Ultrasone lokalisatiemicroscopie voor het in kaart brengen met superresolutie van de microvasculatuur van de hersenen van knaagdieren

Samenvatting

Ultrasone lokalisatiemicroscopie (ULM) is een recent ontwikkelde techniek die een ongekend resolutieniveau mogelijk maakt bij het in vivo afbeelden van het microvaatstelsel. In dit werk beschrijven we in detail hoe superopgeloste beelden van het microvasculatuur van de hersenen bij knaagdieren kunnen worden verkregen met behulp van een gestandaardiseerd functioneel echografieplatform dat is ontworpen voor preklinisch onderzoek.

Samenvatting

Ultrasone lokalisatiemicroscopie (ULM) is een beeldvormingstechniek met superresolutie die in vivo visualisatie van de microvasculaire architectuur van de hersenen mogelijk maakt en de diffractielimiet van conventionele echografie overtreft. Door intraveneus geïnjecteerde microbellen te detecteren en te volgen terwijl ze door hersenvaten circuleren, produceert ULM kaarten met hoge resolutie van vasculaire dichtheid, stroomsnelheid en terugverstrooide signaalamplitude op ruimtelijke schalen tot 5-10 μm. Dit protocol biedt een complete workflow voor het uitvoeren van ULM-beeldvorming bij knaagdieren, inclusief voorbereiding van dieren, positionering van sondes, beeldacquisitie, injectie van microbellen en gegevensverwerking, met behulp van een speciaal functioneel echografieplatform. Er worden twee bereidingsmethoden beschreven, aangepast voor muizen (transcraniaal) en ratten (met craniale vensters), gevolgd door gedetailleerde instructies voor het uitlijnen van de sonde en anatomische targeting met behulp van een geïntegreerde hersenatlas. Tijdens de acquisitie worden ultrasnelle ultrasone sequenties gesynchroniseerd met bolusinjecties van microbellen om dynamische stroomgegevens vast te leggen. Daaropvolgende reconstructiestappen omvatten het filteren van rommel, beeldinterpolatie, detectie van microbellen, subpixellokalisatie en trajecttracking. Resultaten omvatten dichtheidskaarten die de bezetting van schepen weerspiegelen, snelheidskaarten die stromingspatronen en directionaliteit onthullen, en amplitudekaarten die extra contrast bieden voor structurele interpretatie. Representatieve resultaten illustreren succesvolle acquisitie over volledige coronale vlakken en benadrukken veelvoorkomende valkuilen zoals slechte injectiekwaliteit, bewegingsartefacten en door de schedel geïnduceerde aberratie. Het protocol is compatibel met zowel cross-sectionele als longitudinale studies en is met name geschikt voor het onderzoeken van cerebrovasculaire veranderingen in modellen van veroudering, beroerte, aneurysma en neurodegeneratieve ziekten. Door dieptepenetratie, hoge spatiotemporele resolutie en labelvrije vasculaire beeldvorming te combineren, biedt ULM een krachtig hulpmiddel voor niet-invasieve microcirculatieanalyse van de hersenen in preklinische modellen.

Inleiding

Hoewel de hersenen slechts 2% van de massa van het lichaam uitmaken, verbruiken ze ongeveer 20% van hun zuurstof en glucose om de neuronale activiteit te ondersteunen¹. Aan deze hoge metabolische behoefte wordt voldaan door een ingewikkeld vasculair netwerk, van grote slagaders en aders tot microvaten zoals arteriolen, venulen en haarvaten, gereguleerd door neurovasculaire koppeling². De verstoring van dit fijn afgestemde proces is betrokken bij een breed spectrum van neurologische aandoeningen. Neurovasculaire ontkoppeling is bijvoorbeeld een vroeg pathologisch kenmerk bij ziekten zoals de ziekte van Alzheimer, Parkinson, Huntington en Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS), vaak voorafgaand aan de klassieke kenmerken van neurodegeneratie zoals amyloïde-bèta- en tau-pathologie 3,4,5,6. Het in vivo in beeld brengen van de complexe aard van de hersenen is daarom van primair belang geweest om tegemoet te komen aan de groeiende behoefte om fysiologische processen te begrijpen. Technologische vooruitgang heeft unieke mogelijkheden opgeleverd om de hersenfunctie en -activiteit te onderzoeken, zowel direct als indirect, met toenemende precisie, resolutie en toegankelijkheid.

Doppler-echografie is naar voren gekomen als een krachtig hulpmiddel voor het functioneel meten van hersenactiviteit met behulp van de bloedstroom⁷. In het bijzonder zendt power Doppler-beeldvorming, ontworpen om de beweging van rode bloedcellen (RBC's) te detecteren, herhaalde ultrasone pulsen uit naar bloedvaten en registreert de amplitude van ultrasone echo's die worden terugverstrooid door bewegende RBC's⁸. De komst van ultrasnelle echografie, met name functionele echografie (fUS), markeerde een cruciaal punt in het overwinnen van eerdere beperkingen. Conventionele echografie scant inderdaad weefsel lijn voor regel - een sequentiële benadering die de toepassing ervan beperkt tot de belangrijkste hersenslagaders, aangezien de langzame bloedstromen die typisch zijn voor de microvasculatuur van de hersenen niet kunnen worden gedetecteerd⁹. De meer recente fUS-techniek maakt gebruik van meerdere vlakgolftransmissies om duizenden frames per seconde te verkrijgen, waardoor zowel de temporele resolutie als de signaal-ruisverhouding (SNR) drastisch worden verbeterd. Cruciaal is dat fUS de detectie van hemodynamische veranderingen in zeer kleine bloedvaten met snelheden zo laag als 1 mm/s mogelijk maakt, ter ondersteuning van real-time functionele beeldvorming van hersenactiviteit tot op het niveau van arteriolen⁸.

