese voor primaire cholangiocyten gaven aan dat voor 1 × 105 primaire cholangiocyten, 0,02 U MNase bij 37 °C gedurende 5 minuten resulteerde in de productie van mononucleosomen, wat werd geïdentificeerd als de optimale concentratie (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om de chromatinetoestandsdynamiek die aan de basis ligt van de toestandsovergang van cystische cholangiocyten systematisch en uitgebreid in kaart te brengen, hebben we met succes low-input ChIP-seq en ATAC-seq geoptimaliseerd voor een beperkt aantal primaire cholangiocyten. Hoewel deze studie zich richtte op primaire cholangiocyten, zijn we ervan overtuigd dat het protocol ook kan worden toegepast op andere primaire cellen met een hoge levensvatbaarheid en beperkte beschikbaarheid. Evenz...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (82402166 tot R.J.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7.5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8.0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
Agarose gelBiosharpBS081
ATAC DNA Library Prep KitVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M stock
ChIP DNA Library Prep KitVazymeND607
DNA Clean beadsVazymeN411
DNA Extraction ReagentSolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) stock
FluorometerInvitrogenQ33226
GlycogenThermo ScientificR0561
HemocytometerQIUJINGXB.K.25.
Igepal CA-630SigmaI889610% stock
Magnetic separatorPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M stock
MNaseSigmaN37550.01 U/µL stock
NaClSangon BiotechA6104765 M stock
NP40SolarbioN8030
Nuclease-free waterLife TechnologiesAM9937
PCR instrumentApplied Biosystems4484073
PCR Purification KitQIAGEN28106
Protease InhibitorRoche04693132001
Protein G beadsInvitrogen10004D
Proteinase KTransGenGE201-01
RotatorKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS801010%  stock
Sodium deoxycholateSigmaS1827
Thermomixer comfortEppendorf5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools270799753.4.3https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
trim-galore0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Low input ChIP seqATAC seq ProtocolChromatin AccessibilityHistone ModificationsPrimary CholangiocytesEpigenetic ProfilingMicrococcal NucleaseTn5 Transposase
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen