Methodenartikel

Gedefinieerde xenovrije herprogrammering van navelstrengbloedvoorlopercellen naar geïnduceerde pluripotente en blastomeerachtige stamcellen

583 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 augustus 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol schetst chemisch gedefinieerde methoden voor xenovrije (XF), feedervrije (FF), episomale herprogrammering van myeloïde voorlopercellen van menselijk navelstrengbloed (CB) tot conventionele door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC). Deze XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) kunnen efficiënt worden teruggezet naar blastomeerachtige Tankyrase/PARP1-remmer-gereguleerde naïeve stamcellen (TIRN-SC) met verhoogde differentiatie en interspecies chimaera-potentieel.

Samenvatting

Herprogrammering van de myeloïde voorloper van humaan navelstrengbloed (CB) naar een high-fidelity humaan geïnduceerde pluripotente stamcel (hiPSC)-toestand kan worden bereikt met behulp van niet-integrerende episomale vectoren en stromale signalen. Deze conventionele, geprepareerde CB-hiPSC-lijnen kunnen vervolgens met hoge efficiëntie chemisch worden teruggezet naar een blastomeerachtige tankyrase/PARP-remmer-gereguleerde naïeve stamcel (TIRN-SC) toestand met functionele totipotentie. PARP-gereguleerde TIRN-SC's zijn menselijke stamcellen met een hoge epigenetische plasticiteit, stabiele epigenomische afdrukken en hebben een grotere differentiatiepotentie dan conventionele, afstammingsgeprepareerde hiPSC's. Hier worden geoptimaliseerde XF/FF-methoden beschreven voor efficiënte mesenchymale stroma-geactiveerde episomale herprogrammering van CD34+ CD33+ CB myeloïde voorlopers in conventionele XF/FF hiPSC. TIRN-reversie versterkte reproduceerbaar XF/FF conventionele hiPSC om transcriptionele, epigenetische en functionele kenmerken van menselijke embryocellen in het splitsingsstadium over te nemen met verminderde genexpressie die door de afstamming is geprimed. We valideerden dat TIRN-gereverteerde CB-afgeleide XF-hiPSC een duidelijke verbetering vertoonde in gerichte differentiatie van meerdere lijnen (inclusief hematovasculaire lijnen) over een breed repertoire van genetisch onafhankelijke achtergronden. Deze methoden dienen als een eerste stap voor het genereren van cGMP-conforme TIRN-SC-lijnen voor door HLA gedefinieerde 'universele' donor-TIRN-SC (UTIRN-SC) banken van klinische kwaliteit. De afleiding van UTIRN-SC-lijnen met verbeterde differentiatieveelzijdigheid van CD34+ CD33+ CB-voorlopercellen zou een grote impact kunnen hebben op de regeneratieve geneeskunde. UTIRN-SC's zouden bijvoorbeeld weefselbanken kunnen genereren van HLA-gedefinieerde, cryo-geconserveerde cardiale, vasculaire en neurale donorvoorlopers voor uitgebreide "kant-en-klare" cellulaire therapieën met meerdere afstamming.

Inleiding

Hoewel door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) veelbelovende mogelijkheden bieden voor gepersonaliseerde cellulaire therapieën, staat hun klinische toepassing voor grote uitdagingen, waaronder tumorigeniciteit, immunogeniciteit en fenotypische en functionele heterogeniteit1, die van invloed zijn op hun veiligheid, werkzaamheid en kosteneffectiviteit. Bovendien worden afstammingsgecommitteerde voorlopercellen afgeleid van conventionele, geprimede hiPSC-lijnen gegenereerd met zeer variabele interline-differentiatie-efficiënties2, en vertonen ze beperkte in vivo implantatie en functionaliteit. Dergelijke beperkingen kunnen echter worden overwonnen met behulp van geoptimaliseerde herprogrammeringsmethoden3 of alternatieve stamceltoestanden 4,5.

Hoewel de efficiëntie van niet-virale episomale herprogrammering van huid- of bloedsomatische cellen in hiPSC laag is (~0,01%-2%)6, kan sterk geoptimaliseerde vierfactorherprogrammering van CB-voorlopercellen worden bereikt en kan tot 50% bulkefficiëntie worden bereikt in mesenchymale stromale stamvoorloper (MSC)-geactiveerde co-cultuuromstandigheden7. In dit systeem werd de cellulaire herprogrammering van CB-myeloïde voorlopers versneld door oplosbare en contactafhankelijke stromale signalen. Stroma-geprimede (SP) episomale CB-afgeleide hiPSC-lijnen gedifferentieerd in vasculaire voorlopercellen (VP) met hogere efficiëntie dan conventionele fibroblast-afgeleide hiPSC 3,5. SP-CB-iPSC-afgeleide VP vertoonde een meer authentieke embryonale VP-transcriptie-identiteit, verminderde veroudering en gevoeligheid voor DNA-schade 3,4. SP-CB-iPSC-afgeleide VP vertoonde ook een robuustere in vivo implantatie dan conventionele hiPSC-afgeleide VP na systemische of directe transplantatie in het glasvocht van retinale ischemie-reperfusie-beschadigde volwassen immunodeficiënte muizen 3,4.

Zimmerlin et al. hebben een tweestaps chemisch herprogrammeringssysteem opgezet ('LIF-5i -> LIF-3i') dat geprime, conventionele menselijke pluripotente stamcellen overzet naar een TIRN-SC-toestand met een verbeterd multi-lineage differentiatiepotentieel5. Gedifferentieerde TIRN-SC-afgeleide vasculaire voorlopercellen vertoonden een hogere functionaliteit, grotere genomische stabiliteit en superieure in vivo implantatie, zoals blijkt uit hun verbeterde vermogen om te migreren naar en opnieuw te vasculariseren van de diepe neurale lagen van het ischemische netvlies4. TIRN-SC onderging proteogenomische herprogrammering om een functionele hybride blastomeerachtige toestand te verkrijgen met een hoge bijdrage in de interspecifieke chimaera-assay8. TIRN-SC behield DNMT1-expressie en werd beschermd tegen erosie in CpG-gemethyleerde genomische ingeprinte regio's. Interessant is dat SP-CB-hiPSC efficiënter werden teruggezet naar TIRN-SC dan hiPSC afgeleid via alternatieve, minder efficiënte methoden 5,9.