Hoewel ultrasnelle Doppler-methoden de microvasculaire beeldvorming aanzienlijk hebben verbeterd, worden ze nog steeds beperkt door de diffractiebeperkte resolutie van echografie¹⁰. In combinatie met fUS doorbreekt ultrasone lokalisatiemicroscopie (ULM) deze belemmering, waardoor de visualisatie van microvasculaire structuren op capillair niveau mogelijk wordt door gebruik te maken van contrastmiddelen en zeer nauwkeurige lokalisatie-algoritmen¹¹. Dit levert ongekende inzichten op in de vasculaire morfologie en functie. Meer specifiek worden bij ULM contrastmiddelen gemaakt van gestabiliseerde, met gas gevulde microbellen, met een diameter van ongeveer 1-3 μm, in de bloedbaan geïnjecteerd. Ze fungeren als sterke akoestische verstrooiers die kunnen worden gedetecteerd als individuele puntbronnen. Aangezien microbellen aanzienlijk kleiner zijn dan de ultrasone golflengte, kunnen ze ruimtelijk en tijdelijk worden geïsoleerd, waarbij ze verschijnen als de puntspreidingsfunctie (PSF) van het systeem. Geïnspireerd door optische superresolutietechnieken zoals STORM en PALM, wordt subpixellokalisatie van deze microbellen bereikt met behulp van deconvolutiemethoden die hun posities met hoge precisie in kaart brengen 10,12,13,14. Hierdoor kunnen vasculaire structuren worden opgelost met een ruimtelijke resolutie van 5-10 μm, veel meer dan de door diffractie opgelegde limiet van conventionele ultrasnelle ultrasone Doppler-beeldvorming.

ULM is een krachtig en effectief hulpmiddel voor het in kaart brengen van bloedvaten tot op capillaire schaal en overwint de beperkingen van veel optische methoden die beperkt zijn tot oppervlakkige lagen. Het vermogen om microvasculaire beeldvorming uit te voeren bij levende dieren, waardoor longitudinale en farmacologische studies mogelijk zijn, is een ander belangrijk voordeel van ULM ten opzichte van andere technieken die hersenfixatie en kleuring vereisen. De geëxtraheerde informatie gaat verder dan statische vasculaire kaarten en biedt kwantitatieve schattingen van de bloedstroom tot op capillair niveau, waardoor veelbelovende wegen worden geopend voor zowel preklinische als klinische toepassingen. Om de reproduceerbaarheid te vergemakkelijken, beschrijven we een volledige workflow voor ULM-gebaseerde beeldvorming van de hersenen bij knaagdieren, geïmplementeerd met behulp van een gestandaardiseerd functioneel echografieplatform dat is ontworpen voor preklinisch onderzoek.

Protocol

Alle procedures die in deze studie worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijn van de Raad van de Europese Gemeenschap van 22 september 2010 (010/63/UE) en goedgekeurd door de lokale ethische commissie (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', project #2020-16). Er werden experimenten uitgevoerd op volwassen mannelijke C57BL/6 Rj-muizen (2 maanden oud, 20-30 g) en Sprague-Dawley Rj:Han-ratten (200-300 g) die commercieel werden ingekocht. De dieren werden gehuisvest in groepen van vier per kooi onder een licht/donker-cyclus van 12 uur, met een constante temperatuur van 22 °C en met voedsel en water ad libitum. Voorafgaand aan de start van de experimenten ondergingen alle dieren een acclimatisatieperiode van minimaal een week aan de huisvestingsomstandigheden. De gebruikte reagentia en de gebruikte apparatuur staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Voorbereiding van dieren

1. Anesthesie en voorbereiding van dieren bij muizen
   1. Plaats de muis in de isofluraaninductiekamer en dien 2% isofluraan toe met lucht (0,075 l/min) en zuurstof (0,175 l/min, of medische lucht).
   2. Breng het dier na 5 minuten anesthesie-inductie over naar het stereotactische frame, dat over een verwarmingskussen wordt geplaatst dat op 37 °C is ingesteld om de lichaamstemperatuur op peil te houden, en zorg voor een continue toediening van isofluraan via een masker met dezelfde concentratie en stroomsnelheid.
   3. Bevestig voldoende anesthesiediepte door te controleren op de afwezigheid van reflexen als reactie op een teen- of staartknijp met behulp van stevige maar niet-schadelijke druk. Als er een reflex aanwezig is, verhoog dan de isofluraanconcentratie iets. Beoordeel opnieuw voordat u verder gaat.
   4. Breng oogzalf aan om staarvorming te voorkomen.
   5. Scheer het hoofd van de muis met een trimmer. Breng een ontharingscrème aan, laat deze 1-1,5 minuut intrekken, spoel vervolgens af met warm water en droog af met gaas. Herhaal indien nodig totdat al het haar is verwijderd. Laat de ontharingscrème niet voor langere tijd staan, omdat dit chemische schade aan de huid kan veroorzaken.
   6. Breng gecentrifugeerde ultrasone gel (luchtbelvrij, ontgast) aan op de kop om akoestische koppeling te garanderen.
2. Anesthesie en voorbereiding van dieren bij ratten
   1. Dien na het wegen van de rat een intraperitoneale injectie toe van een mengsel van ketamine (75 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) met behulp van een spuit van 1 ml. Scheer de vacht bovenop het hoofd en reinig de huid met een jodiumoplossing.
      OPMERKING: Ketamine is in veel landen een sterk gereguleerde stof en vereist mogelijk speciale toestemming voor aanschaf en gebruik. Alternatieve anesthesieregimes kunnen worden gebruikt om anesthesie op chirurgisch niveau te bereiken.
   2. Plaats het dier op een stereotactisch apparaat dat op een verwarmingskussen wordt geplaatst dat is ingesteld op 37 °C om de lichaamstemperatuur op peil te houden. Breng een ruime hoeveelheid oogzalf aan op de ogen om uitdroging en staarvorming te voorkomen.
   3. Injecteer subcutaan meloxicam (2 mg/kg) met behulp van een spuit van 1 ml voor intraoperatieve analgesie.
   4. Bevestig voldoende anesthesiediepte door te controleren op de afwezigheid van reflexen als reactie op een teenbeknelling of staartbeknelling met behulp van stevige maar niet-schadelijke druk. Als er een reflex aanwezig is, dien dan een extra dosis toe die gelijk is aan een vierde van de initiële anesthesiedosis. Wacht ongeveer 5 minuten voordat u de anesthesiediepte opnieuw beoordeelt. Ga pas verder als een chirurgisch anesthesievlak is bevestigd en beoordeel elke 20-30 minuten opnieuw.
   5. Maak een longitudinale incisie langs de sagittale hechting met behulp van een scalpel en zorg ervoor dat de snee diep genoeg is om de huid en het bindweefsel dat aan de schedel is bevestigd te omvatten.
   6. Houd de omliggende weefsels tijdens de operatie goed gehydrateerd met behulp van fysiologische zoutoplossing.
   7. Trek met een roterende boor lichtjes de omtrek van het schedelvenster over door de oppervlaktelaag van de schedel te markeren. Voor een optimale toegang tot de hersenen moet het venster ongeveer 14 mm zijn in de laterale dimensie en ten minste 2 mm in de anteroposterieure dimensie, afhankelijk van de schedelgrootte.
   8. Blijf langs de omtrek frezen totdat er geen botweerstand meer is. Breng tijdens het boren regelmatig een paar druppels fysiologische zoutoplossing aan om het bot af te koelen en thermische schade te minimaliseren. Een fijne spatel met ronde randen moet gemakkelijk en zonder kracht in de opening kunnen worden gestoken.
   9. Met korte, eenrichtingsruimbewegingen wordt de laatste laag bot dunner totdat de weerstand nauwelijks waarneembaar is.
   10. Plaats een dunne, licht gebogen spatel met afgeronde randen aan de zijrand van het schedelvenster.
   11. Beweeg de spatel langzaam naar het midden en maak het bot voorzichtig los van de hersenvliezen. Zodra er geen weerstand wordt gevoeld, tilt u het losgeraakte botstuk op en verwijdert u het volledig.
   12. Breng gecentrifugeerde ultrasone gel aan op de bovenkant van de dura. Een beschrijving van de experimentele opstelling is weergegeven in figuur 1.

