Deze studie stelt een verfijnd model op voor uitputting van de sensorische zenuw van het hoornvlies met behulp van bupivacaïne, en onthult de impact ervan op de hoornvlieszenuw en bacteriële adhesie. Het model simuleert neuropathische aandoeningen, biedt inzicht in neuro-immuuninteracties bij ooginfecties en biedt toepassingen in studies naar medicijnafgifte, neuroprotectie, immuunmodulatie en genmodificatie.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gerichte uitputting van de sensorische zenuw van het hoornvlies via subconjunctivale injectie: een model voor het onderzoeken van bacteriële adhesie en neuro-immuuninteracties
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Sensorische zenuwen van het hoornvlies spelen een cruciale rol bij het ondersteunen van de integriteit van het oogoppervlak en immuunafweermechanismen. Verlies van deze innervatie is in verband gebracht met een verhoogde kwetsbaarheid voor microbiële invasie, maar de precieze bijdrage van zenuwdepletie aan bacteriële adhesie op het hoornvlies blijft onvoldoende gekarakteriseerd. Hier presenteren we een reproduceerbare en tijdelijk gecontroleerde methode voor selectieve sensorische zenuwsuppressie van het hoornvlies met behulp van bupivacaïne, een langwerkende natriumkanaalblokker. Door subconjunctivale en topische toedieningsroutes te combineren, bereikt deze strategie met dubbele toepassing robuuste, aanhoudende denervatie, waardoor nauwkeurig kan worden onderzocht hoe veranderde sensorische input de gevoeligheid van het hoornvliesepitheel voor bacteriële kolonisatie beïnvloedt.
Met behulp van dit model onderzoeken we hoe sensorische denervatie de microbiële adhesiedynamiek beïnvloedt voor Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis en Pseudomonas aeruginosa, drie klinisch relevante pathogenen met verschillende adhesiemechanismen. Gestandaardiseerde bacteriële inoculatie via de veegblotting-methode in het laboratorium zorgt voor een uniforme afzetting op het hoornvliesoppervlak, gevolgd door een kwantitatieve beoordeling van de hechting van bacteriën. Door bupivacaïne geïnduceerde zenuwdepletie correleert met verminderde dichtheid van de hoornvlieszenuw en verhoogde bacteriële adhesie, wat een functioneel verband bevestigt tussen sensorische depletie en microbiële gevoeligheid.
Door neuropathische aandoeningen zoals diabetische neuropathie en neurotrofische keratitis te simuleren, biedt deze benadering een nieuw kader voor het bestuderen van neuro-immuuninteracties bij ooginfecties. Naast infectiemodellen biedt deze subconjunctivale injectiestrategie een veelzijdig platform voor het onderzoeken van de farmacokinetiek van oculaire geneesmiddelen, neuroprotectieve interventies en immuunmodulatie. Bovendien kan het worden aangepast voor genmodificatiestudies, waaronder subconjunctivale toediening van CRISPR/Cas-constructen of virale vectoren, waardoor de toepassingen ervan in oogheelkundig onderzoek en therapieën worden verbreed.
Inleiding
Sensorische innervatie van het hoornvlies speelt een cruciale rol bij het behoud van de integriteit van het oogoppervlak en de homeostase van het immuunsysteem. Het hoornvlies is een van de meest geïnnerveerde weefsels in het lichaam, voornamelijk gevoed door de oogheelkundige afdeling van de nervus trigeminus1. Deze sensorische zenuwen bemiddelen niet alleen nociceptie en knipperreflexen, maar reguleren ook epitheliale proliferatie, wondgenezing en immuunbewaking 2,3. Elke verstoring van de sensorische innervatie kan daarom de hoornvliesbarrière in gevaar brengen, de micro-omgeving van het oogoppervlak veranderen en de vatbaarheid voor microbiële infecties vergroten.