TIRN-SC's zijn dus een alternatieve stamceltoestand met een verbeterde differentiatiecapaciteit voor meerdere afstammingslijnen en een efficiënte bijdrage aan chimaera. Verdere optimalisatie van
TIRN-SC-herprogrammering in gedefinieerde, cGMP-conforme kweekomstandigheden zal de generatie van een breed scala aan functionele, transplanteerbare celtypen en weefsels voor therapieën vergemakkelijken. Om tegemoet te komen aan de behoefte aan kosteneffectieve therapeutische voorlopercellen, kunnen deze methoden worden toegepast om cGMP-grade banken van 'Universal Donor' TIRN-SC (UTIRN-SC) te produceren met behulp van HLA-gedefinieerde CD34+ hematopoëtische CB of perifere bloedvoorlopercellen. HLA-gedefinieerde UTIRN-SC-afgeleide voorlopercellen zouden kunnen voldoen aan de behoeften van een groter aantal patiënten die onmiddellijke, multi-lineage regeneratie van complexe weefsels nodig hebben.

De paradigma's die zijn ontwikkeld voor klinische beenmergtransplantatie (BMT) kunnen als leidraad dienen voor de ontwikkeling van UTIRN-SC-banken uit gedeeltelijk HLA-gematchte, of HLA-haplo-identieke hematopoëtische stamcellen uit nationale donorregisters. Een voorspellende, wereldwijde computationele analyse van de gecombineerde top 10 haplotypes uit 18 landen, waaronder de VS, zou een gemiddelde patiëntendekking van 68,4% van dergelijke hiPSC-'haplobanken' opleveren10. Een gedefinieerde UTIRN-SC-bank zou niet alleen afstammingsgebonden voorlopercellen kunnen leveren, maar ook therapeutische TIRN-SC-toepassingen kunnen ondersteunen van interspecifieke blastocystcomplementatiesystemen bij huisdieren (bijv. varkens) voor het genereren van hele organen11,12, inclusief het genereren van tolerantie-inducerende hematopoëtische voorlopercellen voor het verminderen van transplantaatafstoting in populaties met een brede genetische diversiteit (bijv. VS).

Dit aangepaste herprogrammeringsprotocol voor het genereren van TIRN-competente XF/FF hiPSC-lijnen is een eerste stap voor de ontwikkeling van toekomstige cGMP-conforme UTIRN-SC-banken. Dit protocol schetst stapsgewijze stroma-geprimed herprogrammering en functionele validatie van menselijke CB-myeloïde voorlopercellen in conventionele XF-hiPSC-lijnen. Deze XF-hiPSC vertoonden een gemakkelijke reversie naar TIRN-SC, met een efficiëntie die vergelijkbaar is met die van niet-XF-methoden7 en bereikten onbeperkte functionele pluripotentie, inclusief verbeterd vermogen om goed gevormde afstammingsbias-gereduceerde teratomen te produceren (ten opzichte van isogeen geprimed XF-hiPSC)4,5,9. We schetsen ook protocollen die TIRN-teruggedraaide XF-hiPSC valideren voor hun verbeterde en robuuste directe differentiatie naar hematovasculaire lijnen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle herprogrammeringsexperimenten voldeden aan de richtlijnen die zijn gepubliceerd door de National Academy of Sciences en de International Society of Stem Cell Research (ISSCR). Voor het genereren van hiPSC werden protocollen voor het verzamelen van donorcellen en door de donor geïnformeerde toestemming goedgekeurd door het toezicht van de Institutional Review Board (IRB) van de Johns Hopkins University (JHU). Alle experimenten werden uitgevoerd onder toezicht van het JHU Institutional Stem Cell Research Oversight (ISCRO) en voldoen aan de institutionele normen met betrekking tot geïnformeerde toestemming en herkomstevaluatie. Bovendien werden alle diergebruik en chirurgische ingrepen uitgevoerd in overeenstemming met protocollen die zijn goedgekeurd door het JHU Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle experimenten met dierproeven (bijv. subcutane/intramusculaire injecties van NOD. Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) muizen (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) voor teratoomanalyse en blastocystoverdracht naar ICR pseudozwangere muizen) werden beoordeeld en goedgekeurd door de JHU IACUC. Deze beoordelingen omvatten overwegingen voor ethische opoffering, humane huisvesting en passende maatregelen om ongemak bij dieren tot een minimum te beperken.