Figuur 1: Schema van de experimentele opstelling voor ULM-beeldvorming van de hersenen bij knaagdieren. Het beeldvormingssysteem bestaat uit een ultrasone acquisitie-eenheid die is aangesloten op een hoogfrequente sonde die op een gemotoriseerde positioneringstafel is gemonteerd. Zowel muizen als ratten worden getoond in stereotactische frames: de muis heeft een geschoren hoofdhuid voor transcraniële beeldvorming, terwijl de rat beeldvorming ondergaat door een chirurgisch geprepareerd schedelvenster. Bij beide diersoorten wordt een staartaderkatheter geplaatst voor injectie met contrastmiddel. Deze opstelling zorgt voor de stabiele verwerving van functionele ultrasone gegevens met hoge resolutie tijdens de injectie van microbellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Katheterisatie van de staartader
   1. Gebruik een 27 G × 1/2" winged infusion set aangesloten op een 18 G × 1/2" naald met 8" slang. Kort de slang indien mogelijk in om het dode volume te minimaliseren.
   2. Draai de staart van het dier voorzichtig 90 graden om de laterale staartaders bloot te leggen (zie afbeelding 2). Zet de staart op zijn plaats met tape om stabiliteit te garanderen en onnodige beweging tijdens de katheterisatie te voorkomen.
   3. Identificeer de staartader door te beginnen bij het distale uiteinde (punt van de staart) en naar de basis te gaan. Om deze stap te vergemakkelijken, kan de staart worden verwarmd met lauw water om vasodilatatie te bevorderen en de zichtbaarheid van de ader te verbeteren.
   4. Oefen met een vinger lichte druk uit op de basis van de staart en schuif deze naar de injectieplaats (d.w.z. tegen de richting van de bloedstroom in). Deze manoeuvre belemmert tijdelijk de veneuze terugkeer, waardoor de caudale aderen uitzetten en prominenter worden, waardoor het inbrengen van de katheter wordt vergemakkelijkt.
   5. Steek de naald van 27 G × 1/2" van de gevleugelde infusieset evenwijdig aan de ader en zorg ervoor dat de afschuining naar boven wijst.
   6. Let op de aanwezigheid van bloedflashbacks, die de juiste plaatsing van de naald bevestigen.
      OPMERKING: Begin met katheterisatie aan het distale uiteinde van de staart om lekkage van eerdere puncties tijdens volgende injecties te voorkomen. Als staartaderkatheterisatie een uitdaging of niet succesvol blijkt te zijn, kunnen alternatieve centrale routes worden overwogen. Deze omvatten de retro-orbitale sinus, de halsader of de vena saphena.

Figuur 2: Anatomie in dwarsdoorsnede van de staart van knaagdieren ter illustratie van vasculaire oriëntatiepunten voor katheterisatie. Een schematische tekening van een dwarsdoorsnede door de distale knaagdierstaart, met de relatieve posities van de belangrijkste bloedvaten. In de buurt van de middellijn zijn twee slagaders aanwezig: de dorsale staartslagader, gelegen in het bovenste (dorsale) gebied, en de ventrale staartslagader, gelegen in het onderste (ventrale) deel van de staartdoorsnede. Deze slagaders worden doorgaans vermeden tijdens intraveneuze procedures. De slagaders worden lateraal geflankeerd door de caudale aders, die aan weerszijden symmetrisch lopen en net onder de huid liggen, waardoor ze de voorkeurstoegangsplaatsen zijn voor katheterisatie of injectie van microbellen. Dit anatomische overzicht helpt bij de precieze lokalisatie van de aderen, vooral wanneer deze wordt versterkt door opwarming om vaatverwijding te bevorderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Positionering van de sonde met behulp van de IcoScan-software
   1. Start op het acquisitieplatform de fUS-acquisitiesoftware (bijv. IcoScan voor Iconeus One) en maak een experimentsessie aan. Pas de positie van de ultrasone sonde aan.
      NOTITIE: Plaats de sonde ongeveer 1 mm boven de kop van het dier. Zorg ervoor dat de sonde in contact is met de ultrasone gel voordat u een beeldvormingsreeks start.
   2. Start de Live View-acquisitie en pas de positie van de sonde indien nodig aan met behulp van realtime beeldvorming van het cerebrale bloedvolume (CBV). De hersenen moeten gecentreerd zijn op het beeld. Optimaliseer beeldvormingsparameters, zoals contrast en compressie, om de visualisatiekwaliteit te verbeteren.
   3. Open het Angio3D-menu in de acquisitiesoftware. Pas de scanparameters aan (Eerste plak, Laatste plak en Stapgrootte) en zorg ervoor dat ze de hele hersenen bestrijken. Start de overname.
      OPMERKING: Zorg er bij het instellen van de scanparameters voor dat de scan het achterste deel van de hersenen bestrijkt, namelijk de gehele achterste slagaders.
   4. Houd de acquisitiesoftware open en start de IcoStudio-software voor data-analyse en visualisatie. Laad de Angio3D-scan .
   5. Ga naar het deelvenster Hersenregistratie en registreer de scan bij het Allen Mouse Common Coordinate Framework met behulp van de volledig automatische of handmatige registratiemodus.
   6. Sla de registratie op als een bps-bestand.
   7. Ga vervolgens naar het menu Hersennavigatie . Gebruik in het deelvenster Atlas Manager de boomnavigator Bovenliggend/Kind om door de Allen Mouse Brain Atlas te bladeren. Selecteer de beoogde anatomische regio's, die over de scan in het deelvenster met 3 weergaven worden geplaatst.
   8. Kies een beeldvlak dat de interessegebieden overlapt. Stel handmatig twee markeringen in de coronale weergave in om de beoogde beeldvormingsschijf te definiëren.
   9. Klik op het Brain Positioning System (BPS) om de motorcoördinaten te extraheren die overeenkomen met de positie van de sonde voor het in beeld brengen van het geselecteerde vlak. Controleer het voorbeeld van de afbeelding, berekend op basis van de Angio3D-scan, en klik op BPS-coördinaten kopiëren.
   10. Schakel over naar de IcoScan-software en open het paneel voor het positioneren van de sonde . Klik op BPS-coördinaten invoeren en plak de waarden die in stap 1.4.9 zijn geëxtraheerd. De sonde beweegt automatisch en wordt uitgelijnd met het geselecteerde beeldvlak.
   11. Voer een Live View-acquisitie uit om te bevestigen dat het huidige beeldvormingsvlak overeenkomt met het voorspelde vlak uit stap 1.4.8.
       OPMERKING: Door dezelfde ruimtelijke markeringen op te slaan en opnieuw te gebruiken, kan het beeldvormingsvlak consistent opnieuw worden gedefinieerd over sessies, waardoor een nauwkeurige herpositionering van de sonde mogelijk is voor longitudinale onderzoeken.