Sensorische disfunctie van het hoornvlies wordt in verband gebracht met systemische aandoeningen zoals diabetes mellitus en draagt bij aan oculaire pathologieën, waaronder droge ogen, diabetische keratopathie, neurotrofe keratitis en postoperatieve complicaties 3,4,5,6,7,8,9,10 . Sensorische zenuwbeschadiging leidt tot verminderde traanproductie, epitheelverdunning en vertraagde wondgenezing, die allemaal bacteriële kolonisatie vergemakkelijken11,12. Het precieze mechanistische verband tussen uitputting van de sensorische zenuwen en bacteriële adhesie blijft echter onvoldoende begrepen. Hoewel studies een verhoogde bacteriële adhesie hebben aangetoond na denervatie van het hoornvlies, is er een gebrek aan gestandaardiseerde modellen die gecontroleerd onderzoek naar deze relatie mogelijk maken.
Om deze kloof te dichten, hebben we een gericht model ontwikkeld voor de uitputting van de sensorische zenuw van het hoornvlies met behulp van bupivacaïne, een langwerkende natriumkanaalblokker die klinische neuropathie nabootst zonder permanente zenuwbeschadiging te veroorzaken 13,14,15. Deze farmacologische benadering biedt een gecontroleerde en reproduceerbare methode voor het bestuderen van de uitputting van de hoornvlieszenuw en de effecten ervan op het oogoppervlak15. Door dit model te integreren met bacteriële adhesietesten, kunnen we de impact van sensorische zenuwdepletie op microbiële kolonisatie systematisch evalueren, waarbij de belangrijkste aspecten van diabetische keratopathie en neurotrofe keratitis worden nagebootst.
Microbiële adhesie is een kritieke vroege gebeurtenis bij hoornvliesinfecties, beïnvloed door de samenstelling van de traanfilm, de eigenschappen van het epitheeloppervlak en de immuunresponsen van de gastheer. Onder de diverse ziekteverwekkers die in staat zijn om het oogoppervlak te koloniseren, vertegenwoordigen S. aureus, S. epidermidis en P. aeruginosa drie klinisch significante bacteriën met verschillende hechtingsmechanismen. P. aeruginosa, een zeer virulente Gram-negatieve bacterie, maakt gebruik van pili, flagella en uitgescheiden virulentiefactoren om zich snel te hechten aan hoornvliesepitheelcellen en deze binnen te dringen, wat vaak leidt tot ernstige ulceratieve keratitis16,17. Daarentegen maakt S. epidermidis, een Gram-positieve commensale bacterie, voornamelijk gebruik van verstoorde epitheeloppervlakken en traanfilmveranderingen om biofilms tot stand te brengen, wat bijdraagt aan aanhoudende en vaak subklinische infecties18,19. De verschillen in adhesiestrategieën tussen deze soorten benadrukken de noodzaak om te begrijpen hoe uitputting van de hoornvlieszenuw de oculaire micro-omgeving verandert om bacteriële kolonisatie te bevorderen.
Een belangrijke uitdaging bij het bestuderen van bacteriële adhesie is de keuze van een geschikt inoculatiemodel. Het conventionele krasletselmodel, dat vaak wordt gebruikt in infectiestudies, creëert epitheeldefecten om bacteriële hechting te vergemakkelijken. Hoewel deze benadering effectief is bij het simuleren van door trauma veroorzaakte infecties, introduceert deze benadering significante verstorende variabelen, waaronder overmatige weefselbeschadiging en een overdreven ontstekingsreactie, die de vroege stadia van bacteriële kolonisatie in neuropathische hoornvliezen niet nauwkeurig weergeven. Bovendien maakt de variabiliteit in mechanisch letsel het moeilijk om reproduceerbare resultaten te bereiken. Om deze beperkingen te overwinnen, is een meer gecontroleerde en fysiologisch relevante bacteriële inoculatiemethode vereist.