1. Feeder-vrije xenovrije hiPSC episomale herprogrammering

  1. Preparatie van hematopoëtische voorlopercellen van de donor
    1. Gebruik gecryopreserveerde CD34+ hematopoëtische stam-/voorlopercellen (bijv. 1x106 neonatale CB-cellen) onmiddellijk na levering of bewaar cryovials in een opslagtank voor vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat de cellen tijdens het transport en de behandeling continu in bevroren toestand zijn gehouden.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen niet-gecryopreserveerde donorcellen ook onmiddellijk na verzameling en CD34-verrijking worden gebruikt met behulp van goedgekeurde protocollen.
    2. Voordat de cellen in het waterbad worden ontdooid, opent u de gesteriliseerde cryovial voorzichtig in een bioveiligheidskast om eventueel ingesloten gas in de injectieflacon te laten ontsnappen en sluit u de injectieflacon vervolgens goed af.
    3. Plaats de injectieflacon gedurende 1 tot 2 minuten in een waterbad van 37 °C. Draai de injectieflacon voorzichtig rond tot er bijna geen ijs meer over is. Haal de injectieflacon uit het waterbad en steriliseer deze grondig (d.w.z. 70% ethanolspray).
      OPMERKING: Alle stappen vereisen de juiste aseptische techniek en worden uitgevoerd in een steriele biologische veiligheidskapkast.
    4. Breng de cellen voorzichtig en langzaam over in een lege steriele conische buis van 50 ml. Was de injectieflacon met 1 ml koud xenovrij hematopoëtisch voorloper (XF-HP) expansiemedium (tabel 1) en combineer voorzichtig (druppelsgewijs langs de randen van de buis) met de cellen om de DMSO-cryoprotectant te verdunnen.
    5. Laat de buis 30 s rechtop in een rek staan en voeg langzaam (druppelsgewijs) 2 ml koud XF-HP medium toe. Draai de celsuspensie voorzichtig rond terwijl u het medium toevoegt. Herhaal deze stap twee keer door achtereenvolgens 4, 8 en 4 ml koud XF-HP-medium toe te voegen (tot 20 ml totaal volume). Centrifugeer de verdunde cellen bij 100 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      OPMERKING: Pipetteer de cellen niet op en neer in de cryoprotectieve oplossing en tijdens de verdunningsstappen. Voeg XP-HP medium druppelsgewijs en langzaam toe totdat de DMSO ten minste 10-voudig is verdund. Gebruik een koud medium, aangezien DMSO-verdunning resulteert in een exotherme reactie.
    6. Zuig celvrij supernatans aan in een bioveiligheidskast. Maak de celkorrel voorzichtig los. Resuspendeer in 2 ml XF-HP expansiemedium voor celtelling met behulp van een hemocytometer of een automatische celteller.
    7. Breng de ontdooide cellen over op platen met meerdere putjes van celcultuur met ultralage hechting (breng bijv. 2 ml cel/XF-HP-mediummengsel over in 1 putje van een plaat met 6 putjes).
    8. Wikkel het bord stevig in Saran-folie om hypoxische omstandigheden na te bootsen. Breng de plaat over in een broedmachine (37 °C , 5% CO2 , vochtige atmosfeer). U kunt de onverpakte plaat ook in een broedstoof met O2-regeling plaatsen (5% Ø2, 5% CO2, vochtige atmosfeer).
    9. Kweek de hematopoëtische voorlopercellen gedurende 3 dagen in XF-HP medium.
  2. Preparaat van mesenchymale stamvoorlopercellen (MSC)
    1. Ontdooi een aliquoot (0,75 - 1x106 cellen) van menselijke MSC met lage doorgang (p2 tot p3) door een ingevroren aliquot gedurende 1 tot 2 minuten in een waterbad van 37 °C te incuberen. Draai de injectieflacon voorzichtig rond tot er bijna geen ijs meer over is. Haal de injectieflacon uit het waterbad en steriliseer grondig (d.w.z. 70% ethanol).
      OPMERKING: Menselijke MSC met lage doorgang (p2) kan worden gekocht of bereid uit menselijk beenmerg met behulp van vastgestelde protocollen en gecryopreserveerd. MSC kan ongeveer 7-10 dagen van tevoren worden ontdooid en de dag voorafgaand aan de nucleofectie worden bestraald/geplateerd als een feederlaag (Figuur 1).
    2. Breng de cellen voorzichtig en langzaam (druppelsgewijs langs de randen van de buis) over in een conische buis van 15 ml met koud xenovrij serumvrij mesenchymaal stamcelmedium (XF-MSC) (tabel 1) in een bioveiligheidskast om het DMSO-cryoprotectant ten minste 10-voudig te verdunnen (bijv. Breng 1 ml gecryopreserveerd celaliquot over in 9 ml xF-MSC-medium).
    3. Gebruik 1 of 2 ml koud XF-MSC-medium om de tube te spoelen en meng in de conische tube. Centrifugeer de verdunde cellen bij 100 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. Zuig celvrij supernatans aan in een bioveiligheidskast. Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 1 ml XF-MSC-medium voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische celteller.
    5. Breng de ontdooide cellen over op met weefsel behandelde celkweekplaten met meerdere putjes (bijv. 5.000-6.000 cellen percm2 of ongeveer 50.000 cellen in 1 putje van een plaat met 6 putjes). Plaats de platen in een broedstoof (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer). Ververs het XF-MSC-medium elke 2-3 dagen in een bioveiligheidskast.
    6. Zuig de dag voorafgaand aan de nucleofectie celvrij supernatans op in een bioveiligheidskast. Was MSC eenmaal met PBS (2 ml/putje). Aspireren PBS. Voeg 1 ml/putje celdissociatiereagens toe (bijv. 1X trypsine-EDTA-oplossing). Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C in een CO2 -incubator.
    7. Neutraliseer het dissociatiereagens door 1 ml XF-MSC-medium toe te voegen (ten minste 2-voudige verdunning) en trituleer voorzichtig met een pipet in een eencellige suspensie. Vang de celsuspensie op in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 100 x g gedurende 5 min.
    8. Aspiratie van het bovenlevende. Resuspendeer de celpellet in 1 ml XF-MSC-medium voor celtelling met behulp van een hemocytometer of een automatische celteller.
    9. Bestraal (2.000 rad) mesenchymale voorlopercellen onder 5 passages met behulp van een g- of röntgenstraler en plaat op Arg-Gly-Asp (RGD) peptide-gecoat synthetisch oppervlak 6-putjes platen (2x105 cellen per putje) in XF-MSC-medium. Bewaar de platen een nacht in een broedstoof (37 °C, 5% CO2, vochtige atmosfeer).
  3. Xenofree episomale herprogrammering
    1. Verzamel 3 dagen oude CB HP-culturen in XF-HP expansiemiddel in een conische buis van 15 ml in een bioveiligheidskast. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
    2. Zuig celvrij supernatans aan in een bioveiligheidskast.  Resuspendeer de celpellet voorzichtig in 1 ml XF-HP expansiemedium voor celtelling met behulp van een hemocytometer of een automatische celteller.
    3. Combineer 1x106 geëxpandeerde HP-cellen met 100 μL menselijke CD34+ celnucleofectieoplossing (menselijke CD34+ celnucleofector kit). Voeg 6 μg gezuiverd geconcentreerd episoom (<5 μL) toe en breng voorzichtig over in een nucleofectorcuvet met behulp van de plastic transferpipet van de nucleofectiekit. Vermijd bubbels. Plaats de cuvet in het nucleofectorapparaat en gebruik programma U-008.
      OPMERKING: Bereid voorraden van de episomale EBNA-gebaseerde pCEP4-vector pEP4 EO2S EM2K (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) voor door routinematige transformatie in TOP10 E. coli en zuiver met behulp van plasmide Maxi-prep-kits. Op de dag van nucleofectie moet het plasmide worden opgeruimd en geconcentreerd met behulp van een PCR-zuiveringskit 7.
    4. Voeg onmiddellijk na de nucleofectie 500 μL voorverwarmd XF-HP expansiemedium toe aan de cuvet en breng de cellen in 1 ml XF-HP medium over op 1 putje met ultra-lage hechting celcultuur 6-well plaat met behulp van een steriele transferpipet.
      OPMERKING: Nucleofecte cellen zijn zeer kwetsbaar en zullen de schuifspanning van gewone pipetpunten van 1 ml niet overleven. Overplaatsing op kweekplaten met ultralage hechting is een stap die het herstel van cellen na nucleofectie bevordert voordat de definitieve hechting op RGD-gecoate platen wordt uitgevoerd.
    5. Wikkel de plaat stevig in plasticfolie om hypoxische omstandigheden na te bootsen. Plaats de plaat in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer). U kunt de onverpakte plaat ook in een broedstoof met O2-regeling plaatsen (5% Ø2, 5% CO2, vochtige atmosfeer). Incubeer gedurende 4 tot 6 uur.
      OPMERKING: Met deze stap kunnen nucleofecte HP-cellen herstellen voordat ze worden overgebracht naar MSC-monolagen.
    6. Verzamel de cellen in een conische buis van 15 ml in een bioveiligheidskast. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
    7. Zuig het bovenstaande op in een bioveiligheidskast. Resuspendeer de celpellet in 1 ml XF-HP expansiemedium. Plaat nucleofecte HP-cellen op bestraald MSC met een dichtheid van ongeveer 17.500 cellen per cm, 2 in RGD-gecoate platen in XF-HP-expansiemedium (2 ml/putje) aangevuld met ROCK-remmer Y-27632 (eindconcentratie 10 μM). Plaats de plaat in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer).
    8. Voeg twee dagen na nucleofectie 2 ml (gelijk volume) E8-medium toe aan elk putje in een bioveiligheidskast.
    9. Vervang om de dag de helft van het volume kweekmedium door E8-medium. Verzamel drijvende cellen in een conische buis van 15 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten op 200 x g en voeg de herstelde cellen weer toe aan de cultuur.
    10. Bereid op dag 21 met vitronectine beklede weefselkweekbehandelde platen met 6 putjes voor. Voeg 1 ml verdunde vitronectineoplossing (bijv. 40 ml/ml voor vitronectine-XF) toe aan 1 putje van een plaat met 6 putjes en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    11. Pluk handmatig individuele XF-hiPSC-kolonies met behulp van een omgekeerde microscoop in een bioveiligheidskast. Triturateer met pipet en breng enkele kolonies over op met vitronectine beklede platen in E8-medium aangevuld met ROCK-remmer Y-27632 (eindconcentratie 5 μM). Plaats de plaat in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer).
    12. Vervang het medium de volgende dag voorzichtig door E8-medium zonder suppletie met ROCK-remmers. Vervang het E8-medium daarna elke dag (2 ml/putje) in een bioveiligheidskast.