2. ULM-acquisitie

1. Bereiding van microbubbels
   OPMERKING: Er kan een verscheidenheid aan in de handel verkrijgbare ultrasone contrastmiddelen worden gebruikt. De samenstelling van het gas, de concentratie van de bellen, de diameter en de stabiliteit kunnen echter variëren, afhankelijk van het gebruikte product. Volg de aanbevelingen van de fabrikant met betrekking tot voorbereiding en opslag.
   1. Spuit met een steriele spuit 5 ml 0,9% natriumchlorideoplossing via het septum in de injectieflacon.
      OPMERKING: Voor herhaalde bolustoediening of continue infusie kan een lager volume van 0,9% natriumchloride-oplossing worden gebruikt om een meer geconcentreerde microbellensuspensie te bereiden. Pas de verdunningsfactor dienovereenkomstig aan op basis van de beoogde toepassing.
   2. Schud de injectieflacon krachtig gedurende 20 s om de microbellen volledig te suspenderen en een gelijkmatige dispersie te bereiken.
2. ULM-opname
   1. Definieer vooraf de opnameparameters, waaronder de ultrasone sequentie, framesnelheid en totale opnametijd.
      OPMERKING: Aanbevolen parameters voor opname zijn 5-10 minuten bij 2.5 Hz.
   2. Teken het volume van de microbellen die moeten worden geïnjecteerd en start de acquisitie. Zodra de acquisitie is begonnen, gaat u verder met de injectie van microbellen. Injectie van 200 μl voor ratten en 100 μl voor muizen, in de juiste verdunning, wordt aanbevolen.
   3. Controleer de contrastverbetering op het Live View-beeld. Spoel onmiddellijk daarna de resterende microbelletjes in het dode volume door fysiologische vloeistof in de katheter te injecteren. Een typisch voorbeeld van een intensiteitsprofiel van microbellen wordt weergegeven in figuur 3.
   4. Wacht tot de acquisitie is voltooid en sla de gegevens op.
   5. Aan het einde van de overname gaat u als volgt te werk, afhankelijk van het gebruikte protocol:
      1. Voor muizen (niet-invasief protocol): Keer de anesthesie om door de toediening van isofluraan te stoppen en controleer het dier tijdens het herstel in een warme omgeving tot het volledig wakker is.
      2. Voor ratten (invasief protocol met schedelvenster): Euthanasie van het dier door intraperitoneale injectie van Euthasol (pentobarbitalnatrium, 140 mg/kg), in overeenstemming met institutionele en ethische richtlijnen.

Figuur 3: Signaalintensiteit van microbellen in de loop van de tijd. (A) Illustratie van het interessegebied (ROI) dat wordt gebruikt voor signaalextractie, dat de gehele coronale hersenschijf omvat. (B) Tijdsverloop van de signaalintensiteit van microbellen tijdens een acquisitie van 5 minuten. De microbellenbolus werd geïnjecteerd om 30 s, wat resulteerde in een karakteristieke toename van de signaalamplitude. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Beeldreconstructie met behulp van de IcoLab software

1. Open IcoLab en navigeer naar ULM door op het tabblad ULM aan de linkerkant van het scherm te klikken.
2. Klik op ULM-toewijzingen berekenen om de verwerkingsworkflow te starten, zoals beschreven in afbeelding 4.
3. Selecteer de bronmap met de verkregen gegevens.
4. Kies de specifieke scan die moet worden verwerkt en pas de verwerkingstijdslimieten indien nodig aan.
5. Klik op Volgende om door te gaan naar de stap Rapportage. Configureer in de stap Rapportage het pad van de uitvoermap waarin verwerkte bestanden worden opgeslagen. Stel de visualisatieparameters in voor de afbeeldingen die in het PowerPoint-rapport worden opgenomen.
6. Bekijk het overzicht van de geselecteerde opties dat op het laatste scherm wordt weergegeven.
7. Als u klaar bent, klikt u op UITVOEREN om de verwerking te starten. Zodra de verwerking is voltooid, wordt een .trk-bestand gegenereerd met alle coördinaten van gelokaliseerde microbellen, samen met gerasterde TIFF-bestanden voor dichtheid, snelheid en backscatter amplitude (BSA).
   OPMERKING: Een acquisitie van 5 minuten kan enkele uren verwerking vergen. Deze stap kan het beste 's nachts of op een speciaal werkstation worden uitgevoerd.
   1. Genereren van kaarten met de dichtheid van microbellen: Gelokaliseerde posities van alle gedetecteerde microbellen worden verzameld gedurende de geselecteerde acquisitietijd. Breng deze posities in kaart op een ruimtelijk raster met een vaste resolutie.
      OPMERKING: Elke pixel in de resulterende dichtheidskaart geeft het aantal microbellen weer dat in die ruimtelijke bak is gelokaliseerd. De uiteindelijke uitvoer is een grijswaardenbeeld (TIFF) waarbij de pixelintensiteit overeenkomt met de bezetting van het vat, waardoor reconstructie met hoge resolutie van het vasculaire netwerk mogelijk is.
   2. Genereren van snelheidskaarten: De software volgt individuele microbellen over opeenvolgende frames om trajecten te vormen. Voor elke baan berekent de software een snelheidsvector door de verplaatsing te delen door de verstreken tijd (wat een snelheidsvector in mm/s oplevert).
      OPMERKING: Er kunnen twee soorten snelheidskaarten worden gegenereerd: kaarten met absolute snelheid, waarbij elke pixel de gemiddelde snelheid van de microbellen die er doorheen gaan opslaat, en richtingssnelheidskaarten, waarbij de snelheid wordt ontleed langs een gekozen anatomische as (d.w.z. x of z), en het bijbehorende ondertekende onderdeel wordt opgeslagen. Deze kaarten worden gerasterd op hetzelfde ruimtelijke raster en opgeslagen als individuele TIFF-afbeeldingen.
   3. Genereren van BSA-kaarten: Voor elke gelokaliseerde microbel wordt de amplitude van het ruwe ultrasone signaal (terugverstrooide intensiteit) weergegeven. Projecteer deze amplitudes op het ruimtelijke raster en accumuleer de signaalintensiteit in elke pixel. De resulterende BSA-kaart markeert gebieden waar microbellen door het brandpunt van de bundel zijn gegaan, wat een contrast biedt dat een aanvulling vormt op de dichtheids- en snelheidskaarten¹⁵.