De veegvloeitechniek voor laboratoria biedt een gestandaardiseerde benadering van bacteriële afzetting, waardoor een uniforme bacteriële hechting wordt gegarandeerd zonder de epitheliale barrière te verstoren20. Deze methode bootst nauwgezet de gevoeligheidsscenario's uit de echte wereld na, waarbij bacteriële adhesie optreedt in afwezigheid van openlijk mechanisch trauma, maar onder omstandigheden van veranderde traansamenstelling en epitheliale homeostase. Door de variabiliteit die gepaard gaat met mechanisch letsel te elimineren, biedt de methode voor het wegvegen van laboratoriumdoeken een nauwkeurigere beoordeling van de microbiële adhesiedynamiek in neuropathische hoornvliezen. Bovendien maakt het de gecontroleerde evaluatie mogelijk van de bijdragen van de traanfilm aan bacteriële kolonisatie, wat met name relevant is in gevallen van sensorische disfunctie van het hoornvlies waarbij de traansecretie is verstoord.
Gezien de cruciale rol van sensorische zenuwen van het hoornvlies bij het reguleren van de traanproductie en de epitheliale homeostase, is het essentieel om een reproduceerbaar model op te stellen voor het bestuderen van de gevolgen van uitputting van de sensorische zenuwen op microbiële adhesie. Deze studie heeft tot doel een protocol te verfijnen voor gerichte depletie van de sensorische zenuw corneale zenuw met behulp van bupivacaïne, een langwerkend lokaal anestheticum, om de effecten ervan op de traansecretie en bacteriële adhesie te evalueren. Door gebruik te maken van een combinatie van subconjunctivale en topische bupivacaïnetoepassing, zorgt deze benadering voor gelokaliseerde en aanhoudende sensorische uitputting op een bepaald tijdstip van maximale werkzaamheid. Met behulp van dit model onderzoeken we hoe sensorische denervatie de adhesiedynamiek van S. aureus, S. epidermidis en P. aeruginosa verandert, wat waardevolle inzichten oplevert in de relatie tussen zenuwdepletie, traanfilmveranderingen en microbiële gevoeligheid. Deze bevindingen hebben bredere implicaties voor het begrijpen van infectiegevoeligheid bij neuropathische aandoeningen zoals diabetische keratopathie en neurotrofe keratitis en bieden een basis voor toekomstige studies naar oculaire neuro-immuuninteracties en therapeutische interventies.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de normen die zijn opgesteld door de Association for Research in Vision and Ophthalmology en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het New England College of Optometry en hielden zich aan het PHS-beleid inzake de humane zorg en het gebruik van proefdieren. Zes tot acht weken oude mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J (Wild-Type; stam nr. 000664) muizen werden verkregen van het Jackson Laboratory, en muizen werden gefokt onder normale circadiane ritmes (een licht/donkercyclus van 12 uur) en kregen voedsel en water. Behoud de steriele techniek tijdens alle procedures.
1. Preparaat van dieren voor subconjunctivale injectie
- Induceer anesthesie met 2-3% isofluraan in zuurstof via een gekalibreerde verdamper. Bewaak de anesthesiediepte door te controleren of er geen reflexieve reactie is op een zachte teenknijp.
- Observeer het dier voortdurend op tekenen van ernstig ongemak of angst.
- Als distress wordt waargenomen, induceer dan diepe anesthesie met 5% isofluraan en bevestig dat u niet reageert.
- Voer cervicale dislocatie uit om euthanasie te garanderen.
- Voer anders onmiddellijk enucleatie uit met behulp van een gebogen enucleatietang voor stroomafwaartse analyses.
2. Blokkade van de hoornvlieszenuw met behulp van subconjunctivale injectie
OPMERKING: Implementeer een tweestapsprotocol met subconjunctivale injectie en lokale toepassing van bupivacaïne om gerichte uitputting van de sensorische zenuw van het hoornvlies te bereiken. Voltooi subconjunctivale injecties en topische toepassingen binnen 15 minuten om de blootstelling aan systemische anesthetica te minimaliseren.
- Voorbereiding en incisie van de locatie
- Maak een kleine (~0,5 mm) incisie in het superotemporale limbale gebied met behulp van een naald van 30 G. Vermijd bloedvaten en minimaliseer weefseltrauma. Gebruik de incisie om toegang te krijgen tot de subconjunctivale ruimte voor gecontroleerde medicijnafgifte.