2. Routinematige hiPSC-cultuur en -onderhoud

  1. Wanneer de kolonies 5 tot 6 dagen later groter worden (d.w.z. 0,5 tot 1 mm diameter of ongeveer 80% samenvloeiing), zuig het medium dan op in een bioveiligheidskast.
  2. Voeg 2 ml/welltje PBS toe om de cellen te wassen. Aspireer de PBS. Voeg 1 ml celdissociatieoplossing op basis van EDTA toe. Incubeer gedurende 5 minuten in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer). Controleer met een microscoop of de cellen losjes vastzitten (bijv. glanzende ronde cellen, maar nog steeds aan de plaat vastzitten).
  3. Zuig de dissociatieoplossing voorzichtig op in een bioveiligheidskast zonder de cellen te verstoren.
  4. Verzamel de cellen in 1-2 ml E8-medium aangevuld met ROCK-remmer Y-27632 (eindconcentratie 5 μM) met niet-krachtig pipetteren om celklonters te behouden. Breng de celklonters over op met vitronectine beklede (zie paragraaf 1.3.11) met 6 putjes behandelde celkweekplaten (equivalent van 10 kolonies per putje of een splitsing van 1:10). Plaats de plaat in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer).
  5. Ga door met subkweken met behulp van een op EDTA gebaseerde celdissociatieoplossing om de 5-7 dagen.
    OPMERKING: Aanvullend subklonen of handmatig kolonieplukken is meestal niet vereist voor SP-CB-hiPSC-herprogrammering, maar als hiPSC-klonen kolonies bevatten met een abnormale morfologie (bijv. spontane differentiatie zoals fibroblasten of embryoïde lichaamsvorming, opkomst van abnormale niet-platte kolonies), selecteer dan handmatig kolonies met behulp van een micropipet en een microscoop in een bioveiligheidskast of gooi afwijkende klonen weg. Niet-efficiënte, niet-stabiele herprogrammering van hiPSC is niet compatibel met TIRN-SC-omkering.