Figuur 4: Stroomdiagram van de verwerkingspijplijn voor de reconstructie van de ULM-kaart. De afbeelding illustreert de sequentiële verwerkingsstappen die in de analysesoftware worden uitgevoerd om ULM-kaarten te genereren op basis van onbewerkte ultrasone gegevens. Uitgaande van samengestelde frames (n = 200), past stap 1 enkelvoudige waardedecompositie (SVD) clutter filtering toe om microbubbelsignalen (MB) te isoleren van de weefselachtergrond. In stap 2 ondergaan de MB-signalen Lanczos-interpolatie, wat resulteert in een voorbewerkte beeldstapel. Stap 3 voert lokale maxima-detectie uit en correleert deze met de puntspreidingsfunctie (PSF) van het systeem om kandidaat-microbubbellocaties te identificeren. In stap 4 worden subpixellokalisatie (centroïddetectie) en deeltjestracking gebruikt om microbellenbanen te extraheren, waaruit kaarten van snelheid en terugverstrooide amplitude worden berekend. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Gegevensvisualisatie met behulp van de IcoStudio-software

1. Laad een .trk-bestand in IcoStudio om te beginnen met het verkennen van gegevens.
2. Pas visualisatieparameters zoals contrast, compressie en kleurenkaart aan in het rechterdeelvenster om de gegevensweergave te verfijnen.
3. Stel de integratietijd in met behulp van de dubbele schuifregelaar onder aan de hoofdweergave om de begin- en eindframes te definiëren.
4. Open het tabblad Dichtheid om het voorkomen van microbellen weer te geven en kies tussen Absolute dichtheid (aantal per pixel) en Directionele dichtheid (axiaal gewogen).
5. Gebruik het tabblad Snelheid om de snelheid van microbellen in mm/s weer te geven via meerdere modi: Absoluut, Directioneel, Axiaal en Lateraal. Pas contrast-, compressie- en snelheidsdrempels aan om de visualisatie te verbeteren.
6. Verken het BSA-tabblad om de reflectiviteit van microbellen te visualiseren en een alternatief contrastmechanisme te bieden dat microvasculaire structuren en beweging buiten het vlak benadrukt. Exporteer PNG-schermafbeeldingen met hoge resolutie of genereer TIFF-bestanden voor kwantitatieve analyse met aanpasbare instellingen voor pixelgrootte en gegevenstype.

Resultaten

De representatieve voorbeelden in figuur 5 tonen een typisch voorbeeld van ULM-gegevens van een rattenbrein dat meer dan 1 minuut werd geregistreerd na 200 μl microbellenbolusinjectie, met een resolutie van 10 μm.

Figuur 5: Representatieve ULM-output verkregen van een craniotomiseerde rat na een enkele injectie van microbellen. Voorbeeldkaarten van de dichtheid van microbellen (MB) (links), snelheid (midden) en terugverstrooide amplitude (rechts) worden getoond voor een volledige coronale hersenschijf, verkregen gedurende 1 minuut opname na een bolusinjectie van 200 μL van microbellen. Schaal staaf: 2mm. Ingezoomde inzetstukken markeren de linker corticale microvasculatuur (schaalbalk: 0,5 mm). De dichtheidskaart geeft de ruimtelijke verdeling van MB-voorvallen weer, waardoor de structuur van het vasculaire netwerk wordt onthuld. De snelheidskaart illustreert de stroomsnelheid en richtingsgevoeligheid van individuele MB's, waardoor onderscheid tussen scheepstypen mogelijk is. De amplitudekaart toont het terugverstrooide ultrasone signaal van MB's, wat een extra contrastmechanisme biedt dat de visualisatie van de morfologie van het schip en de beweging buiten het vlak verbetert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De resulterende kaarten illustreren drie complementaire weergaven van de cerebrale microvasculatuur: dichtheid van microbellen (MB), snelheid (midden) en terugverstrooide amplitude (rechts). Elke kaart komt overeen met een volledig coronaal plakje van de hersenen, met ingezoomde inzetstukken die de linker corticale microvasculatuur markeren (schaalbalken: respectievelijk 2 mm en 0,5 mm).

De dichtheidskaart toont de ruimtelijke verdeling van MB-voorvallen over het gezichtsveld. De morfologie van bloedvaten wordt ver onder de diffractielimiet opgelost, waardoor zowel grote bloedvaten als fijne capillaire structuren zichtbaar worden. Dit type kaart maakt een duidelijke visualisatie mogelijk van de topologie van het vasculaire netwerk, inclusief vertakkingen en vertakkingspatronen, zelfs in diepe corticale gebieden.

De snelheidskaart geeft de stroomsnelheid weer van individuele MB's die in de axiale (z) richting worden geprojecteerd. Deze projectie produceert ondertekende snelheidswaarden, waarbij negatieve snelheden de opwaartse stroom in de cortex weerspiegelen en positieve waarden de neerwaartse stroom weerspiegelen. In de hersenschors van knaagdieren is de vasculaire architectuur sterk stereotiep: penetrerende arteriolen dalen af van het piale oppervlak in de corticale lagen, terwijl venulen vanuit de cortex terug naar het oppervlak stijgen om zuurstofarm bloed af te voeren¹⁶. Deze consistente anatomische opstelling maakt het gebruik van directionele snelheidsmetingen mogelijk om onderscheid te maken tussen scheepstypen, waarbij positieve axiale snelheden doorgaans een indicatie zijn van arteriële stroming en negatieve snelheden van veneuze drainage. Over het algemeen komen de snelheidswaarden gemeten met ULM overeen met eerder gerapporteerde bereiken in de literatuur^10,17, variërend van 10-20 mm/s in penetrerende arteriolen tot enkele centimeters per seconde in grote intracraniële slagaders. Deze bevindingen zijn in lijn met eerdere waarnemingen dat stromende microbellen het reologische gedrag van rode bloedcellen¹⁸ nauwkeurig nabootsen, wat het gebruik van ULM voor het kwantificeren van fysiologische bloedstroomdynamiek op microschaal valideert.