- Injectie van bupivacaïne
- Bereid een 0,5% bupivacaïne hydrochloride-oplossing onder steriele omstandigheden.
- Laad 5 μl van de oplossing in een Hamilton spuit van 10 μl die is uitgerust met een stompe naald van 33 g met kleine naaf (puntstijl 3).
- Injecteer de oplossing in de subconjunctivale ruimte in een hoek van 15-20° om reflux te minimaliseren en een gelijkmatige verdeling te garanderen.
- Observeer de vorming van blebs op de injectieplaats; Laat het 5-10 s aanhouden en verspreid in de subconjunctivale zak totdat het volledig is geabsorbeerd.
- Topische versterking van cornea-desensibilisatie
- Breng onmiddellijk na de subconjunctivale injectie nog eens 5 μL 0,5% bupivacaïne rechtstreeks aan op het centrale hoornvlies.
OPMERKING: Gebruik deze stap om de desensibilisatie van de oppervlaktezenuw te verbeteren en het lokale anesthesie-effect te verlengen.
- Breng onmiddellijk na de subconjunctivale injectie nog eens 5 μL 0,5% bupivacaïne rechtstreeks aan op het centrale hoornvlies.
- Controlegroep
- Dien 5 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe via zowel subconjunctivale injectie als topische toediening op identieke tijdstippen voor controledieren. Stem procedurele stappen en volume af om rekening te houden met injectiegerelateerde effecten.
- Behandeling duur en eindpunt analyse
- Dien gedurende 15 dagen om de dag een bupivacaïnebehandeling toe om aanhoudende uitputting van de sensorische zenuw te bereiken en tegelijkertijd de toxiciteit te minimaliseren.
- Euthanaseer de muizen op dag 15 4 uur na de laatste bupivacaïnebehandeling met 5% isofluraan in zuurstof via een gekalibreerde verdamper, gevolgd door cervicale dislocatie.
- Verzamel onmiddellijk hoornvliezen van de ene groep muizen (zie stap 5.5.) voor het beoordelen van veranderingen in de zenuwdichtheid met behulp van immunohistochemie (zie figuur 1 en sectie 6 van het protocol), en van een andere groep voor analyse van bacteriële adhesie (zie figuur 1 en sectie 5 van het protocol).
3. Dierlijk preparaat voor bacteriële inoculatie
- Dien intraperitoneale ketamine (80-100 mg/kg) en dexmedetomidine (0,25-0,5 mg/kg) toe om muizen te verdoven vier uur na de laatste bupivacaïne-injectie en topische toepassing op dag 15.
- Bevestig diepe anesthesie door de afwezigheid van reflexieve reacties op teenbeknelling te verifiëren.
- Spoel het oogoppervlak 3x af met een pipet met 5 μL steriel PBS om achtergebleven traanvocht en vuil te verwijderen, zodat het hoornvliesoppervlak schoon is voor onderzoek naar bacteriële hechting (zie figuur 1)
- Gebruik in de aangewezen experimentele groep een pluisvrij weefsel uit het laboratorium om het hoornvliesoppervlak op een gestandaardiseerde manier te deppen.
- Vouw het tissuepapier om een stevige grip te garanderen.
- Veeg het hoornvlies van de verdoofde muis voorzichtig 4x schoon, beginnend bij het centrale hoornvlies en met een roterende beweging naar rechts en links om de perifere regio's20 op te nemen.
NOTITIE: Oefen minimale druk uit om mechanisch letsel te voorkomen en verwijder tegelijkertijd effectief traanvocht om bacteriële hechting te vergemakkelijken.
4. Bereiding van bacterieel inoculum en inoculatie van het hoornvlies
- Bacteriecultuur en preparaat
- Kweek S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 en P. aeruginosa O1 op tryptische soja-agar (TSA) en incubeer bij 37 °C met steriel water in de incubator om de luchtvochtigheid op peil te houden.
- Oogst individuele kolonies en suspendeer in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Centrifugeer de suspensie eenmaal gedurende 5 minuten bij 5.000 × g om dode cellen en metabolische bijproducten te verwijderen.