3. Fenotypische validatie van XF-hiPSC-klonen

  1. Breid XF-hiPSC-klonen uit voor ten minste 5-7 passages voor initiële validatie (Figuur 2) zoals beschreven in sectie 2, voorafgaand aan cryopreservatie op lange termijn en toepassing in functionele studies. Noteer het aantal passages op elke gecryopreserveerde injectieflacon.
    OPMERKING: Initiële karakterisering van XF-hiPSC-klonen met lage passage kan worden bevestigd door meerdere assays zoals akalinefosfatase-activiteit en TRA-1-antigeen- of NANOG-immunodetectie.
  2. Voer XF-hiPSC-validatie en -telling uit met alkalische fosfatasekleuring (Figuur 2A,B).
    OPMERKING: Het herprogrammeren van de efficiëntie in bulkculturen kan 3-5 weken na episomale nucleofecties op P0 worden bepaald door het aantal volledig geherprogrammeerde kolonies op te sommen per enkele invoercellen die op dag 3 7,13 zijn geplateerd.
    1. Zuig kweekmedium aan in een bioveiligheidskast.
    2. Was cellen met PBS (2 ml per putje). Aspireren PBS. Fixeer cellen door 2% paraformaldehyde/PBS-oplossing toe te voegen. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    3. Verwijder en gooi paraformaldehyde/PBS-oplossing weg volgens de veiligheidsrichtlijnen voor chemisch afval.
    4. Was cellen met PBS (2 ml per putje). Aspireren PBS. Voeg 1-2 ml alkalisch fosfatasesubstraat toe en incubeer gedurende 10 tot 15 minuten bij kamertemperatuur met langzaam roeren.
    5. Was 3 keer met PBS om de reactie te stoppen. Microfoto en opsomming.
      OPMERKING: Vermijd een te lange incubatietijd of temperatuur, omdat dit kan leiden tot vals-positieve kleuring.
  3. Voer XF-hiPSC-kleuringsvalidatie en -telling uit met TRA-1-antigeenimmunokleuringen (Figuur 2C).
    OPMERKING: Voor episomale herprogrammering moet de detectie van transgene expressie en EBNA1-vectorruggengraat tijdens de eerste passages worden uitgevoerd met behulp van gepubliceerde protocollen7. Routinematige validatie omvat karyotypering door middel van G-banding (Figuur 2D) of dekkingstesten op basis van de hele genoomarray. Basis functionele pluripotentie kan ook worden getest met behulp van teratoomdifferentiatieprotocollen (Figuur 2E) of kwantitatieve multi-genexpressie scorekaarten van niet-gerichte embryoïde lichaamsdifferentiaties14.
    1. In een bioveiligheidskast repliceren immunokleuringsputjes voor TRA-1-60- of TRA-1-81-antigenen gedurende 30 minuten door fluorchroom-geconjugeerde live-stain-antilichamen toe te voegen aan E8-medium in de juiste concentratie.
    2. Aspireer het cultuurmedium. Was twee keer met E8 medium (2 ml per putje).
    3. Microfoto en opsomming in E8-medium of fenolroodvrij medium.
      OPMERKING: U kunt cellen ook fixeren met 2% paraformaldehyde/PBS-oplossing gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en immunokleuring voor TRA-1-antigenen met behulp van standaard antilichamen.
  4. Valideer XF-hiPSC-immunofenotype door middel van flowcytometrie.
    1. Zuig in een bioveiligheidskast het kweekmedium aan.
    2. Was cellen in PBS (2 ml per putje). Aspireren PBS. Voeg enzymatisch dissociatiereagens toe (bijv. Accutase, 1 ml per putje). Incubeer de plaat gedurende 5 minuten bij 37 °C in een CO2 -incubator (5 % CO2 , vochtige atmosfeer).
    3. Verzamel cellen door een gelijk volume kweekmedium toe te voegen en passeer ze door een celzeef (40-70 μm filter). Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 min.
    4. Resuspendeer de celpellet in PBS met 5% FBS (1 ml per put-equivalent). Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cellenteller. Verdeel ongeveer 100.000-200.000 cellen in buizen met ronde bodem volgens FACS-test (houd het volume op ongeveer 100 μL per test).
    5. Voor extracellulaire kleuringen, na een optionele blokkeringsstap met puur muizenserum (voeg 5 μL per test toe, 5 minuten bij kamertemperatuur), incubeer met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen (bijv. TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) volgens de instructies van de fabrikant. Wassen met 3 ml PBS. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 300 x g. Resuspendeer in FACS-buffer (bijv. PBS met 5% FBS) en verkrijg met behulp van een FACS-instrument.
      OPMERKING: gebruik altijd de juiste isotypecontroles en kleuring parallelle monsters om de specificiteit van de immunogedetecteerde eiwitten te valideren.
    6. Volg voor intracellulaire kleuringen (bijv. NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE) de instructies van de fabrikant voor fixatie-/permeabilisatiestappen. Incubeer met fluorchroom-geconjugeerde antilichamen of overeenkomende isotypecontroles. Verwerven met behulp van een FACS-instrument.

4. Cryopreservatie en ontdooien van XF-hiPSC-klonen

  1. Breid XF-hiPSC-klonen uit voor ten minste 5-7 passages om de eerste validatie uit te voeren (Figuur 2) vóór cryopreservatie op lange termijn en toepassing in functionele studies. Noteer het aantal passages op elke gecryopreserveerde injectieflacon.
    1. Zuig kweekmedium aan in een bioveiligheidskast.
    2. Was cellen met PBS (2 ml per putje). Aspireren PBS.  Voeg op EDTA gebaseerde celloslatingsoplossing toe (1 ml per putje) om XF-hiPSC-kolonies te dissociëren tot celklonten. Incubeer de plaat gedurende 5 minuten in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2, vochtige atmosfeer). Controleer met een microscoop of de cellen losjes zijn bevestigd (bijv. glanzende ronde cellen).
    3. Zuig de dissociatieoplossing voorzichtig op zonder de monolaagkolonies van de cellen te verstoren en verzamel de cellen in 1-2 ml E8-medium met niet-krachtig pipetteren om celklonters te behouden (10-50 cellen per klomp). Verzamel XF-hiPSC in een steriele conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 min.
    4. Zuig het bovenstaande op in een bioveiligheidskast. Resuspendeer de celpellet in een vriesoplossing (Tabel 2, ~ 1 putje equivalent per ml).
    5. Breng cellen over in cryogene buizen voor langdurige opslag. Plaats de buizen in een langzaam invriezende container en laat de monsters een nacht invriezen in een vriezer van -80 °C. Plaats de cryovials de volgende dag in een vriezer met vloeibare stikstof voor langdurige opslag.
  2. Voor het ontdooien wordt een plaat voorbereid door deze voor te lakken met vitronectine (zie punt 1.3.11).
    1. Plaats de bevroren injectieflacon in een waterbad van 37 °C en ontdooi de cellen gedurende ~1-2 min. Steriliseer (d.w.z. ethanolspray).
    2. Breng XF-hiPSC langzaam over in een steriele conische buis van 15 ml die 9 ml ontdooimedium bevat (tabel 2) om de cellen langzaam 10-voudig te verdunnen in een steriele biologische kapkast.
      OPMERKING: Niet krachtig pipetteren.
    3. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
    4. Zuig het celvrije supernatans op in een bioveiligheidskast. Resuspendeer de celpellet in E8-medium (1-2 ml) aangevuld met ROCK-remmer (eindconcentratie 5 mM).
      Opmerking: Uitsluiting van Y-27632 zal resulteren in een slechte efficiëntie van het herstel na ontdooiing.
    5. Breng de ontdooide cellen over op 1 of 2 met vitronectine beklede putjes van een plaat met 6 putjes. Vervang het medium de volgende dag door een gewoon E8-medium zonder ROCK-remmer voor celexpansie.