De backscatter amplitude (BSA)-kaart biedt een ruimtelijke weergave van de ultrasone signaalintensiteit die door elke MB wordt geretourneerd. Omdat de terugverstrooide energie wordt gemaximaliseerd wanneer MB's door het brandpuntsgebied gaan, biedt deze kaart contrast op basis van de hoogtepositie. Het helpt bij het verfijnen van segmentatie door het identificeren van bewegingen buiten het vlak of schepen met een lage amplitude, vooral op grotere diepten of in de buurt van de brandpuntsranden. BSA-kaarten zijn ook waardevol voor het detecteren van dieptegerelateerde signaalverzwakking of het identificeren van mismatches in focale uitlijning¹⁵.

Om de reproduceerbaarheid van vliegtuigtargeting met het Brain Positioning System aan te tonen, toont Figuur 6A ULM-vasculaire dichtheidskaarten die in dezelfde muis onder narcose zijn verkregen op dag 0 (week 1) en dag 7 (week 2), gericht op hetzelfde coronale vlak. De overlay van beide kaarten toont een sterke ruimtelijke correspondentie van het vasculaire signaal, wat de precisie van de herpositionering van het vlak en de betrouwbaarheid van longitudinale experimenten bevestigt, zoals eerder aangetoond¹⁹.

Kwantitatieve analyse kan worden toegepast op elk van deze outputs. Gebruikers kunnen bijvoorbeeld vaten segmenteren met behulp van intensiteitsdrempels of clusteralgoritmen, en vervolgens regionale statistieken extraheren, zoals vaatdichtheid, gemiddelde stroomsnelheid en morfometrische parameters, waaronder vaatstraal, gemiddelde lengte, aantal vertakkingen en andere structurele descriptoren van het vasculaire netwerk. Vergelijkingen tussen corticale regio's of experimentele groepen (bijv. geïnjecteerd versus controle) kunnen rechtstreeks op deze kaarten worden uitgevoerd of door middel van afgeleide parametrische statistieken op algemeen geïdentificeerde vaten^20,21. Als voorbeeld van een dergelijke analyse hebben we regionale kwantificeringen uitgevoerd van vasculaire parameters in de linker somatosensorische cortex (S1BF, Figuur 6B) en de linker thalamus (Figuur 6C). De dichtheidskaarten werden eerst gebinariseerd, geskeletteerd en de straal van het vat werd geschat met behulp van een Euclidische afstandstransformatie. Stroomsnelheden werden rechtstreeks verkregen uit de MB-trajecten en het debiet werd afgeleid van de straal van het vat met behulp van de wet van Poiseuille, zoals eerder beschreven²¹. Dezelfde methodologie als beschreven in die studie werd hier toegepast. Whisker-plots geven de verdelingen van de straal, snelheid en stroomsnelheid van het vat voor d0 en d7 weer, wat een goede reproduceerbaarheid over sessies aantoont. Samen maken deze multimodale ULM-outputs een uitgebreide karakterisering van het microvasculaire netwerk van de hersenen mogelijk, en bieden ze zowel anatomische als dynamische inzichten met een ongekende resolutie.

Figuur 6: Longitudinale reproduceerbaarheid van plane targeting en voorbeeld van vasculaire kwantificeringen met behulp van het Brain Positioning System. (A) ULM-vasculaire dichtheidskaarten verkregen van dezelfde verdoofde muis op dag 0 (week 1) en dag 7 (week 2), gericht op hetzelfde coronale vlak met behulp van het Brain Positioning System (schaalbalk = 1 cm). De overlay van beide kaarten toont een sterke ruimtelijke correspondentie van het vasculaire signaal, wat de reproduceerbaarheid van de positionering van het vliegtuig over sessies illustreert. (B,C) Representatieve kwantificering van vasculaire parameters geëxtraheerd uit twee interessegebieden: linker somatosensorische cortex (S1BF, B) en linker thalamus (C). Voor elke regio tonen we de vasculaire dichtheidskaart op d0 (schaalbalk = 0,5 cm), samen met snorhaardiagrammen die de verdeling van de vaatstraal (μm), stroomsnelheid (mm/s) en stroomsnelheid (mm³/s) op d0 en d7 weergeven (mediaan, 25e-75e percentiel, snorharen = 1,5×IQR, uitschieters afzonderlijk uitgezet). Deze resultaten illustreren het vermogen van de pijplijn om morfometrische en hemodynamische metrieken uit de ULM-gegevens te extraheren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Ultrasone lokalisatiemicroscopie (ULM) vertegenwoordigt een transformatieve vooruitgang in ultrasone beeldvorming, waardoor visualisatie van het microvasculatuur met superresolutie mogelijk is tot voorbij de conventionele diffractielimiet. Deze bespreking belicht de kritieke stappen in het ULM-protocol, behandelt mogelijke wijzigingen en strategieën voor probleemoplossing, verkent de beperkingen van de methode, evalueert de betekenis ervan in vergelijking met alternatieve beeldvormingsmodaliteiten en beschouwt het belang en de mogelijke toepassingen ervan in biomedisch onderzoek.

Kritieke stappen in het ULM-protocol

Verschillende stappen zijn cruciaal voor de succesvolle implementatie van ULM, en hun invloed wordt geïllustreerd in figuur 7. Een van de belangrijkste stappen is de toediening van microbellen, aangezien zowel de concentratie als de afgiftekwaliteit rechtstreeks van invloed zijn op de beeldvormingsresultaten. Een optimale concentratie is nodig om ruimtelijke resolutie en detecteerbaarheid in evenwicht te brengen. Onvoldoende plaatsing, zoals slechte plaatsing van de katheter of extravasatie, kan leiden tot een zeer laag vasculair signaal en onvolledige reconstructies, zoals weergegeven in figuur 7B, waarbij slechts een klein aantal microbellen de bloedbaan bereikt. Beeldvorming met een hoge framesnelheid, meestal in het kilohertz-bereik, is essentieel voor het vastleggen van de snelle beweging van microbellen en het mogelijk maken van betrouwbare tracking over frames. Elke instabiliteit tijdens de acquisitie, zoals beweging veroorzaakt door ademhaling, slechte fixatie of onvoldoende anesthesie, kan de lokalisatienauwkeurigheid verminderen. Een voorbeeld hiervan wordt geïllustreerd in Figuur 7C, waar overmatige beweging tijdens de acquisitie resulteert in een wazige en onbruikbare dichtheidskaart.