- Resuspendeer de bacteriële pellet in PBS en pas de concentratie aan op ~10¹¹ CFU/ml om een hoge bacteriële belasting voor adhesiestudies te garanderen.
- Protocol voor inoculatie van het hoornvlies
- Breng eenmaal per uur gedurende 4 uur onder langdurige verdoving een aliquot van 5 μl van de bereide bacteriële suspensie aan op het hoornvliesoppervlak.
- Plaats de muizen op een lichte helling om afvloeiing te voorkomen en zorg voor een consistente blootstelling aan het inoculum.
- Herhaal de inoculatie met tussenpozen van een uur om aanhoudende bacteriële blootstelling na te bootsen die relevant is voor klinische infectiescenario's.
- Euthanasie na inoculatie en beoordeling van bacteriële hechting
- Dien na 4 uur een intraperitoneale injectie van ketamine (80-100 mg/kg) en xylazine (5-10 mg/kg) toe om diepe anesthesie te garanderen.
- Voer cervicale dislocatie uit om de muizen op humane wijze te euthanaseren.
- Reinig de ogen met behulp van een steriele tang met gebogen punt en houd strikte aseptische omstandigheden aan om besmetting te voorkomen.
- Spoel het oogoppervlak 5-6x af met steriel 2 ml PBS in een petrischaaltje door zachtjes te schudden om niet-aanhangende bacteriën grondig te verwijderen.
- Homogeniseer de ontkernde ogen in 1 ml steriel PBS met behulp van een mechanische weefselhomogenisator om consistent bacterieel herstel te garanderen en aseptische omstandigheden te handhaven om besmetting te voorkomen.
- Voer seriële zesvoudige verdunningen van het homogenaat uit in steriel PBS.
- Schotels van elke verdunning op TSA-platen en een nacht bij 37 °C incuberen om koloniegroei mogelijk te maken.
- Tel kolonievormende eenheden (CFU's) en druk de resultaten uit als log CFU per hoornvlies voor kwantitatieve vergelijking.
5. Immunohistochemie
- Euthanaseer muizen via cervicale dislocatie op dag 15 na de behandeling.
- Ontpit de ogen zorgvuldig en spoel eenmaal met PBS bij kamertemperatuur onder zachte rotatie.
- Fixeer de ontkernde ogen gedurende 1 uur in 2% paraformaldehyde (PFA) om de structurele integriteit te behouden
- Was de vaste ogen 3 x 10 minuten in 1 ml PBS onder zachte rotatie op kamertemperatuur.
- Volg het eerder beschreven protocol voor hoornvliesdissectie 21,22
- Ontleed de hoornvliezen in een 35 mm brede petrischaal gevuld met een minimale hoeveelheid PBS.
- Gebruik een tang met rechte rand om het ontkernde oog te stabiliseren en een chirurgische schaar om een kleine incisie te maken aan de achterkant van de wereldbol.
- Gebruik het kleine incisiepunt om voorzichtig 360° langs het achterste aspect te snijden.
- Gooi het netvlies, de oogzenuw, de lens, het irispigment en alle andere weefselstructuren van de muis weg die niet tot het hoornvlies behoren.
- Verwijder overtollig weefsel met een tang met rechte rand of door voorzichtig in te snijden met een chirurgische schaar om het hoornvlies intact te houden.
- Was de ontlede hoornvliezen 3 x 10 minuten in 1 ml PBS in microcentrifugebuisjes onder zachte rotatie bij kamertemperatuur.
- Incubeer de hoornvliezen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met continue rotatie in 1 ml blokkeeroplossing (3% BSA + Triton X-100 in PBS).
- Verbeter de weefselpermeabilisatie door hoornvliezen te incuberen in 1 ml 20% EDTA gedurende een extra uur onder dezelfde omstandigheden.
- Incubeer de hoornvliezen een nacht bij 4 °C met het primaire antilichaam konijn anti-β-Tubuline III onder zachte rotatie bij kamertemperatuur.