5. Xenovrije hematovasculaire differentiatie van XF-hiPSC

  1. Differentieer XF-hiPSC met behulp van ons geoptimaliseerde xenovrije hematovasculaire differentiatieprotocol (Figuur 3)4.
    OPMERKING: Dit protocol is gewijzigd ten opzichte van15.
    1. Bereid XF-hiPSC voor bij ~40-50 % samenvloeiing (1-3 dagen na het passeren).
    2. Zuig het kweekmedium op en voeg 2 ml mesodermale bepalingsmedium (tabel 2) toe in een bioveiligheidskast.
    3. Zuig na 2 dagen het medium op en voeg 2 ml/putje vasculair differentiatiemedium (Tabel 2) toe in een bioveiligheidskast. Als er bij deze stap veel dode of zwevende cellen zichtbaar zijn, was dan eenmaal met 2 ml PBS.
    4. Vervang het vasculaire differentiatiemedium om de dag in een bioveiligheidskast tot dag 11.
      OPMERKING: Als het medium geel wordt vanwege de hoge celdichtheid en de lage pH, voeg dan elke dag 1 ml vers medium toe of vervang het.
  2. Na 7-10 dagen kweek in vasculair differentiatiemedium, zuivert CD31+ of CD34+ vaatcellen van de aanhangende monolaag met een magnetische parelcelsorteermethode.
    OPMERKING: Elke individuele kloon kan een verschillende differentiatiekinetiek vertonen. Bepaal het piektijdstip voor CD31/CD34-expressie door middel van FACS-analyse (Figuur 4A). Pre- en post-magnetische kralenverrijking FACS-analyse is vereist. Hematopoëtische voorlopercellen (HP) kunnen in dit stadium uit het bovenstaande worden teruggewonnen en verrijkt met CD34-microbeads. CD34+ XF-hiPSC-afgeleide HP kan verder worden gevalideerd met behulp van methylcelluloseassay (Figuur 4B-C)16.
    1. Zuig in een bioveiligheidskast kweekmedium op en was de cellen in PBS (2 ml per putje). Aspireer PBS en dissocieer hiPSC-kolonies in afzonderlijke cellen door enzymatisch dissociatiereagens toe te voegen (bijv. Accutase, 1 ml per putje). Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% CO2 , vochtige atmosfeer).
    2. Verzamel cellen in een bioveiligheidskast door een gelijk volume kweekmedium toe te voegen. Centrifugeer de cellen op 200 x g gedurende 5 min.
    3. Resuspendeer de celpellet in het vasculaire differentiatiemedium (tabel 2). Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cellenteller. Zet ongeveer 50.000-100.000 cellen opzij voor pre-magnetische parelverrijking FACS-test met behulp van direct geconjugeerd anti-CD31- of anti-CD34-antilichaam.
    4. Centrifugeer de overige cellen op 300 x g gedurende 5 min. Resuspendeer de celpellet in magnetische kralenverrijkingsbuffer (PBS pH 7,2, 0,5% runderserumalbumine (BSA) en 2 mM EDTA) in een bioveiligheidskast.
    5. Haal de cellen door een celzeef (40-70 μm filter). Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Resuspendeer in een magnetische korrelverrijkingsbuffer van 60 μL.
    6. Voeg 20 μL FcR-blokkerend reagens toe, voeg vervolgens 20 μL CD31- of CD34-microbeads toe en incubeer gedurende 15-20 minuten bij 4 °C.
    7. Was cellen met 2 ml magnetische kralenverrijkingsbuffer in een bioveiligheidskast en centrifuge (300 x g, 5 min).
    8. Resuspendeer de celpellet in een bioveiligheidskast van 1 ml magnetische parelverrijkingsbuffer.
    9. Plaats een LS-kolom in het magnetische veld van een magnetische celscheider in de bioveiligheidskast. Waskolom met 3 ml magnetische kralenverrijkingsbuffer.
    10. Cellen toepassen op de kolom.  Verzamel niet-gelabelde cellen in een conische buis van 15 ml. Was de kolom 3 keer met 3 ml magnetische kralenverrijkingsbuffer.
    11. Verwijder de kolom van de separator en plaats deze op een nieuwe conische buis van 15 ml.
    12. Spoel de magnetisch gelabelde cellen weg door 3-5 ml endotheelgroeimedium toe te voegen. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
    13. Resuspendeer in 1 ml endotheelgroeimedium in een bioveiligheidskast. Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische cellenteller. Reserveer ongeveer 50.000 cellen voor postmagnetische parelverrijking van de sorteerzuiverheid door FACS-analyse met behulp van direct geconjugeerd anti-CD31- of anti-CD34-antilichaam.
    14. Geïsoleerde VP kan verder worden uitgebreid op met fibronectine gecoate (10 μg/ml) met weefselkweek behandelde platen van kolven in endotheelgroeimedium.

6. Experimentele ontwerprichtlijnen voor functionele validatie van XF-hiPSC

  1. Voorraden gevalideerde XF-hiPSC aanleggen in de vroegste passages met behulp van een gevestigde niet-integrerende methode, zoals herprogrammering van episomaal 7,17, Sendai-virus18 of mRNA19.
    OPMERKING: Een vergelijking van de efficiëntie en betrouwbaarheid van niet-herprogrammeringsmethoden wordt elders gegeven6. De klaring van transgeen materiaal in herprogrammeringsmethoden voor episomale of Sendai-virussen kan tijdens de eerste passages worden geverifieerd met behulp van PCR-methoden 7,20. Transgenretentie is niet compatibel met TIRN-SC-generatie.
  2. Valideer het normale karyotype in XF-hiPSC-klonen door middel van G-banding of dekkingstesten op basis van het hele genoom9.
  3. Valideer genexpressie en epigenomische integriteit van XF-hiPSC-lijnen (d.w.z. ouderlijke afdrukken, X-activering) met behulp van DNA-methylering en genexpressie-arrays of sequencingmethoden 5,11,14.
  4. Valideer de basis functionele pluripotentie met behulp van teratoomdifferentiatieprotocollen (Figuur 2E), kwantitatieve embryoïde lichaam (EB) differentiatietesten met behulp van RT-PCR-arrays14, of gerichte differentiatietesten naar de 3 kiemlagen9.
    OPMERKING: Kwantitatieve methoden voor multi-lineage differentiatiecapaciteit en intra-lineage proliferatieve index van teratoomassays met behulp van histologische karakterisering door microscopie worden elders gegeven4. Protocollen voor gerichte differentiatie naar mesodermale lijnen en hematovasculaire specificatie (Figuur 4A-C) waren eerder gedetailleerd 4,5,9, evenals gerichte differentiatietest naar definitief endoderm (Figuur 4D)5. Voorbeelden van gerichte differentiatietest in de richting van ectoderm worden elders gegeven 4,5.