De lokalisatie en tracking van microbubbels zijn afhankelijk van geavanceerde beeldverwerkingsalgoritmen die individuele bubbels detecteren, subpixellokalisatie uitvoeren en trajecten reconstrueren met subdiffractieprecisie. Zelfs met de juiste acquisitie en verwerking kunnen anatomische factoren zoals door de schedel veroorzaakte aberraties de beeldkwaliteit nog steeds beïnvloeden. Bij transcraniële beeldvorming, vooral bij oudere muizen, kan schedelverdikking akoestische vervorming veroorzaken. Dit leidt tot karakteristieke schaduwartefacten onder de sagittale hechting, waar geen microbelletjes worden gedetecteerd, zoals weergegeven in figuur 7D. Dergelijke aberraties verminderen de signaal-ruisverhouding en kunnen vasculaire structuren verdoezelen, tenzij ze worden gecorrigeerd met adaptieve filtering of door de plaatsing van de sonde te verfijnen.

Wanneer alle stappen met succes worden uitgevoerd, zijn ULM-kaarten van hoge kwaliteit haalbaar, zoals weergegeven in figuur 7A, waar een dicht en goed opgelost vasculair netwerk wordt gereconstrueerd door middel van een transcraniële benadering.

Afbeelding 7: Referentie- en probleemoplossingsvoorbeelden voor de kwaliteit van ULM-beeldvorming bij muizen. Paneel (A) toont een hoogwaardige transcraniële ULM-microbel (MB) dichtheidskaart verkregen in een jongvolwassen muis, ter illustratie van succesvolle vasculaire kartering over het volledige coronale vlak. Paneel (B) geeft een voorbeeld weer van een slecht vasculair signaal als gevolg van extravasatie van microbellen of onvoldoende veneuze toegang, wat resulteert in schaarse MB-detecties. Paneel (C) toont een acquisitie die wordt beïnvloed door overmatige beweging van dieren, wat een wazige en niet-interpreteerbare dichtheidskaart oplevert. Paneel (D) benadrukt door de schedel geïnduceerde akoestische aberratie die vaak wordt waargenomen bij oudere muizen, zichtbaar als een schaduwkegel onder de sagittale hechting waar geen MB's worden gedetecteerd vanwege een verminderde signaal-ruisverhouding. Deze voorbeelden dienen als visuele referenties voor het identificeren en aanpakken van veelvoorkomende experimentele artefacten in ULM-beeldvorming. Schaal balk: 1mm. Klik hier om een grotere versie van dit figuur te bekijken.

Beperkingen van de methode

Ondanks de vele voordelen heeft ULM inherente beperkingen die van invloed zijn op de toepasbaarheid ervan. Vertekening van bloedvaten buiten het vlak is een belangrijk probleem bij 2D-beeldvorming, aangezien bloedvaten die zich buiten het beeldvormingsvlak uitstrekken, niet adequaat worden gereconstrueerd, wat leidt tot onvolledige vasculaire kaarten. Deze beperking kan worden verzacht door over te stappen op volumetrische (3D) beeldvormingsbenaderingen²², hoewel dit de computationele complexiteit verhoogt. Uitdagingen op het gebied van intraveneuze katheterisatie vormen ook een hindernis, vooral in modellen met kleine dieren, waar het bereiken van een consistente toediening van microbellen technisch veeleisend kan zijn. De stabiliteit van microbellen is ook een beperkende factor, vooral tijdens langdurige beeldvormingssessies. Vanwege hun korte halfwaardetijd van de bloedsomloop kunnen microbellen herhaalde bolusinjecties of continue infusieprotocollen vereisen om gedurende de acquisitieperiode voldoende contrast te behouden. Bewegingsartefacten blijven een belangrijk punt van zorg, vooral voor wakkere proefpersonen, waar zelfs kleine onwillekeurige bewegingen de beeldvorming met superresolutie kunnen verslechteren. Ten slotte wordt dieptepenetratie in ULM inherent beperkt door ultrasone verzwakking. Hoewel dit over het algemeen niet problematisch is voor beeldvorming van knaagdieren bij hoge frequenties (bijv. 15 MHz), wordt het een grotere uitdaging bij grotere dieren zoals varkens of niet-menselijke primaten. In deze gevallen kunnen sondes met een lagere frequentie nodig zijn om voldoende beelddiepte te bereiken, maar dit gaat ten koste van een verminderde ruimtelijke resolutie, wat een belangrijke afweging tussen diepte en detail onderstreept waarmee rekening moet worden gehouden bij het vertalen van ULM naar grotere preklinische modellen.

Betekenis van ULM in vergelijking met bestaande methoden

Ultrasone lokalisatiemicroscopie (ULM) biedt aanzienlijke voordelen ten opzichte van conventionele beeldvormingsmodaliteiten, met name in de context van microvasculaire beeldvorming. Een van de meest opvallende sterke punten is het vermogen om de diffractielimiet van traditionele echografie te overschrijden, waardoor subdiffractiebeeldvorming wordt bereikt op ruimtelijke schalen die vergelijkbaar zijn met optische technieken zoals twee-fotonmicroscopie. In tegenstelling tot deze optische methoden zorgt ULM echter voor diepere weefselpenetratie, waardoor toegang wordt verkregen tot hersengebieden die anders moeilijk niet-invasief te visualiseren zijn.

ULM biedt ook functionele beeldvormingsmogelijkheden, waardoor de kwantitatieve beoordeling van de bloedstroomsnelheid, perfusiedynamiek en vasculaire remodellering mogelijk is. Deze eigenschappen maken het zeer geschikt voor het onderzoeken van zowel fysiologische processen als pathologische veranderingen in neurovasculaire netwerken. In vergelijking met MRI en PET is ULM kosteneffectiever, vereist het geen zware infrastructuur en vermijdt het het gebruik van contrastmiddelen met bekende toxiciteitsrisico's, maar vertrouwt het in plaats daarvan op met gas gevulde microbellen met gunstige veiligheidsprofielen.

De combinatie van een hoge ruimtelijke en temporele resolutie maakt ULM bijzonder waardevol voor een reeks onderzoekstoepassingen. Het is vooral krachtig in onderzoeken die gericht zijn op microvasculaire structuren en diepe hersenkernen, waar traditionele modaliteiten vaak tekortschieten. Bovendien maakt ULM, in tegenstelling tot histologische benaderingen die weefselfixatie en kleuring vereisen, real-time beeldvorming bij levende dieren mogelijk, ter ondersteuning van longitudinale ontwerpen en dynamische interventies zoals farmacologische uitdagingen.

