Hier beschrijven we een protocol voor het bouwen, programmeren en uitvoeren van het Circadian Rave System, een op Arduino gebaseerde light-emitting diode (LED) controller voor het beheren van meerdere complexe lichtregimes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Hier beschrijven we een protocol voor het bouwen, programmeren en uitvoeren van het Circadian Rave System, een op Arduino gebaseerde light-emitting diode (LED) controller voor het beheren van meerdere complexe lichtregimes.
Nauwkeurige regeling van de verlichting heeft brede toepassingen in alle biologische wetenschappen, maar niet meer dan in circadiaans onderzoek. Het leven op aarde heeft circadiane klokken ontwikkeld die endogene regulatoren zijn van fysiologie en gedrag die meevoeren naar de 24-uurs zonnedag. Om de klok te bestuderen, vertrouwen onderzoekers op experimentele manipulatie van licht of temperatuur om circadiane ritmes mee te voeren. De meeste laboratoria gebruiken momenteel in de handel verkrijgbare of in eigen huis gebouwde verlichtingsapparatuur om de natuurlijke dag- en nachtcycli na te bootsen of te verstoren. Deze systemen bieden beperkte programmeerbaarheid en precisie, missen standaardisatie en, in sommige gevallen, betaalbaarheid. Om deze problemen aan te pakken, hebben we het Circadian Rave System ontwikkeld, een op maat gemaakt software- en hardwarepakket dat de nauwkeurige bediening van meerdere onafhankelijke lichtbakken mogelijk maakt. We hebben de software open source gemaakt, samen met gedetailleerde handleidingen voor het bouwen van hardware, met als doel dat toekomstig onderzoek kan worden gestandaardiseerd door het gebruik van dit systeem. Om de functionaliteit van dit systeem en het nut ervan in circadiane experimenten aan te tonen, hebben we de levensduur en activiteit van Drosophila in verschillende lichtparadigma's gemeten om circadiane synchronisatie en verstoring door lichtmanipulatie aan te tonen. Tot slot hebben we een gestandaardiseerd, schaalbaar en betaalbaar verlichtingssysteem ontwikkeld dat in eigen huis kan worden gebouwd door elke onderzoeker met minimale voorkennis op het gebied van elektronica of programmeren.
De nauwkeurige regeling van het licht is van cruciaal belang bij bijna alle experimenten met dieren. Voor de laboratoriumopfok van dergelijke dieren kunnen in de handel verkrijgbare broedmachines worden aangeschaft met een beperkte capaciteit voor het programmeren van complexe lichte en donkere cyclusregimes. Het vermogen om complexe verlichtingsregimes te programmeren is noodzakelijk voor veel vakgebieden, maar is van cruciaal belang in circadiaans onderzoek. De circadiane klok, meegevoerd naar de zonnedag, is een endogene oscillator die veranderingen in fysiologie en gedrag van insecten naar zoogdieren regelt1. Als zodanig is circadiaans onderzoek begonnen door te dringen in vele gebieden van biologisch onderzoek, zoals ontwikkeling2, immuniteit3 en pathologie van menselijke ziekten4. Studies van de circadiane klok zijn sterk afhankelijk van het gebruik van licht of temperatuur om de klok te manipuleren of zelfs te verstoren door nauwkeurige controle van timing, intensiteit en fietsen 5,6. Momenteel is er behoefte aan een betaalbaar, schaalbaar en gestandaardiseerd systeem voor het beheersen van deze variabelen voor gebruik in circadiane experimenten.
Naast het manipuleren van de endogene circadiane klok, zijn er verschillende optogenetische hulpmiddelen ontwikkeld die specifieke golflengten van licht gebruiken om de expressie van transgenen in vivo en in vitro te regelen. De immense genetische traceerbaarheid van Drosophila melanogaster heeft bijvoorbeeld geresulteerd in veel optogenetische hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor onderzoekers. De lichtgevoelige shineGal4-variant van de Gal4-transcriptiefactor kan bijvoorbeeld worden geactiveerd bij blootstelling aan blauw licht en is een routinematig gebruikt hulpmiddel door veel laboratoria 7,8,9. Onderzoekers hebben de neiging om lichtveranderingen te bereiken door lampen handmatig aan te zetten of via laserinductie, maar beide methoden kunnen logistieke en technische beperkingen met zich meebrengen tijdens het experimentele ontwerp en de implementatie. De mogelijkheid om de start, stop, specifieke golflengte, cyclus en intensiteit (dosering) van licht te programmeren, zou van extreem voordeel zijn.
Om onderzoekers volledige controle te geven over de lichtomstandigheden, hebben we het Circadian Rave System (CRS) ontworpen. Dit is een alternatief, betaalbaar en doe-het-zelf (doe-het-zelf) systeem dat door onderzoekers kan worden gebouwd en aangepast, waardoor verlichtingsregimes volledig kunnen worden aangepast. Het systeem vertrouwt op een Arduino-microcontroller die tot zes onafhankelijke LED-kanalen kan aansturen, waardoor het systeem betaalbaar en schaalbaar is. Microcontrollers zoals Arduino's zijn met succes gebruikt om veel doe-het-zelf laboratoriumapparatuur te maken vanwege hun gebruiksgemak 10,11,12. Dit systeem kan worden gebruikt in bestaande broedstoven en is met succes getest bij typische experimentele temperaturen en biedt een breed scala aan functionaliteiten (4-37 °C). Gebruikers kunnen het CRS programmeren via de op maat gemaakte, open-source software die is ontwikkeld voor meerdere besturingssystemen. De software heeft een gebruiksvriendelijke gebruikersinterface, waardoor complexe lichtregimes kunnen worden geprogrammeerd om lichtpatronen op zonne-energie beter na te bootsen. Deze aangepaste lichtregimes kunnen worden gemaakt, opgeslagen en later op de microcontroller worden geladen, zodat een set eerder gegenereerde lichtregimes kan worden gebruikt, wat tijd bespaart tijdens de experimentele opstelling. Zodra het apparaat is geprogrammeerd, kan het worden losgekoppeld van de computer, wat schaalbaarheid mogelijk maakt in vergelijking met conventionele systemen die speciale computers nodig hebben om verlichtingsregimes uit te voeren. Om de betrouwbaarheid van het CRS te testen, hebben we een levensduur- en activiteitsanalyse uitgevoerd op Drosophila die is blootgesteld aan verschillende CRS-gegenereerde lichtregimes. Het CRS bleek maandenlang op betrouwbare wijze meerdere verlichtingsregimes continu uit te voeren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
1. Opbouw van het CRS
OPMERKING: Het CRS is ontworpen om in eigen huis te worden gebouwd door onderzoekers, en als zodanig zijn alle componenten in de handel verkrijgbaar bij meerdere leveranciers (Materiaaltabel). De uitzonderingen zijn de printplaten (PCB's) die commercieel moeten worden geproduceerd door PCB-printspecialisten of door contact op te nemen met de auteurs. Voor commerciële productie bevinden de Gerber-bestanden zich in de GitHub-repository (@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/microcontroller_PCB). Technische afdelingen van universiteiten hebben doorgaans PCB-printfaciliteiten. Hieronder vindt u gedetailleerde instructies voor het bouwen, controleren en programmeren van een enkele CRS-eenheid.
2. Een experiment uitvoeren
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
CRS-overzicht
Het CRS is een combinatie van hardware en software waarmee gebruikers complexe verlichtingsregimes kunnen programmeren voor maximaal zes onafhankelijke LED-strips per apparaat (Afbeelding 1A). De software kan eenvoudig worden gedownload van de GitHub-repository (@Trincatalyst/CRS/Software) en op de hoofdpagina van de software zijn verdere gedetailleerde gebruiksaanwijzingen te vinden (Afbeelding 1B
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Om te onderzoeken hoe licht de fysiologie en het gedrag beïnvloedt, zijn complexe lichtschema's nodig, meestal met meerdere omstandigheden die parallel lopen. Nauwkeurige controle van de timing en intensiteit van de blootstelling aan licht is ook essentieel voor betrouwbare en reproduceerbare gegevens in deze circadiane experimenten. Lichtcycli kunnen worden bereikt met in de handel verkrijgbare broedstoven of LED's die zijn gekoppeld aan mechanische timerstekkers. Deze systemen bieden e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te onthullen
We willen graag Dr. Edgar Buhl en Prof. James Hodge bedanken voor het gebruik van het DAM-systeem en de installatiebegeleiding. We willen ook prof. Paul Martin bedanken voor zijn steun en begeleiding bij de ontwikkeling van de CRS. Dit werk werd ondersteund door een BBSRC-beurs BB/T001984/1 toegekend aan prof. Paul Martin.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.1 µF Keramische Condensator | Farnell | 2507749 | Aantal = 2 |
| 100 kΩ axiale THT weerstander 250 mW | Farnell | 3951804 | Aantal = 6 |
| 100 Ω axiale THT weerstander 250 mW | Farnell | 3496799 | Aantal = 6 |
| 1 µF Keramische Condensator | Farnell | 2819603 | Aantal = 2 |
| 2,54 mm pitch Door Gat Header Horizontaal Montage - FTDI | Farnell | 3756363 | Aantal = 6 |
| Arduino Headers 10-weg | Farnell | 1593417 | Aantal = 1 |
| Arduino Headers 3-weg | Farnell | 1593412 | Aantal = 1 |
| Arduino Headers 8-weg | Farnell | 1593416 | Aantal = 1 |
| Arduino Uno R3 | Arduino | A000066 | Aantal = 1 |
| Barrel Jack | Farnell | 224959 | Aantal = 1 |
| Circadian Rave Systeem PCB | Martin Lab | Martin Lab | 1 (120 strips of 1 LED component met een LED PCB) |
| Diode | Farnell | 4245041 | Aantal = 1 |
| eFuse Circuit Bescherming | Farnell | 4178928 | Aantal = 1 |
| FTDI Kabel | Farnell | 2419945 | Aantal = 1 |
| LEDs | RS | 855-5933 | 120 strips of 1 LED component met een LED PCB |
| VOEDING 15W | Farnell | 2815857 | Aantal = 1 |
| Schroefterminals | Farnell | 2314973 | Aantal = 6 |
| ST Microelectronics N-kanaals MOSFET STP30NF10 | Farnell | 9946403 | Aantal = 6 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.