7. Chemische TIRN-aanpassing van XF-hiPSC

  1. Koop of bereid in-house MEF-feeders met lage doorgang van CF1 of CF1 x DR4 hybride E13.5 muisembryo's volgens gepubliceerde protocollen 9,21. Plaat 200.000 MEF-feeders per putje in een met gelatine (0,1% gelatine in water, 1 ml per putje) weefselkweekbehandelde plaat met 6 putjes ten minste één dag vóór de TIRN-aanpassingsstap (gedetailleerde TIRN-protocollen worden elders gegeven 4,5,9).
  2. Behoud en breid transgenvrije XF-hiPSC-culturen uit met gevalideerde normale karyotypes in een feedervrij kweeksysteem (bijv. E8-medium, zie tabel 1 voor interne formulering).
  3. Vervang E8 medium door LIF-5i medium (2 ml per putje; Tabel 1) nadat XF-hiPSC-culturen ~50% confluentie hebben bereikt (d.w.z. 3-5 dagen na de eerste uitplating) in een bioveiligheidskast.
  4. Zuig de volgende dag het kweekmedium op en was de aan LIF-5i aangepaste XF-hiPSC eenmaal met PBS (2 ml per putje) in een bioveiligheidskast. Zuig het bovenstaande op en voeg aan elk putje 1 ml enzymatische celdissociatiereagens toe. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C in een CO2 -incubator.
  5. Trituleer voorzichtig met een pipet in een eencellige suspensie in een bioveiligheidskast. Neutraliseer met LIF-5i medium (1 ml per putje). Vang de celsuspensie op in een steriele conische buis van 15 ml.  Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
  6. Zuig het bovenstaande op in een bioveiligheidskast. Resuspendeer de celpellet in 2 ml LIF-5i-medium.
    OPMERKING: Neem indien mogelijk een aliquot voor het tellen van cellen. Het is mogelijk om enzymatische activiteit te neutraliseren met LIF-5i/LIF-3i medium zonder suppletie met remmers of groeifactoren.
  7. Was de MEF-plaat twee keer met PBS (2 ml per putje in platen met 6 putjes) en voeg cellen toe (1 put-equivalent van LIF-5i aangepaste cellen op 1 putje MEF-feeders in 2 ml LIF-5i-medium).
    OPMERKING: Optimalisatie van de initiële beplatingsdichtheden voor elke afzonderlijke XF-hiPSC-lijn is optioneel. Als de cellen in de vorige stap zijn geteld, plaats dan minimaal 1x106 cellen per putje op de feeders.  Breng de plaat over in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2 , vochtige atmosfeer).
  8. Kweek en onderhoud XF-hiPSC gedurende 3-5 dagen in LIF-5i op MEF in een CO2 -incubator (37 °C, 5% CO2, vochtige atmosfeer). Vervang het LIF-5i-medium dagelijks.
  9. Wanneer koepelvormige TIRN-SC-kolonies worden gevormd (na 3-5 dagen kweek op feeders), aspireert u het kweekmedium op in een bioveiligheidskast. Was elk goed met 2 ml PBS.
  10. Aspireren PBS. Voeg 1 ml celloslatingsoplossing (bijv. Accutase) toe aan elk putje. Incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C in een CO2 -incubator (5% CO2 , vochtige atmosfeer).
  11. Voeg 1 ml LIF-3i-medium (tabel 1) toe aan elk putje in een bioveiligheidskast om het dissociatiereagens te neutraliseren. Tricureer voorzichtig en verzamel cellen in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer op 200 x g gedurende 5 min.
  12. Zuig het bovenstaande op in een bioveiligheidskast. Resuspendeer in LIF-3i-medium (1 ml per putje) voor het tellen van cellen met behulp van een hemocytometer of een automatische celteller. Plaat ~5 x 105 cellen in 2 ml LIF-3i-medium per putje op bestraald MEF in gegelatineerde platen met 6 putjes in een bioveiligheidskast.
    OPMERKING: herhaal stap 7.12 5o 7.16 voor alle volgende passages.  Na de initiële LIF-5i-aangepaste cultuur, plaat LIF-3i-culturen met een lagere dichtheid (2x105 cellen/putje) en passage elke 3-4 dagen.
  13. Passage TIRN-teruggedraaide XF-hiPSC voor ten minste 6-7 continue passages in LIF-3i-medium voorafgaand aan gebruik in functionele studies of cryopreservatie. Noteer het aantal passages in xenovrij geprimed kweekmedium (bijv. E8) of LIF-5i/LIF-3i TIRN-media.
    OPMERKING: TIRN-omkering van high-passage (bijv. >p40) XF-hiPSC-lijnen is inefficiënt en wordt niet aanbevolen. Lijnen met een hoge passage bevatten vaak chromosomale of subchromosomale defecten, die niet compatibel zijn met efficiënte TIRN-reversie, en zullen resulteren in slechte reversie-efficiëntie en beperkte kweekstabiliteit. Ook wordt het gebruik van TIRN-culturen die meer dan 15 passages in LIF-3i-medium hebben ondergaan, niet aanbevolen voor functionele studies. De functionele impact van TIRN-omkering van XF-hiPSC is het meest prominent tussen 7 en 15 passages in het LIF-3i-medium.