Naast statische vasculaire kartering maakt ULM ook functionele beeldvorming met hoge resolutie mogelijk door de dynamiek van de cerebrale bloedstroom vast te leggen met uitzonderlijke ruimtelijke en temporele precisie. Recente ontwikkelingen hebben de haalbaarheid ervan aangetoond voor functionele neuroimaging van de hele hersenen bij knaagdieren, waarbij door prikkels opgewekte en spontane activiteitsafhankelijke veranderingen in de bloedstroom op capillair niveau over gedistribueerde hersennetwerken worden onthuld². Dit positioneert ULM als een krachtig hulpmiddel voor functionele studies, waardoor de kloof tussen mesoschaal hemodynamische beeldvorming en het in kaart brengen van neuronale activiteit effectief wordt overbrugd.

Overwegingen op het gebied van bruikbaarheid, efficiëntie en reproduceerbaarheid

De ULM-workflow die in dit protocol wordt beschreven, is geoptimaliseerd voor eenvoudige implementatie en reproduceerbaarheid in verschillende experimentele opstellingen. Het gebruik van in de handel verkrijgbare componenten, waaronder door de FDA en EMA goedgekeurde microbellen en standaard anesthesieprocedures voor knaagdieren, zorgt voor een brede toegankelijkheid. Bovendien verbetert de integratie van de gehele verwerkingspijplijn binnen de dedicated software (IcoLab) de bruikbaarheid aanzienlijk door complexe stappen te automatiseren, zoals het lokaliseren van microbellen, het reconstrueren van trajecten en het genereren van kaarten. Deze gestroomlijnde interface vermindert de behoefte aan aangepaste code en minimaliseert de tussenkomst van de gebruiker, waardoor consistente resultaten voor alle gebruikers en experimenten worden ondersteund. Hoewel ULM-verwerking met hoge resolutie rekenintensief is, vooral voor lange acquisities of volumetrische gegevens, verkorten batchverwerkingstools en GPU-versnelling de analysetijd aanzienlijk. Het modulaire ontwerp van het protocol ondersteunt ook reproduceerbaarheid, waardoor onderzoekers de acquisitie- en verwerkingsparameters kunnen verfijnen met behoud van een robuust analytisch kader. Het protocol bevat ook een speciaal gedeelte over het positioneren van de sonde met behulp van IcoScan en IcoStudio, waarmee gebruikers de sonde betrouwbaar kunnen herpositioneren op exact dezelfde beeldvormingssegment tijdens sessies, met een nauwkeurigheid van ongeveer 100 μm. Deze functie is vooral waardevol voor longitudinale studies, waar nauwkeurige ruimtelijke consistentie essentieel is voor het volgen van vasculaire veranderingen in de tijd. Deze functies verlagen samen de toetredingsdrempel voor nieuwe gebruikers en ondersteunen de schaalbare inzet van ULM in zowel verkennende als longitudinale beeldvormingsstudies.

Conclusie

Dit protocol biedt een complete workflow voor het implementeren van ultrasone lokalisatiemicroscopie (ULM) bij beeldvorming van de hersenen van knaagdieren, met inbegrip van chirurgische voorbereiding, toediening van microbellen, beeldacquisitie en vasculaire kartering met hoge resolutie met behulp van een gestandaardiseerd acquisitie- en analyseplatform dat is geoptimaliseerd voor preklinisch onderzoek. ULM vertegenwoordigt een belangrijke vooruitgang in biomedische beeldvorming en biedt superresolutie in vivo visualisatie van de microvasculatuur met ongekend detail. Vergeleken met bestaande beeldvormingsmodaliteiten biedt ULM een unieke combinatie van hoge ruimtelijke resolutie, kwantificering van functionele stromen en toegankelijkheid, waardoor het bijzonder geschikt is voor studies naar vasculaire ontwikkeling, neurovasculaire koppeling en pathofysiologie van de ziekte. Naarmate de technologie zich verder ontwikkelt, staat ULM op het punt een hoeksteen te worden in zowel preklinisch onderzoek als, uiteindelijk, klinische neuroimaging-toepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Diertemperatuurregelaar (verwarmingsplaat gekoppeld aan een rectale sonde)	Physitemp	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, Frankrijk	Antisedan	5 mg/mL injectieoplossing
C57BL/6 muizen	Janvier Labs	SC-C57J-M	C57BL/6Rj mannelijke muizen, 8 weken oud
Tandboormachine	Foredom, USA	K.1070 High Speed Rotary Micromotor Kit
Ontharingscreme	Vichy	N/A
Oogzalf	TVM, UK	Ocry-gel
Haartrimmer	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
IcoLab verwerkingssoftware (v 1.2.0.0)	Iconeus, Frankrijk	IcoLab
Iconeus One Xpand configuratie	Iconeus, Frankrijk	IconeusOne Xpand
IcoPrime 15MHz sonde	Iconeus, Frankrijk	IcoPrime-15MHz sonde
IcoScan acquisitiesoftware (v1.9.0)	Iconeus, Frankrijk	IcoScan
IcoStudio analysesoftware (v2.2.0)	Iconeus, Frankrijk	IcoStudio
Jodiumoplossing	Mylan, Frankrijk	N/A
Isofluraanneusapparaat	Minerve, Esternay, Frankrijk	N/A
Ketamine	Virbac, Frankrijk	Ketamine1000	100 mg/mL injectieoplossing
Meloxicam	Boehringer Ingelheim	Metacam	0.5 mg/mL injectieoplossing
Nadelen	Terumo, Frankrijk	AN*1838R1	18 G x ½” naald met 8” slang
Zoute oplossing	Laboratoire Gilbert Physiodose, Apotheek, Frankrijk	N/A
Schaar	DREXCO medisch, Frankrijk	80011
SonoVue microbubbels	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Spatelketting	Phymed, Frankrijk.	K.1070 High Speed Rotary Micromotor Kit
Sprague-Dawley Rj:Han ratten	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - Sprague Dawley mannelijke ratten, 200-300 g
Stereotactisch frame	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Met Muis Adapter  (Ref: 922) en Non-Rupture Oor Bar (ref: 922)
Spuit	DREXCO medisch, Frankrijk	2058
Ultrageluidgel	DREXCO medisch, Frankrijk	Medi'Gel
Vleugelinfuusset	Terumo, Frankrijk	SV*27EL
Xylazin 2%	Bayer, Frankrijk	Rompun	20 mg/mL injectieoplossing