- Incubeer de weefsels de volgende dag met Alexa Fluor 488-geconjugeerd geitenanti-konijn IgG secundair antilichaam en DAPI voor nucleaire kleuring gedurende 2-3 uur bij 4 °C in het donker.
- Was de hoornvliezen 3 x 10 minuten met PBS onder zachte rotatie.
- Volg het eerder beschreven protocol voor platte montage van het hoornvlies21,22
- Monteer de gekleurde hoornvliezen plat op glazen objectglaasjes door het hoornvlies aan de rand van het objectglaasje te plaatsen om overtollig vocht te verwijderen.
- Plaats het hoornvlies terug in het midden van het microscoopglaasje met de epitheelzijde naar beneden gericht, in contact met het oppervlak van het objectglaasje.
- Maak vier rechte incisies (1-2 mm lang) van de omtrekrand naar het midden met behulp van een chirurgisch veermes om halve kwadranten te maken.
- Breng 20 μL mountant aan en plaats een glazen dekglaasje van 8 mm over het hoornvlies.
- Druk voorzichtig op het dekglaasje om eventuele luchtbellen te verwijderen en rimpels van het hoornvlies te voorkomen.
- Bewaar het monster bij kamertemperatuur in het donker om te drogen.
- Sluit de randen van het dekglaasje af met een doorzichtige nagelbeschermer om uitdroging aan de lucht te voorkomen en bewaar de dia's in het donker tot ze klaar zijn voor beeldvorming.
6. Beeldvorming
- Voer confocale microscopie uit met behulp van een rechtopstaande confocale microscoop met twee fotonen en een waterdipobjectief van 20x/1,00 NA.
- Plaats de plat gemonteerde monsters op de microscooptafel en stel de 20x/1.00 NA objectieflens voor wateronderdompeling in.
- Dim de kamerverlichting en bedek de microscoop met een ondoorzichtige zwarte doek om externe lichtinterferentie tijdens beeldvorming te minimaliseren.
- Visualiseer de hoornvlieszenuwen met behulp van het Alexa Fluor 488 nm laserkanaal en detecteer celkernen met behulp van het DAPI 405 nm laserkanaal.
- Stel de framegrootte in op 1.536 x 1.536, het gaatje op 1 Airy unit (AU) en de scansnelheid op 1,02 μs. Schakel bidirectioneel scannen in en pas 2x middeling toe.
- Pas de masterversterking aan (~750 V) en minimaliseer de intensiteit van het laservermogen om fotobleken en fototoxiciteit te voorkomen en tegelijkertijd een helder beeld vast te leggen.
- Voer Z-stack-beeldvorming uit om de volledige dikte van het hoornvlies vast te leggen. Stel het eerste brandpuntsvlak in op het voorste aspect en het laatste op het achterste aspect van de steekproef.
- Verkrijg Z-stacks met stapintervallen van 0,8 μm of 1,0 μm, waarbij in totaal ongeveer 60 - 80 stacks per monster worden vastgelegd.
- Beoordeling van de dichtheid van de nervus hoornvlies
- Analyseer de dichtheid van de hoornvlieszenuw met behulp van Imaris-software.
- Controleer de volledige afbeeldingsdikte door de volumeafmetingen te controleren.
- Schakel de optie voor volumerendering in om een 3D-reconstructie te genereren.
- Maak een projectie met maximale intensiteit om de Z-stack om te zetten in een 2D-weergave voor visualisatie en kwantificering.
- Beoordeel de dichtheid van de hoornvlieszenuw op een schaal van 0-10 door geblindeerde beoordelaars om een objectieve beoordeling te garanderen.
7. Statistische analyse
- Evalueer de gegevensdistributie met behulp van de Shapiro-Wilk- en Kolmogorov-Smirnov-tests.
- Als het merendeel van de gegevens een normale verdeling volgt, presenteer de resultaten dan als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
- Voor vergelijkingen tussen twee groepen, past u de t-test van Student toe en gebruikt u eenrichtings-ANOVA gevolgd door de meervoudige vergelijkingstest van Tukey voor analyses waarbij drie of meer groepen betrokken zijn.
- Beschouw een p-waarde < 0,05 statistisch significant.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Tenzij anders aangegeven, werden alle experimenten onafhankelijk uitgevoerd in drievoud, waarbij elke replicaat 3-4 muizen per groep bevatte.
Significante vermindering van de dichtheid van de nervus hoornvlies na behandeling met bupivacaïne
Om de impact van gerichte uitputting van de sensorische zenuw corneum systematisch te beoordelen, werd de dichtheid van de hoornvlieszenuw geëvalueerd met behulp van immunolabeling en confocale microscop...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Sensorische zenuwen van het hoornvlies spelen een cruciale rol bij het handhaven van de integriteit van het oogoppervlak, het reguleren van de epitheliale homeostase en het moduleren van immuunresponsen. Hoornvliesneuritis, gekenmerkt door zenuwdegeneratie en -ontsteking, wordt vaak waargenomen bij systemische aandoeningen zoals diabetes mellitus, waarbij chronische hyperglykemie bijdraagt aan perifere neuropathie, waaronder verlies van de hoornvlieszenuw. Studies hebben aangetoond dat d...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5% bupivacaine hydrochloride solution | Pfizer INC. USA | NDC 00409-1162-01 | |
| 30 G naald | Fabrikant: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS | 305106 | |
| 33 G small hub blunt naald (puntstijl 3) | Hamilton Company, Reno, NV, VS | 7803-05 | |
| 4',6-Diamidino-2-fenylindole, dihydrochloride | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | D1306 | |
| Bovine serum albumine | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS | A7906 | |
| C57BL/6J (Wild-Type) muizen | Jackson Laboratory | . 000664 | |
| Centrifuge rotator | The Lab Depot, Inc. (Dawsonville, GA, VS) | R2020 | |
| Clear Nail Protector | Wet and Wild | N/A | |
| Dissectiemicroscoop (SMZ-160-TLED Stereo (dissectie) Microscoop met trinocular poort) | Stellar Scientific (Baltimore, MD, VS) | 1.1002E+12 | |
| Ethylenediaminetetraazijnzuur | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS | E6511 | |
| GOAT anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | A-11008 | |
| Hamilton 10-μL spuit | Hamilton Company, Reno, NV, VS | 7635-01 | |
| High Precision Dissecting Micro Schaar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | 08-953-1B | |
| Isofluraan | Patterson Veterinary, VS | 07-890-8115 | |
| Isofluraan verdamper | Kent Scientific, VS | VETFLO1205S | |
| Ketamine Hydrochloride | Dechra Veterinary Products, Overland Park, KS, VS | DP00050 | |
| Kimwipe pluisvrij tissuepapier | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA, VS | 34155 | |
| Micro-dissectietang gebogen voorkant (voor enucleatie) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS | F4142-1EA | |
| Micro-dissectietang rechte voorkant | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS | F4017 | |
| Petrischalen (100 mm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | 263991 | |
| Petrischalen (35 mm) | Avantor, via VWR International (Radnor, PA, VS). | 25373-041 | |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, VS | C987D24 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | P36930 | |
| Konijn anti-β-Tubulin III | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) | T2200 | |
| Ronde Dekglas Duits Glas (8 mm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | 50-949-314 | |
| Schelphandgrepen | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) | S2896-1EA | |
| Microscoopglazen | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) | S8902-1PAK | |
| Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | 3453 | |
| Sorvall Instruments RT6000B Benchtop Centrifuge | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, VS | 3367898 | |
| Chirurgische verenbladen | World Precision Instruments (Sarasota, FL, VS) | 504169 | |
| Tryptische soja-agar | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS) | 22091 | |
| Xylazin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS | 1236-20-8 |
Referenties
- Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
- Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
- Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
- Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
- Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
- Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
- Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
- Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
- Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
- Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
- Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
- Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
- Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
- Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
- Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
- Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
- Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
- Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
- Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
- Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
- Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
- Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
- Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
- Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
- O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
- Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
- Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
- Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
- Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