8. Experimentele ontwerprichtlijnen voor gerichte differentiatie van XF/FF hiPSC-afgeleide TIRN-SC.

  1. Gebruik XF/FF hiPSC-afgeleide TIRN-SC direct in gevestigde gerichte differentiatieprotocollen zonder enige "re-priming"-stap (d.w.z. geen vereiste om TIRN-stamcellen terug te schakelen naar conventionele "geprime" omstandigheden voorafgaand aan hun gebruik in gerichte differentiatietesten).
  2. Voor functionele evaluatie van de TIRN-impact op XF-hiPSC, stelt u isogene culturen van broers en zussen op, met een equivalent passagenummer parallel. Behoud geprime/TIRN broer of zus isogene XF-hiPSC-culturen parallel in hun respectievelijke media (bijv. E8 op vitronectine vs. LIF-3i op MEF), en tegelijkertijd een teratoomtest uitvoeren (Figuur 5), of differentiëren met behulp van identieke embryoïde lichaam- of gerichte differentiatieprotocollen en materialen (Figuur 6).
  3. Voer indien mogelijk functionele evaluatie uit van terminale gedifferentieerde afstammingslijnen. Vasculaire voorlopercellen kunnen bijvoorbeeld worden geëvalueerd door middel van eiwitexpressie, DiI-geconjugeerde geacetyleerde lipoproteïne met lage dichtheid (LDL) opnametest en Matrigel-buistest (Figuur 7).
    OPMERKING: Aanvullende functionele testen voor CB-hiPSC- en TIRN-SC-afgeleide VP (d.w.z. DiI-Ac-LDL-opname/senescentie/proliferatie/migratietesten, in vitro Matrigel-buistesten, Matrigel-plugassays bij dieren, xenotransplantatietests) worden elders beschreven 3,4.
  4. Pas de initiële platingdichtheden en kinetiek aan en optimaliseer deze (Figuur 6) voor elke individuele XF-hiPSC-kloon in elke differentiatietest.
    OPMERKING: TIRN-gereverteerde XF-hiPSC hebben een robuustere proliferatieve en differentiatiecapaciteit in gerichte differentiatietesten dan geprimede XF-hiPSC.TIRN-culturen vereisen doorgaans een lagere initiële platingdichtheid dan E8-culturen, en vereisen geen het gebruik van anti-apoptotische supplementen om de klonale overleving te verbeteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol optimaliseert gepubliceerde methoden voor het efficiënt herprogrammeren van myeloïde voorlopers naar een high-fidelity geprimede pluripotente toestand met behulp van episomale vectoren en stromale signalen7. Het protocol (Figuur 1) schetst gedefinieerde methoden voor XF/FF stromale geprimede episomale herprogrammering van menselijke CB CD34+ -voorlopers in XF-hiPSC, en instrueert hoe hun functionaliteit kan wor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De Zabidis-groep rapporteerde oorspronkelijk een sterk geoptimaliseerde episomale methode met vier factoren voor het herprogrammeren van afstammingsgecommitteerde CB-myeloïde voorlopers in CB-hiPSC met bulkefficiënties tot 50% in gezuiverde cellen die episoomexpressie tot expressie brengen7. Hierin presenteerden we een aangepaste versie van het originele humane CB progenitor episomale herprogrammeringsprotocol in XF/FF stroma-geprimede omstandigheden. Deze methode...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen openbaarmakingen om aan te geven.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de NIH/NEI (R01EY032113; ETZ), Het Maryland Stem Cell Research Fund (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) en The Lisa Dean Moseley Foundation (ETZ).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaAAB-1001
anti-CD143 (BB9) antibody, APC conjugated BD Biosciences557929use 10-20 µL per assay (FACS)
anti-CD144 antibody, PE conjugated BD Biosciences560410use 10-20 µL per assay (FACS)
anti-CD146 antibody, PE conjugated BD Biosciences550315use 10-20 µL per assay (FACS)
anti-CD184/CXCR4 antibody, APC conjugated BD Biosciences555976use 10-20 µL per assay (FACS)
anti-CD31 antibodyBD Biosciences550389dilute 1:100 in blocking solution for immunofluorescent assay
anti-CD31 antibody, APC conjugated eBioscience17-0319-42use 2 µL per assay (FACS)
anti-CD34 antibody, APC conjugated BD Biosciences555824use 5 µL per assay (FACS)
anti-CD45 antibody, PE conjugated BD Biosciences555483use 10-20 µL per assay (FACS)
anti-NANOG antibody, PE conjugatedBD Biosciences560483use 10-20 µL per assay (FACS)
anti-OCT4 antibody, PE conjugatedR&D SystemsIC1759Puse 10 µL per assay (FACS)
anti-SOX17 antibody, Alexa488 conjugated BD Biosciences562205use 5 µL per assay (FACS)
anti-SOX2 antibody, PE conjugatedR&D SystemsIC2018Puse 10 µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 antibody, APC conjugated R&D SystemFAB1435Ause 5 µL per assay (FACS)
anti-SSEA-4 GloLIVE antibody, NL493 conjugatedR&D SystemNLLC1435Guse at 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 A488 conjugate kitThermoFisher ScientificA25618
anti-TRA1-60 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560193use 10 µL per assay (FACS)
anti-TRA-1-60 GloLIVE antibody, NL557 conjugated R&D SystemsNLLC4770Ruse at  a 1:50 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA-1-60 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0068use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
anti-TRA1-81 antibody, PE conjugatedBD Biosciences560161use 10 µL per assay (FACS)
anti-TRA-1-81 StainAlive Antibody, DyLight 488 conjugatedStemgent09-0069use at a 1:100 dilution (live and fixed immunostainings)
CD31 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-091-935
CD34 MicroBead Kit, humanMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Mixed Donors,  Cord blood, 1 million cellsAllCellsCB, CR, CD34+, Mixed, PS, CS10, 1Malternative sources of cells include fetal liver, adult bone marrowand mobilized peripheral blood
CF1 mouseCharles river023
CHIR99021R&D SystemL5283reconstitute at 100 mM in DMSO
Corning Costar tissue culture-treated 6-well platesCorning3506
Corning Synthemax II-SC Substrate, 10 mg VialCorning3535use at 5 μg/cm2 as a replacement for Corning 3978
Corning Synthemax-R 6-well plateCorning3978discontinued and replaced to 3535
Costar 6-well Clear Flat Bottom Ultra-Low Attachment 6-well plateCorning3471
Countess  cell counting chamber slideThermo Fisher ScientificC10228
Countess automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoStore CS10StemCell Technologies100-1061
DII-Ac-LDLThermo Fisher ScientificL3484use at 5-15 µg/mL
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) Thermo Fisher Scientific11995065
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032
DMSO (dimethyl sulfoxide)Sigma AldrichD2650
DR4 mouseThe Jackson Laboratory3208
Essential 8 (E8) mediumStemCell Technologies5940
Fetal bovin serum (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30071.03
FIX & PERM Cell Permeabilization KitThermo Fisher ScientificGAS004
ForskolinStemgent04-0025reconstitute at 100 mM in DMSO
Gelatin (porcine)Sigma AldrichG1890-100Gresuspend in water and sterilize with an autoclave
human CD34+ cell nucleofector kitLonzaVPA-1003
Isotype mouse IgG1 PE conjugatedBD Biosciences554680
Isotype mouse IgG2a PE conjugatedBD Biosciences558595
Isotype rat IgG2b PE conjugatedR&D SystemsIC013P
KnockOut Serum ReplacementThermo Fisher Scientific10828-028
L-Ascorbic acidMillipore SigmaA8960
L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-0

Referenties

  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Ge nduceerde pluripotente stamcellenepisomale herprogrammeringxenovrije methodentankyrase remmerPARP remmerna eve stamcellenmulti lineage differentiatieuniversele donorstamcellen
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen